一種生物樣本中peg含量的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物樣本中PEG含量的測(cè)定方法。 一種基于高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-Q-T0F)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定樣本中不同聚合度PEG 含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚乙二醇（PEG)是一種pH中性，無毒，且具有獨(dú)特理化性質(zhì)和良好生物相容性的 親水高分子聚合物，也是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的極少數(shù)可以體內(nèi)注射的合成聚合物之一。當(dāng)PEG偶 聯(lián)到蛋白質(zhì)、多肽、小分子有機(jī)藥物或納米顆粒外殼上時(shí)，可以降低藥物制劑的免疫清除以 及腎臟的快速消除，延長藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，減小藥物的毒性。作為新型的藥用輔料，PEG 的質(zhì)量控制以及在體內(nèi)的吸收、分布與排泄過程對(duì)于PEG化藥物的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)具有十分重 要的意義。
[0003] 目前對(duì)于PEG的分析常采用放射性標(biāo)記法、比色法、Western Blot和高效液相色 譜法（HPLC)，但這些方法均存在明顯的不足。例如，放射性標(biāo)記法用于標(biāo)記PEG時(shí)成本太 高，且目前尚未建立成熟的方法學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)記效率，也沒有對(duì)比試驗(yàn)說明標(biāo)記后的PEG在體 內(nèi)的動(dòng)力學(xué)行為是否發(fā)生了變化；比色法和Western Blot法都不能得到精確的定量結(jié)果， 且后者是通過測(cè)定與PEG結(jié)合的抗體量來間接對(duì)PEG進(jìn)行定量。鑒于抗體的選擇性差，可 能和樣本中存在的內(nèi)源性干擾物質(zhì)結(jié)合，故不適合血漿或組織等復(fù)雜生物樣本中PEG的定 量分析；HPLC法采用折射率檢測(cè)器，分析時(shí)間長，且定量下限僅為50 mg/mL，不足以分析生 物體內(nèi)痕量的PEG水平。
[0004] 近年來，迅速發(fā)展的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS)憑借其在定量分析 方面的出色表現(xiàn)，為藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研宄提供了良好的解決方案。LC-MS/MS定量的流程 是：色譜分離、離子化、質(zhì)荷比（m/z)掃描、選擇特定m/z進(jìn)行定量。在眾多掃描方式中，三 重四級(jí)桿質(zhì)量分析器的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)選擇性好，靈敏度高，已經(jīng)成為LC-MS/MS 分析中最常用的定量方式。這種模式的定量思路是：離子化、第一個(gè)四級(jí)桿（Q1):選擇一個(gè) 特定的離子作為母離子，并只允許這一種離子通過、第二個(gè)四級(jí)桿（Q2):母離子被碰撞能量 打成碎片、第三個(gè)四級(jí)桿（Q3):從產(chǎn)生的碎片中選擇一個(gè)響應(yīng)高且穩(wěn)定的碎片作為子離子、 測(cè)定選擇的母子離子對(duì)的含量。所以這種模式必須在知道待測(cè)化合物母離子和子離子的準(zhǔn) 確m/z的前提下才能進(jìn)行。
[0005] 而PEG是由一系列以乙二醇為基本單元組成的高分子混合物，其分子量不是唯一 的值，而是以某個(gè)聚合度的分子量平均值為中心呈正態(tài)分布，如：PEG 4000其實(shí)是以分子 量4000的PEG分子為中心呈正態(tài)分布的多種分子量PEG分子的混合物；PEG600、PEG 6000、 PEG 10000也是如此，均為多種分子量PEG分子的混合物；因此這給以待測(cè)化合物目標(biāo)分子 量為基礎(chǔ)的LC-MS/MS定量分析帶來了極大的挑戰(zhàn)。
[0006] 對(duì)于PEG的質(zhì)譜定量分析，通常采用電噴霧離子源（ESI )，在ESI條件下，PEG的離 子化效率高，其長鏈易于帶電，但是其所帶電荷量不同，這使得本身聚合度就不相同的PEG 具有更多不同的m/z，所以PEG碎片的m/z更加不確定，難以用傳統(tǒng)的MRM掃描模式對(duì)PEG 進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。為此，人們也在嘗試著一些方法來解決這一難題。如有學(xué)者嘗試 利用離子源內(nèi)能量將不同聚合度PEG初步打碎成較大片段，并通過Q1選擇其中一個(gè)響應(yīng)較 高的片段作為母離子，再繼續(xù)按照MRM模式用產(chǎn)生的碎片進(jìn)行定量分析。該方法雖然能部 分實(shí)現(xiàn)PEG的LC-MS/MS定量分析，但是離子源內(nèi)產(chǎn)生的能量較低，比串聯(lián)質(zhì)譜碰撞室（Q2) 內(nèi)的碰撞能量至少低2個(gè)數(shù)量級(jí)，所以只能部分裂解PEG，且裂解位置不固定，裂解效率不 穩(wěn)定，可以產(chǎn)生若干種不同m/z的碎片，無論選擇哪個(gè)碎片作為母離子進(jìn)行定量，都不得不 忽略大部分其他m/z的碎片，其定量結(jié)果靈敏度、準(zhǔn)確性較低，線性差。另有學(xué)者對(duì)聚合度 較低的PEG 400進(jìn)行定量分析，針對(duì)其中豐度較高的9種不同分子量的PEG，對(duì)每個(gè)PEG都 利用MRM模式測(cè)定含量之后，再將它們的含量相加得到PEG 400的總體含量。但是在定量 前必須先測(cè)定每種聚合度的PEG占總量的比例才可完成定量，而且對(duì)每種成分都要單獨(dú)制 作標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作步驟相應(yīng)增加，造成定量準(zhǔn)確性降低。以上兩種方法均采用MRM模式，仍 需要利用Q1選擇母離子，沒有從根本上解決問題，還存在一些不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)生物樣本中PEG分子量的不唯一性，建立一種 操作簡便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性好的PEG定量測(cè)定方法。本發(fā)明的目的是 通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0008] -種生物樣本中PEG含量的測(cè)定方法，采用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜 (LC-Q-Q-T0F)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定步驟包括： A. 建立PEG測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線； B. 使用液相色譜_飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定待測(cè)樣品，通過步驟A所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè) 樣本中PEG濃度； 步驟A和步驟B的色譜條件和質(zhì)譜條件相同，其中質(zhì)譜條件基于三重串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，步 驟A和步驟B質(zhì)譜部分的設(shè)定為：第一個(gè)質(zhì)量分析器Q1中不選擇母離子，帶電粒子全部通 過后進(jìn)入第二個(gè)質(zhì)量分析器Q2 ;在第二個(gè)質(zhì)量分析器Q2中設(shè)置碰撞能量，將帶電粒子打碎 成碎片離子；在第三個(gè)質(zhì)量分析器飛行時(shí)間質(zhì)量分析器選取穩(wěn)定的特征碎片離子，來定量 PEG。
[0009] 進(jìn)一步的，所述特征碎片離子m/z為133. 083~133. 086。
[0010] 進(jìn)一步的，測(cè)定PEG 400~1000,所述質(zhì)譜操作部分解簇電壓為80 V，第二個(gè)質(zhì)量 分析器Q2中PEG的碰撞電壓為25 eV。
[0011] 進(jìn)一步的，測(cè)定PEG 1000~2000,所述質(zhì)譜操作部分解簇電壓為100 V，第二個(gè)質(zhì) 量分析器Q2中PEG的碰撞電壓為25 eV。
[0012] 進(jìn)一步的，測(cè)定PEG 2000~20000,所述質(zhì)譜操作部分解簇電壓為100 V，第二個(gè)質(zhì) 量分析器Q2中PEG的碰撞電壓為30 eV。
[0013] 進(jìn)一步的，測(cè)定方法中使用的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為辛伐他汀。
[0014] 進(jìn)一步的，步驟A和步驟B中所述質(zhì)譜條件為：正離子方式檢測(cè)；離子噴射電壓： 5500 V ;溫度：500° C ;氣簾氣體（CUR)氮?dú)鈮毫?5 psi ;氣體1氮?dú)鈮毫Γ℅S1)60 psi、氣 體2氮?dú)鈮毫Γ℅S2)50 psi ;PEG掃描方式為T0F-MS模式，掃描的m/z范圍為88. 0~178. 0。
[0015] 進(jìn)一步的，步驟A和步驟B中所述色譜條件為：流動(dòng)相為甲酸體積百分?jǐn)?shù)占0. 1% 的水和甲酸體積百分?jǐn)?shù)占0. 1%的乙腈，梯度洗脫，柱溫40° C ;流速：400 mL/min。
[0016] 進(jìn)一步的，所述步驟A具體操作程序?yàn)椋?1)制備內(nèi)標(biāo)溶液和不同濃度的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0017] 2)于抗吸附管中加入內(nèi)標(biāo)溶液、PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液及預(yù)冷的乙腈渦流混勻，離心后取上 清液進(jìn)樣到高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜中分析； 3)取不同濃度的PEG標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)程序2)操作，記錄色譜圖，PEG濃度為橫坐標(biāo)，PEG 色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)W=l/x2最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的 直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0018] 進(jìn)一步的，所述步驟B具體操作程序： 1)于抗吸附管中加入內(nèi)標(biāo)溶液、待測(cè)樣本溶液及預(yù)冷的乙腈渦流混勻，離心后取上清 液進(jìn)樣到高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜中分析； 2 )將程序1)中獲取的待測(cè)樣本PEG峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得PEG 濃度。
[0019] 本發(fā)明測(cè)定方法的原理是：通過改變液相色譜流動(dòng)相比例，將不同分子量范圍的 PEG從色譜柱上洗脫后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。采用T0F-MS模式，無需在Q1中選擇母離子，所有PEG 都直接進(jìn)入碰撞室（Q2)內(nèi)，通過碰撞誘導(dǎo)解離（CID)的方式，利用Q2內(nèi)的較大能量高效地 將PEG全部打碎，然后利用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（T0F)選擇不同聚合度PEG共同產(chǎn)生的的 響應(yīng)最高且穩(wěn)定的特征質(zhì)譜裂解碎片（理論上精確m/z為133. 08592, 3個(gè)乙二醇重復(fù)單元） 進(jìn)行定量，進(jìn)而建立一種操作簡