-cooh磁性納米材料修飾開管柱及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于色譜技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)組學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，對生物樣品的分析工具提出了較高的要求。電色譜分析結(jié)合了高效液相色譜的高選擇性和毛細(xì)管電泳的高效性，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于包括氨基酸、多肽和蛋白在內(nèi)的諸多生物樣品的分離分析方面。作為毛細(xì)管電色譜技術(shù)的核心之一，不同類型的色譜柱被開發(fā)，包括整體柱、填充柱和開管柱。在這些不同形式的色譜柱中，開管柱由于在制備過程中無氣泡產(chǎn)生、操作簡便、容易制作等優(yōu)點(diǎn)，受到人們的廣泛青睞。但是固定相有限以及相比和樣品容量低限制了開管柱在分離科學(xué)中的應(yīng)用。為了克服這些缺點(diǎn)，科學(xué)家不斷提出改進(jìn)方法，如溶膠-凝膠法、刻蝕法、多孔相涂層法和納米涂層法等。在這些方法中，納米涂層由于具有較高的比表面積，表現(xiàn)了優(yōu)于其他方法的分離效果。
[0003]在過去的二十幾年里，具有特殊物化性質(zhì)的納米材料在色譜分離研宄領(lǐng)域做出了巨大貢獻(xiàn)。包括碳納米材料、二氧化娃納米材料、金屬及金屬氧化物納米材料、聚合物納米材料等在內(nèi)的不同類型的納米材料被廣泛的應(yīng)用到電色譜分析中，并取到了良好的分離效果。磁性納米材料作為一種被廣泛研宄的納米材料，具有良好的水溶性、較高的生物相容性、比表面積大、突出的物化性質(zhì)，因此被廣泛地應(yīng)用在生物技術(shù)領(lǐng)域，包括蛋白的選擇性分離、核酸的提取，生物醫(yī)藥以及生物傳感等諸多方面。但是，關(guān)于磁性納米材料被應(yīng)用到分離科學(xué)領(lǐng)域，尤其是生物樣品分離方面的報(bào)道很少。聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)是具有水溶性的陽離子聚電解質(zhì)，在水溶液中攜帶大量的正電荷，近年來已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于色譜固定相的構(gòu)筑。許多納米材料通過與TODA之間強(qiáng)烈的靜電吸引作用，被成功的構(gòu)筑到毛細(xì)管表面形成一層半永久的色譜固定相，例如石墨烯、氧化石墨烯、環(huán)糊精修飾的納米金、納米二氧化娃等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱。本發(fā)明的開管柱表面含有大量負(fù)電荷，可以有效的抑制生物樣品的吸附，改善分離效果，提高了分離選擇性。
[0005]本發(fā)明另一目的在于提供一種上述Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱的制備方法。本發(fā)明首先制備得到羧基化的Fe3O4納米磁粒(Fe 304-C00HMNPs)，再將親水性Fe3O4-COOH MNPs通過靜電自組裝的方法涂覆到I3DDA修飾的開管柱上，得到表面含有大量羧基基團(tuán)和負(fù)電荷的開管柱，制備方法簡單，條件溫和。
[0006]本發(fā)明再一目的在于提供上述Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。特別適用于對氨基酸、多肽和酸性蛋白等生物樣品的電色譜分離，以及糖基化蛋白的檢測。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱，由包含以下步驟方法制備得到:(I)水熱法制備Fe3O4-COOH MNPs ； (2)將聚二烯丙基二甲基氯化銨(I3DDA)通過靜電自組裝固定在毛細(xì)管內(nèi)壁；(3)將Fe3O4-COOH MNPs通過靜電自組裝吸附在TODA表面，得到Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱G3DDAlgFe3O4-COOH MNPs開管柱)。
[0009]本發(fā)明的TODAOFe3O4-COOH MNPs開管柱表面含有大量的羧基基團(tuán)和負(fù)電荷，使被分離物質(zhì)與固定相之間存在親水性和靜電排斥作用，有效提高分離效率，其制備方法條件簡單、溫和。
[0010]所述Fe3O4-COOH MNPs由包含以下步驟方法達(dá)到:將三氯化鐵溶解于溶劑中，加入無水乙酸鈉和丙烯酸鈉混合均勻，傾入特氟龍高壓反應(yīng)釜中，升溫至180?200°C，反應(yīng)10 ?20h，得到 Fe3O4-COOH MNPs0
[0011]所述Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱，優(yōu)選由包含以下具體步驟的方法制備得到:
[0012](I)將三氯化鐵溶解于溶劑中，加入無水乙酸鈉和丙烯酸鈉混合均勻，傾入特氟龍高壓反應(yīng)釜中，升溫至180?200°C，反應(yīng)10?20h，得到Fe3O4-COOH MNPs ；
[0013](2)將聚二烯丙基二甲基氯化銨(I3DDA)溶于Tris-HCl緩沖液中得到TODA溶液，分散均勻，注入毛細(xì)管柱，室溫下保存10?20h，得到TODA開管柱；
[0014](3)將步驟⑴得到的Fe3O4-COOH MNPs配成水溶液，注入步驟⑵制備好的I3DDA開管柱中，加熱保存10?20h，得到Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱。
[0015]步驟⑴中所用三氯化鐵、無水乙酸鈉和丙烯酸鈉的摩爾比為(6?10): (50?60): (40 ?50)。
[0016]步驟(I)中所述的混合均勻優(yōu)選指通過加熱攪拌形成均一溶液，所述加熱攪拌優(yōu)選加熱至50?70°C以300?500r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，從而獲得均一溶液。
[0017]步驟(I)中所述將三氯化鐵溶解于溶劑中優(yōu)選在超聲輔助下溶解。
[0018]步驟(I)中所述反應(yīng)后的體系降溫后冷卻至室溫，可通過外加磁場分離，并用乙醇、去離子水依次多次洗滌，烘干，從而獲得純化后的Fe3O4-COOHMNPs。
[0019]步驟(I)中所述溶劑用于提供溶液反應(yīng)環(huán)境，因此本領(lǐng)域常規(guī)使用的溶劑即可，優(yōu)選為二甘醇或乙二醇。
[0020]步驟(I)反應(yīng)體系中所述三氯化鐵的濃度優(yōu)選為0.15?0.25mol/Lo
[0021]步驟(2)中所述Tris-HCl緩沖液優(yōu)選為pH 8.3的緩沖液。
[0022]步驟⑵中所述TODA溶液的濃度優(yōu)選為5?20mg/mL。
[0023]步驟(2)所述將TODA溶液注入毛細(xì)管柱的流速優(yōu)選為10?20 μ L/min。
[0024]步驟(2)中所述TODA溶液的離子強(qiáng)度優(yōu)選通過氯化鈉調(diào)節(jié)，更優(yōu)選溶液中氯化鈉濃度為0.5?1.5mol/Lo
[0025]步驟(2)中室溫保存后優(yōu)選對開管柱進(jìn)行沖水，以去除管內(nèi)多余的TODA溶液。
[0026]步驟(2)所述的毛細(xì)管優(yōu)選通過預(yù)處理。所述的預(yù)處理包括以10?20 μ L/min的流速依次沖I?2mol/L HCl I?2h，去離子水I?2h，I?2mol/L NaOH I?2h，去離子水2?4h，最后再?zèng)_20?40mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)緩沖液I?4h。
[0027]步驟(3)中所述Fe3O4-COOH MNPs的水溶液濃度優(yōu)選為7?15mg/mL。所用的Fe3O4-COOH MNPs優(yōu)選為2?3nm的納米粒子。
[0028]步驟(3)中所述將Fe3O4-COOH MNPs配成水溶液優(yōu)選將Fe3O4-COOH MNPs加入水中后超聲分散30?60min，使其溶液為均勻分散體系。
[0029]步驟(3)中所述注入的流速優(yōu)選為10?20 μ L/min。
[0030]步驟(3)中所述加熱保存優(yōu)選指加熱至30?50°C。
[0031]步驟(3)中加熱保存后優(yōu)選對開管柱進(jìn)行沖水，以去除管內(nèi)多余的Fe3O4-COOHMNPs水溶液，并優(yōu)選在40?50°C烘干開管柱。
[0032]本發(fā)明的Fe3O4-COOH磁性納米材料修飾開管柱可應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域中，特別適用于對氨基酸、多肽和酸性蛋白等生物樣品的電色譜分離，以及糖基化蛋白的檢測。其表面含有大量負(fù)電荷和羧基基團(tuán)，可以有效地抑制生物樣品的吸附，改善分離效果，提高分離選擇性。
[0033]本發(fā)明的機(jī)理為:
[0034]本發(fā)明的TODAOFe3O4-COOH MNPs開管柱，依賴于簡單實(shí)用的靜電自組裝方法完成開管柱的構(gòu)筑。首先通過水熱法合成粒徑分布均勻的Fe3O4-COOH MNPs，然后將得到的表面含有大量負(fù)電荷的Fe3O4-COOH MNPs固定到預(yù)先用I3DDA修飾的開管柱上，得到TODAOFe3O4-COOH MNPs開管柱，其表面含有大量負(fù)電荷和羧基基團(tuán)、未飽和的金屬離子，通過靜電作用和親水作用能夠有效地抑制生物樣品的吸附，改善分離效果，提高分離選擇性。
[0035]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0036](I)本發(fā)明的開管柱以羧基化磁粒作為色譜固定相，其表面豐富的羧基基團(tuán)使得涂層柱具有良好的親水性能和靜電作用，通過靜電排斥的作用有效抑制了對多肽以及蛋白的吸附，對酸性蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等生物樣品具有良好的分離效果。
[0037](2)本發(fā)明的開管柱制備條件溫和、操作簡便，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好。
[0038](3)本發(fā)明的開管柱有效地實(shí)現(xiàn)了氨基酸、二肽和酸性蛋白等生物樣品的分離，同時(shí)有效地檢驗(yàn)糖基化蛋白的微觀不均一性，能夠分離得到卵清蛋白的九種不同糖基化形式，并成功的應(yīng)用于雞蛋清中酸性蛋白的分離。
【附圖說明】
[0039]圖1為Fe3O4-COOH MNPs的TEM圖(A)、紅外譜圖(B)以及不同pH條件下的zeta電勢圖(C)。
[0040]圖2為氨基酸分離的毛細(xì)管電色譜譜圖:其中，I為DMF，2為色氨酸(tryptophan)，3 為酪氨酸(tyrosine)，4 為苯并氨酸(phenylalanine)。
[0041 ] 圖3為二肽分離的毛細(xì)管電色譜譜圖:其中，I為DMF，2為甘氨酸-色氨酸(glycyl-L-tryptophan hydrate)，3 為甘氨酸-酪氨酸(glycyl-L-tyrosine hydrate), 4為甘氨酸-苯丙氨酸(glycyl-L-phenylalanine hydrate)。
[0042]圖4為蛋白分離的毛細(xì)管電色譜譜圖:其中，I為伴清蛋白(conalbumin)，2為α-乳白蛋白(a-1actalbumin)，3為乳球蛋白(β-lactoglobulin)，4為牛血清白蛋白(bovine serum albumin)。
[0043]圖5為卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和真實(shí)樣品雞蛋清的對比，其中，曲線a為卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，曲線b為稀釋的雞蛋清。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0045]實(shí)施例1 TDDAOFe3O4-COOH MNPs開管柱的制備
[0046](I)Fe3O4-COOH MNPs的制備:將6mM的FeCl3.6Η20加入到40mL的二甘醇中超聲輔助溶解，然后加入55mM無水乙酸鈉和48mM丙烯酸鈉，在70 °C恒溫水浴中以500r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌Ih形成均一溶液，將該溶液傾入特氟龍高壓反應(yīng)釜中，放入烘箱，升溫至200°C，反應(yīng)10h，冷卻至室溫，將產(chǎn)物在外加磁場下分離并用去乙醇、去離子水依次各洗滌3次，50°C下烘干得到分散均勻的Fe3O4-COOH MNPs磁粒。
[0047](2)毛細(xì)管預(yù)處理:以10 μ L/min的流速依次沖lmol/L HCl Ih去除毛細(xì)管內(nèi)表面的有機(jī)物質(zhì)，去離子水Ih去除多余的HC1，lmol/L NaOH Ih刻蝕毛細(xì)管內(nèi)表面增大I3DDA的吸附，去離子水2h去除多余的NaOH，最后再?zèng)_20mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)緩沖液Ih保證預(yù)處理柱表面帶有較大量的負(fù)電性。
[0048](3) PDDA開管柱的制備:取PDDA溶解到Tris-HCl (pH 8.3)中得到濃度為20mg/mL的TODA溶液，分散均勻，然后以10 μ L/min的流速注入預(yù)處理好的毛細(xì)管柱內(nèi)，在室溫下保存20h。最后用去離子水去掉多余的TODA溶液。
[0049](4) PDDAiFe3O4-COOH MNPs