復(fù)雜樣品中6種磷脂的多重檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，尤其是涉及復(fù)雜生物樣品中多種磷脂組分的同時(shí)檢 測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)植物體內(nèi)磷脂種類繁多，多以磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺為主。受限于生物樣 品中復(fù)雜組分的干擾，磷脂組分的檢測(cè)，尤其是磷脂組分的多重檢測(cè)方法亟待開(kāi)發(fā)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，磷脂分析常用的方法有薄層色譜法（TLC)、高效液相色譜（HPLC)、質(zhì) 譜（MS)和氣質(zhì)聯(lián)用（C-MS)技術(shù)等。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，更為強(qiáng)大的LC-MS方法也用于 磷脂的定向定量分析中。檢測(cè)實(shí)踐中，高效液相色譜法（HPLC)仍然是目前磷脂分離和定性 定量分析的最常用的方法。HPLC分析磷脂常用檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（UV)和蒸發(fā)光散射檢 測(cè)器（ELSD)。這兩種檢測(cè)器中，ELSD的響應(yīng)信號(hào)獨(dú)立于分子中的雙鍵數(shù)目，也比UV檢測(cè)器 更為靈敏，并且ELSD在梯度洗脫程序中能提供穩(wěn)定的基線，因此，ELSD越來(lái)越多地用于磷 脂的高效液相色譜分析。
[0004] 用于磷脂檢測(cè)的色譜技術(shù)中，正相色譜主要基于頭部基團(tuán)極性大小分離不同種類 的磷脂；反相色譜分離磷脂主要基于磷脂上脂肪酸?；湹氖杷圆煌?，但是相比而言，后 者一般分離度較差，峰重合嚴(yán)重，因此應(yīng)用較少。在生物樣品等復(fù)雜樣品的磷脂成分分析實(shí) 踐中，正相色譜應(yīng)用較多，常用的流動(dòng)相一般分為兩類：氯仿-甲醇-水（氨水）體系和正 己烷-異丙醇-水體系。前者在檢測(cè)實(shí)踐中有較好的應(yīng)用，但是高效液相色譜儀中存在的 聚合物材質(zhì)的配件在氯仿中可能發(fā)生溶脹或收縮，影響機(jī)器的氣密性和使用壽命。而后一 體系多用于等度洗脫，但分離過(guò)程中往往存在分離時(shí)間長(zhǎng)，峰形擴(kuò)散嚴(yán)重，定量不穩(wěn)定等問(wèn) 題，需要配合更加優(yōu)化的技術(shù)方案來(lái)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)雜樣品中6種磷脂的多重檢測(cè)方法，該方法基于 HPLC技術(shù)，包括如下步驟：
[0006] (1)預(yù)制待測(cè)樣品；
[0007] (2)取檢測(cè)量的預(yù)制待測(cè)樣品，溶解于氯仿溶液，氮?dú)獯蹈珊缶_稱取殘余物質(zhì) 量，然后將殘余物溶于正己烷和異丙醇按照體積比3:1的混合溶劑中，0. 22 ym孔徑的有機(jī) 相濾膜過(guò)濾除雜；
[0008] (3) HPLC 分析：
[0009] 正相硅膠色譜柱，100mm X 4. 6mm，柱溫25 °C ;
[0010] 洗脫流速1. 5mL/min，按體積比，梯度洗脫的流動(dòng)相為：
[0011] 0.0 min, A 40%, B 57%, C 3% ；
[0012] 8. Omin, A 40%, B 50%, C 10% ；
[0013] 15. Omin, A 40%, B 50%, C 10% ；
[0014] 15. lmin, A 40%, B 57%, B 3%；
[0015] 24. Omin, A 40%, B 57%, C 3%；
[0016] 其中，流動(dòng)相A是含0.01~0.08% (體積百分含量）三乙胺的正己烷，流動(dòng)相B 是異丙醇，流動(dòng)相C是10~20%的乙酸溶液（體積百分含量）；
[0017] (4)對(duì)比相同條件下PE、PI、PS、PC、SM和LPC混合標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果判定樣品檢測(cè) 結(jié)果。
[0018] 本發(fā)明針對(duì)檢測(cè)實(shí)踐需求，并針對(duì)生物樣品等復(fù)雜樣品的磷脂組成含量分析特 點(diǎn)，提供了綜合優(yōu)化的基于整體硅膠柱的多重磷脂同時(shí)檢測(cè)方案。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、 快速準(zhǔn)確、各組分分離良好、重復(fù)性高，易于檢測(cè)實(shí)踐中應(yīng)用推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 本發(fā)明附圖5幅：
[0020] 圖1是磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021] 圖2是六種磷脂混合標(biāo)品的HPLC-ELSD多重檢測(cè)圖譜。
[0022] 圖3是仿刺參性腺磷脂的HPLC-ELSD多重檢測(cè)圖譜。
[0023] 圖4是魚腦磷脂的HPLC-ELSD多重檢測(cè)圖譜。
[0024] 圖5是雞腦磷脂多重檢測(cè)的HPLC-ELSD圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明提供一種復(fù)雜樣品中的磷脂酰乙醇胺（PE)，磷脂酰肌醇（PI)，磷脂酰絲氨 酸（PS)，磷脂酰膽堿（PC)，鞘磷脂（SM)和溶血磷脂酰膽堿（LPC)六種磷脂進(jìn)行快速分離及 多重檢測(cè)方法。該方法基于高效液相色譜法（HPLC)，并針對(duì)檢測(cè)目標(biāo)樣本特點(diǎn)綜合優(yōu)化。
[0026] 所述多重檢測(cè)方法的【具體實(shí)施方式】中，所述的步驟（3)中HPLC流動(dòng)相中，流動(dòng)相 A是含0. 04%三乙胺的正己烷，流動(dòng)相B是異丙醇，流動(dòng)相C是13%的乙酸溶液。
[0027] 所另一【具體實(shí)施方式】中，所述的步驟（3)中HPLC分析配合蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD) 進(jìn)行檢測(cè)，分流模式，以空氣作為霧化氣，霧化氣流速1. 0~2. OL/min;漂移管溫度40~ 50°C。更優(yōu)選發(fā)光檢測(cè)器霧化氣流速1. 7L/min ;漂移管溫度45°C。
[0028] 更為具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明選用日立LaChrom Elite系列高效液相色譜儀，搭 配Alltech2000蒸發(fā)光檢測(cè)器；色譜柱則選用Chroniolith? Performance-Si型正相硅膠色 譜柱（100mm X 4. 6mm)〇
[0029] 本發(fā)明的上述檢測(cè)方法應(yīng)用于檢測(cè)實(shí)踐中，多用于針對(duì)動(dòng)物組織等復(fù)雜生物樣品 的檢測(cè)，【具體實(shí)施方式】中包括預(yù)制待測(cè)樣品的步驟，一般包括提取樣品總脂及去除其中的 中性脂、糖脂和色素的步驟。本發(fā)明針對(duì)動(dòng)物腦組織、性腺組織等待檢樣品，提供一種簡(jiǎn)單 便捷，并且處理后樣品與后續(xù)檢測(cè)過(guò)程契合度高的樣品預(yù)置方法，包括如下步驟：
[0030] a.取待測(cè)樣品組織勻衆(zhòng)，按lg/lml比例與氯仿-甲醇（2:1，v/v)溶劑混合，攪拌， 靜置十分鐘后抽濾，收集濾液，脫水旋干得樣品總脂；
[0031] b.樣品總脂溶于少量氯仿進(jìn)行硅膠柱層析，4~6倍柱體積的氯仿洗脫中性脂， 2~4倍柱體積丙酮洗脫糖脂和色素，然后用甲醇洗脫；
[0032] c.甲醇洗脫組分溶于氯仿，-20°C冷凍保存，即得預(yù)制待測(cè)樣品。
[0033] 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，上述本發(fā)明的具體和/或優(yōu)選的實(shí)施方式可以適當(dāng)組 合，以獲得包含這些優(yōu)選技術(shù)特征的方案，如本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方式之一，是復(fù)雜樣品中6 種磷脂的多重檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0034] (1)預(yù)制待測(cè)樣品：
[0035] a.取待測(cè)動(dòng)物組織樣品組織勻衆(zhòng)，按lg/lml比例與氯仿-甲醇（2:1，v/v)溶劑混 合，攪拌，靜置十分鐘后抽濾，收集濾液，脫水旋干得樣品總脂；
[0036] b.樣品總脂溶于少量氯仿進(jìn)行硅膠柱層析，4~6倍柱體積的氯仿洗脫中性脂， 2~4倍柱體積丙酮洗脫糖脂和色素，然后用甲醇洗脫；
[0037] c.甲醇洗脫組分溶于氯仿，-20°C冷凍保存，即得預(yù)制待測(cè)樣品；
[0038] (2)取檢測(cè)量的預(yù)制待測(cè)樣品，溶解于氯仿溶液，氮?dú)獯蹈珊缶_稱取殘余物質(zhì) 量，然后將殘余物溶于正己烷和異丙醇按照體積比3:1的混合溶劑中，0. 22 ym孔徑的有機(jī) 相濾膜過(guò)濾除雜；
[0039] (3) HPLC 分析：
[0040] 日立LaChrom Elite系列高效液相色譜儀；
[0041] Alltech2000蒸發(fā)光檢測(cè)器，分流模式，以空氣作為霧化氣，霧化氣流速1. 7L/ min ;漂移管溫度45°C ;
[0042] Chromolith?Performance-Si 型正相硅膠色譜柱，100mmX4. 6mm，柱溫 25°C ;
[0043] 洗脫流速1. 5mL/min，按體積比，梯度洗脫的流動(dòng)相為：
[0044] 0.0 min, A 40%, B 57%, C 3%；
[0045] 8. Omin, A 40%, B 50%, C 10%；
[0046] 15. Omin, A 40%, B 50%, C 10%；
[0047] 15. lmin, A 40%, B 57%, B 3%；
[0048] 24. Omin, A 40%, B 57%, C 3%；
[0049] 其中，流動(dòng)相A是含0. 04%三乙胺的正己烷，流動(dòng)相B是異丙醇，流動(dòng)相C是13% 的乙酸溶液；
[0050] (4)對(duì)比相同條件下PE、PI、PS、PC、SM和LPC標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果判定樣品檢測(cè)結(jié)果， 標(biāo)準(zhǔn)品濃度0. 6-1. 0mg/mL。
[0051] 以下為本發(fā)明的具體實(shí)施例，這些實(shí)施例僅為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，不應(yīng)當(dāng)理解為 對(duì)本發(fā)明任何形式的限制。
[0052] 實(shí)施例1.標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
[0053] (1)標(biāo)準(zhǔn)樣品：PE(P7943)、PI (P2517)、PS(P7769)、PC(P3556)、SM(S0756)和 LPC(L0906)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 Sigma-Aldrich。
[0054] (2) HPLC-ELSD 分析方法：
[0055] 日立LaChrom Elite系列高效液相色譜儀；
[0056] Alltech2000蒸發(fā)光檢測(cè)器，分流模式，以空氣作為霧化氣，霧化氣流速1. 7L/ min ;漂移管溫度45°C ;
[0057] Chromoli