一種益心復脈顆粒中黃芪甲苷含量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中藥制劑中有效成分的含量測定方法，特別涉及一種益心復脈顆粒中黃芪甲苷含量測定方法，所述方法，包括如下步驟：對照品溶液的制備：取黃芪甲苷對照品適量，加入含水甲醇或流動相制成含有黃芪甲苷0.16～0.24mg1/ml的溶液即可；供試品溶液的制備：取益心復脈顆粒，用濃度為2～5％堿水溶液提取，提取液過固相萃取柱，用甲醇洗脫即可；測定法：將上述對照品溶液和對照品溶液各5～20μl注入高效液相色譜儀中。
【專利說明】
一種益心復脈顆粒中黃芪甲苷含量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥制劑中有效成分的含量測定方法，特別涉及一種益心復脈顆 粒中黃芪甲苷含量測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 益心復脈顆粒是天津天士力（遼寧）制藥有限責任公司出品的藥品，其功能主治 為益氣養(yǎng)陰，活血復脈；用于氣陰兩虛，心血內(nèi)阻，胸痹心痛，胸悶不舒，心悸脈結(jié)代。具有載 藥量高、起效快、無異味、攜帶方便等特性。益心復脈顆粒是由生曬參、黃芪、麥冬、五味子、 丹參、川芎6味藥材組成的復方制劑，其中
[0003] 生曬參：具有大補元氣，益血，養(yǎng)心安神的作用。生曬參能提高腦、體力活動能力和 免疫功能，增強抗應(yīng)激、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、益心、復脈、安神生津、補肺健脾。
[0004] 麥冬：具有甘寒清潤，善清心肺之熱而養(yǎng)陰除煩，兼可清潤胃腸而止渴潤燥。抗實 驗性心律失常、增加冠脈流量。
[0005] 五味子：是一種具有辛、甘、酸、苦、咸五種藥性。選用傳統(tǒng)正品北五味入藥，品質(zhì)優(yōu) 良。收斂固澀，益氣生津，補腎寧心。用于久嗽虛喘，夢遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗， 盜汗，津傷口渴，短氣脈虛，內(nèi)熱消渴，心悸失眠。
[0006] 黃芪：有補氣升陽、生血行滯之力，現(xiàn)在藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪還可清除氧自由基，減 輕機體脂質(zhì)過氧化損傷。
[0007] 丹參：有活血祛瘀之功，不僅可以抑制血小板聚集，抑制血栓形成而且所含丹參素 還可抑制膽固醇的合成、抗細胞氧化。
[0008] 川；：活血行氣，祛風止痛?？商岣哐“逯衏AMP含量，降低TXA2活性；降低血小 板表面活性、抑制血小板聚集、使已聚集血小板解聚。
[0009] 益心復脈顆粒的藥物活性成分很多，主要包括：黃芪甲苷，川芎嗪，三七皂苷，丹參 酬等。
[0010] 由于活性成分眾多，因此需要靈敏的檢測方法對益心復脈顆粒的活性成分進行 檢測，但現(xiàn)有檢測方法僅包含性狀、2個顯色鑒別及檢查項下的相關(guān)檢測項，未進行藥材的 定性或定量檢測，不能全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量狀況，本發(fā)明針對君藥黃芪建立了產(chǎn)品中黃芪 甲苷含量測定的方法，填補了益心復脈顆粒定量控制的空白，使得對該產(chǎn)品能夠進行更有 效的質(zhì)量分析，更全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量狀況，保證該產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性，同時該方法節(jié)約檢 測成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明涉及的一種測定益心復脈顆粒中黃芪甲苷含量的方法，該方法采用高效液 相色譜法，包括如下步驟：
[0012] 步驟1，對照品溶液的制備：取黃芪甲苷對照品適量，加入含水甲醇或流動相制成 含有黃芪甲苷〇. 16~0. 24mgl/ml的溶液即可。
[0013] 步驟2,供試品溶液的制備：取益心復脈顆粒，用濃度為2~5%堿水溶液提取，提 取液過固相萃取柱，用甲醇洗脫即可。
[0014] 步驟3,測定法：將上述對照品溶液和對照品溶液各5~20 μ 1注入高效液相色譜 儀中。
[0015] 其中，步驟（1)中，所述的含水甲醇為50~100%的甲醇，優(yōu)選60~80%，最優(yōu)選 70%甲醇。流動相為：乙腈：水=31~36 :69~64。
[0016] 其中，步驟（2)中，所述的堿水溶液為氨水，碳酸氫鈉中一種。優(yōu)選氨水。步驟（2) 中所述的固相萃取柱填料為C18或PLS (聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物），優(yōu)選C18。步驟 (2)中所述的堿水溶液提取是超聲提取，提取液離心即可。
[0017] 優(yōu)選的步驟（2)的步驟如下：取益心復脈顆粒，精密加3 - 7倍量3~5%氨水，超 聲處理20~40分鐘使充分溶散，離心，精密移取上清液，以0. 5~1. 5ml/min的速度通過 已處理好的C18固相萃取小柱，水洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇洗脫至量瓶中，即得。
[0018] 步驟（3)中所述的高效液相色譜儀色譜條件：
[0019] 蒸發(fā)光散射檢測器：包括增益值：50~200 ;漂移管溫度：40~60°C ;霧化室溫度 設(shè)置：冷卻cooling ;氣體壓力：20~30psi ;秒采點數(shù)：1~10 ;
[0020] 色譜柱：C - 18 ;
[0021] 流動相：乙腈：水=31~36 :69~64 ;
[0022] 柱溫：35 ~42°C ;
[0023] 流速：0· 8 ~1. 5ml/min。
[0024] 除步驟1，2外，本發(fā)明還可以包括陰性樣品溶液的制備步驟，方法為按益心復脈 顆粒處方配比，取除黃芪的各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品， 再按步驟（2)供試品溶液制備方法，制成陰性樣品溶液，按照步驟3注入色譜儀。
[0025] 優(yōu)選的本發(fā)明所述的測定方法，包括如下步驟：
[0026] (1)對照品溶液的制備：取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每 lml含黃苗甲苷0· 20mg，即得；
[0027] (2)供試品溶液的制備：取益心復脈，精密稱定，至50ml錐形瓶中，精密加5倍量 4%氨水，超聲處理25分鐘使充分溶散，離心，精密移取上清液，以lml/min的速度通過已處 理好的C18固相萃取小柱，用水洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇緩慢洗脫至量瓶中，加甲醇稀 釋至刻度搖勻，即得。
[0028] (3)，陰性樣品溶液的制備，按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的各味藥材，按益 心復脈顆粒制法制備不含黃芪的陰性樣品，再按步驟（2)供試品溶液制備方法，制成陰性 樣品溶液。
[0029] (4)，注入液相色譜儀，其色譜條件為：色譜柱C18,4.6X150mm，3.5ym或 4· 6X 250mm，5 μ m ;流動相：乙腈：水=35 :65 ;柱溫：40 °C ;流速：1.0ml/min ;進樣量： 10 μ 1 ;蒸發(fā)光散射檢測器條件：增益值：1〇〇 ;漂移管溫度：50°C ;霧化室溫度設(shè)置：冷卻 cooling ;氣體壓力：30psi ;秒采點數(shù)：2。
[0030] 試驗例
[0031] 本發(fā)明優(yōu)選的所用的儀器與材料如下：
[0032] 1、高效液相色譜儀：美國 WatersHPLC - 2695 - 2424, Empower 工作站。
[0033] 2、色譜柱
[0034] ①反相色譜柱，適合于低PH值色譜柱，固定相以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料， Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 X 150mm，3.5 μ m);
[0035] ②反相色譜柱，通用性寬ΡΗ值色譜柱，固定相以純度高達99. 999%的高純硅膠為 填料，OmniBond HPLC Column Orca C18 (4.6 X 250mm，5 μ m);
[0036] ③反相色譜柱，適合于低PH值色譜柱，固定相以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料， Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 X 250mm，5 μ m);
[0037] 3、試劑：乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）。
[0038] 甲醇（分析純，天津市康科德科技有限公司）。
[0039] 4、對照品：黃芪甲苷（中國藥品生物制品檢定所，批號：110781 -201314,含量測定 用）。
[0040] 5、樣品：益心復脈顆粒，天津天士力（遼寧）制藥有限責任公司，編號（或批號）： 試驗 1、試驗 2、試驗 3、20130205、20130304。
[0041] 本發(fā)明優(yōu)選的實驗方法、色譜條件和溶劑提取方法，是經(jīng)過篩選得到的，篩選過程 如下：
[0042] 益心復脈顆粒的處方及制法
[0043] 本發(fā)明的益心復脈顆粒處方如下：生曬參75 -225g、黃芪75 -225g、麥冬75 -225g、 五味子50 - 150g、丹參100 - 300g、川芎50 - 150g和適量輔料制成。
[0044] 優(yōu)選的益心復脈顆粒的制備如下：
[0045] 【處方】生曬參150g黃芪150g麥冬150g五味子100g丹參200g川芎100g
[0046] 【制法】以上6味藥材，加水煎煮2次，第一次加水10倍量，煎煮2小時，第二 次加水8倍量，煎煮1小時，合并煎煮液，靜置12小時，吸取上清液，濃縮至相對密度 1. 20-1. 30 (80°C測）的清膏，加入1 %的甜葉菊甙，混合均勻，取清膏1份，加入糊精1份，干 燥，粉碎，過60目篩，加入乳糖2份，混勻，制成600g，分裝，即得。
[0047] 試驗例1流動相的選擇；
[0048] 按照實施例1的分離黃芪甲苷的液相色譜條件進行的考察，在滿足分離度要求的 前提下，按照表1調(diào)整流動相的比例，流動相：乙腈：水=31 - 36 :69 - 64,色譜圖如圖1、圖 2、 圖3、圖4和圖5所示。優(yōu)選A% : B% =乙腈：水（35 :65)流動相條件下，黃芪甲苷與相 鄰雜質(zhì)峰的分離度最優(yōu)，分析時長為20min。
[0049] 表1流動相的比例
[0050]
[0051]
[0052] 試驗例2色譜柱的選擇
[0053] 分別取下述色譜柱按照實施例的方法測定。
[0054] ① Agilent ZORBAX SB - C18(4. 6X150mm，3. 5 μπι);
[0055] ② OmniBond HPLC Column Orca C18(4· 6X250mm，5 μm);
[0056] ③：Agilent ZORBAX SB - C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m)，
[0057] 色譜圖如圖6、圖7和圖8所示。
[0058] 分析圖6 -圖8,比較與相鄰色譜峰的分離度及保留時間，可見圖7最優(yōu)，故選 Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6 X 150mm，3.5 μ m)作為方法測定的色譜柱。
[0059] 實施例3提取溶劑及方法考察
[0060] 方法①
[0061] 取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，置50ml錐形瓶中，精密加入15ml4%氨水， 密封，超聲處理（功率120W，頻率40KHZ) 20 - 25分鐘使充分溶散，放冷，搖勻，離心（3000 轉(zhuǎn)，10min)，精密移取上清液10ml，以lml/min的速度通過已處理好的C 1S固相萃取小柱 (500mg，先以甲醇5ml洗脫，再以水5ml洗脫）用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩 慢洗脫至2ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。此供試品處理方法測得黃芪甲苷 的含量為：〇. 1947mg/g色譜圖如圖9所示。
[0062] 方法②
[0063] 精密稱取益心復脈顆粒2. 5g，分別置50ml三角瓶中，加入表2中所示的甲醇溶液 各25ml，密封，超聲提取30分鐘，放冷，過濾，回收甲醇，殘渣用2ml甲醇定容，即得。結(jié)果分 別為色譜圖如圖11、圖12、圖13和圖14所示。
[0064] 表2甲醇溶度
[0065]
[0066]方法 @
[0067] 精密稱取益心復脈顆粒2. 5g，置錐形瓶中，精密加甲醇50ml，超聲30min。濾過，水 浴蒸干，殘渣加水20ml使溶解，水液用水飽和的正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液， 用氨試液洗滌3次，每次20ml，棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，定量轉(zhuǎn)移 至2ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，即得，此方法 測得黃芪甲苷的含量為：〇. 〇482mg/g。色譜圖如圖15所示。
[0068] 方法④
[0069] 取益心復脈顆粒適量，研細，取3g，精密稱定，加甲醇50ml，超聲30分鐘，置水浴上 蒸干，殘渣加水40ml使溶散，用乙酸乙酯提取2次，每次40ml，棄去乙酸乙酯液，水液用飽 和的正丁醇提取4次，每次30ml合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次50ml，再用水洗滌 2次，每次50ml，取正丁醇液蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，置2ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻 度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，此方法測得黃芪甲苷的含量為：〇.〇627mg/g。色譜圖如圖 16所示。
[0070] 方法⑤
[0071] 精密稱取益心復脈顆粒5g，加水40ml，超聲溶解，精密吸取20ml，置分液漏斗中， 用水飽和的正丁醇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次20ml，正丁 醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解置5ml容量瓶中，作為供試品溶液，此方法測定黃芪甲苷的含量 為：0· 1259mg/g。色譜圖如圖17所示。
[0072] 綜合比較上述5種供試品處理方法結(jié)果見表3,我們發(fā)現(xiàn)供試品制備方法①測得 的黃芪甲苷的含量最高，故在以后的研究中將此供試品處理方法作為益心復脈顆粒黃芪甲 苷含量測定的供試品處理方法。
[0073] 表3,不同方法的黃苗甲苷含量值
[0074]
[0075] 試驗例4堿水的選擇
[0076] 按照實施例1的方法，堿水條件按照表4處理，結(jié)果如下：
[0077] 表4,不同種類及濃度堿水處理的黃芪甲苷含量值
[0078]
[0079] 結(jié)果表明，2 - 5%的m7K、5%候酸S鋼提取雙呆牧奸，優(yōu)選4%氨水。
[0080] 試驗例5不同固相萃取柱原料對黃芪甲苷含量值的影響
[0081] 按照實施例1的方法，固相萃取柱按照表5處理，結(jié)果如下：
[0082] 表5,不同固相萃取柱的黃苗甲苷含量值
[0083]

[0084] 結(jié)果表明，C18固相萃取小柱和LS萃取小柱處理后的黃芪甲苷含量值高，優(yōu)選C18 固相萃取小柱。
[0085] 試驗例6益心復脈顆粒中黃芪甲苷含量測定的方法學考察
[0086] 1、標準曲線的制備
[0087] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70 %甲醇分別制成每1ml含黃芪甲苷 0· 007988、0· 01997、0· 03994、0· 07988、0· 15976mg 的系列溶液，分別精密進樣 20 μ 1，注入 液相色譜儀，按優(yōu)選方案步驟4的色譜條件進行分析，測定各自峰面積，以對照品濃度的對 數(shù)為橫坐標，峰面積值的對數(shù)為縱坐標，求得回歸方程：黃芪甲苷Υ = 1. 4203Χ+6. 907, r = 0. 9993。結(jié)果表明黃芪甲苷在0. 07616~0. 7616mg/ml范圍內(nèi)線性良好，結(jié)果見表6,線性 圖譜見圖18。
[0088] 表6黃芪甲苷標準曲線
[0089]
[0090] 2、進樣精密度試驗
[0091] 取黃芪甲苷對照品，按照優(yōu)選方案步驟1對照品溶液制備操作，按優(yōu)選方案步驟 4的色譜條件進行分析，連續(xù)進樣6次，測定黃芪甲苷峰面積，測得峰面積平均值分別為 797256,峰面積的RSD分別為1. 6%，符合要求，結(jié)果見表7,圖譜見圖19。
[0092] 表7進樣精密度試驗
[0093]
[0094] 3、重復性試驗
[0095] 取同一批（編號：試驗3)樣品，制備低、中、高3種濃度的供試品溶液，濃度范圍 為75 %~125 %，共9份，，按照優(yōu)選方案步驟2供試品溶液制備操作，按優(yōu)選方案步驟4的 色譜條件進行分析，測定每份樣品中黃芪甲苷的含量。結(jié)果樣品中黃芪甲苷平均含量為 0. 1907mg/g，RSD分別為2. 4%，重復性良好，結(jié)果見表8,圖譜見圖20。
[0096] 表8重復性試驗
[0097]
[0098] 4、穩(wěn)定性試驗
[0099] 取同一批（編號：試驗3)樣品，取1份，精密稱定3.0g，按照優(yōu)選方案步驟2供試 品溶液制備操作，按優(yōu)選方案步驟4的色譜條件進行分析，分別在0、2、4、6、10、14、18、20及 24小時，測定樣品中黃芪甲苷峰面積，測得峰面積值的RSD分別為1. 8%，結(jié)果表明供試品 溶液在24小時內(nèi)測定穩(wěn)定，結(jié)果見表9,圖譜見圖21。
[0100] 表9穩(wěn)定性試驗
[0101]
[0102] 5、回收率試驗
[0103] 取同一批（編號：試驗3)樣品，取供試品稱樣量的1/2,精密稱定9份，分別加入 對照品（溶液）適量，按照優(yōu)選方案步驟2供試品溶液制備操作3個不同濃度的含相應(yīng)對 照品的供試品溶液（以供試品溶液所含待測成分的濃度為1〇〇%，3個不同濃度為75%~ 125% )，每個濃度制備3份供試品溶液，按優(yōu)選方案步驟4的色譜條件進行分析，計算回收 率，結(jié)果黃芪甲苷平均回收率為102. 8%，RSD分別為4. 0%，結(jié)果見表10,圖譜見圖22,回 收率試驗符合要求。
[0104] 表10益心復脈顆粒中黃芪甲苷回收率試驗
[0105]
[0106]
[0107] 6、耐用性試驗
[0108] 取同一批（編號：試驗3)樣品，按照優(yōu)選方案步驟2供試品溶液制備操作，分別用 Agilent ZORBAX C- 18 (4.6 X 250mm，3.5 μ m) ;OmniBondhubble C- 18(5 μ m 4.6 X 250mm) 色譜柱，按優(yōu)選方案步驟4的色譜條件進行分析，測定樣品中黃芪甲苷含量，結(jié)果見表11， 圖譜見圖23和圖24。測定結(jié)果顯示，不同品牌色譜柱對含量測定的結(jié)果無影響。
[0109] 表11不同色譜柱對含量測定的影響
[0110]
[0111] 7、理論板數(shù)的確定
[0112] 綜合考慮益心復脈顆粒2種不同色譜柱的分離情況及理論塔板數(shù)結(jié)果，見表，將 黃芪甲苷的理論板數(shù)規(guī)定為不得低于5000。
[0113] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明建立的液相色譜測定益心復脈顆粒中黃芪甲苷含量的 方法，符合方法學驗證的要求，并操作簡便，靈敏度高，測定準確，適用性強，能夠用于對該 產(chǎn)品的質(zhì)量控制。同時，填補了該產(chǎn)品定量控制的空白，使得對該產(chǎn)品能夠進行更有效的質(zhì) 量分析，更全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量狀況，保證該產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。
【附圖說明】
[0114] 圖1 A% : B% =乙腈冰（31 :69)色譜圖
[0115] 圖2 A% : B% =乙腈：水（33 :67)色譜圖
[0116] 圖3 A% : B% =乙腈：水（34 :66)色譜圖
[0117] 圖4 A% : B% =乙腈：水（35 :65)色譜圖
[0118] 圖5 A% : B% =乙腈：水（36 :64)色譜圖
[0119] 圖 6 OmniBond HPLC Column Orca C18 米集色譜圖
[0120] 圖 7 Agilent ZORBAX SB - C18 (4. 6 X 150mm，3. 5 μ m)采集色譜圖
[0121] 圖 8 Agilent ZORBAX SB - C18(4. 6 X 250mm，5 μ m)采集色譜圖
[0122] 圖9供試品處理①所得色譜圖
[0123] 圖10供試品處理③100%甲醇所得色譜圖
[0124] 圖11供試品處理③90 %甲醇所得色譜圖
[0125] 圖12供試品處理③80 %甲醇所得色譜圖
[0126] 圖13供試品處理③70%甲醇所得色譜圖
[0127] 圖14供試品處理④色譜圖
[0128] 圖15供試品處理⑤色譜圖
[0129] 圖16供試品處理⑥色譜圖
[0130] 圖17線性圖譜
[0131] 圖18進樣精密度圖譜
[0132] 圖19重復性圖譜
[0133] 圖20穩(wěn)定性圖譜
[0134] 圖21黃芪甲苷回收率圖譜
[0135] 圖 22 Agilent ZORBAX C - 18 色譜柱譜圖
[0136] 圖 23 OmniBond Hubble C - 18 色譜柱譜圖
[0137] 圖24試驗3樣品色譜圖
[0138] 圖25試驗1樣品色譜圖
[0139] 圖26試驗2樣品色譜圖
[0140] 圖27批號20130205樣品色譜圖
[0141] 圖28批號20130304樣品色譜圖
【具體實施方式】
[0142] 以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
[0143] 實施例1取編號為試驗3的益心復脈顆粒，測定其黃芪甲苷的含量
[0144] 步驟1，對照品洛液的制備
[0145] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0. 20mg即 得。
[0146] 步驟2,供試品溶液的制備，方法如下：取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，至50ml 錐形瓶中，精密加4%氨水15ml，超聲處理25分鐘使充分溶散，離心（3000轉(zhuǎn)、lOmin)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通過已處理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脫，再以水5ml洗脫），用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩慢洗脫至2ml量 瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。
[0147] 步驟3,陰性樣品溶液的制備，方法如下：按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的 各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品，再按步驟2供試品溶液制 備方法，制成陰性樣品溶液。
[0148] 步驟4,注入液相色譜儀，計算黃芪甲苷含量，方法如下：采用液相色譜法，其色譜 條件為：C - 18色譜柱；流動相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱溫：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;進樣量：10 - 20 μ 1。檢測器條件：增益值：100 ;漂移管溫度：50°C ;霧化室溫度設(shè)置： cooling ;氣體壓力：30psi ;秒采點數(shù)：2。
[0149] 測得每g益心復脈顆粒中黃芪甲苷的含量為0. 1907mg，結(jié)果見圖24。
[0150] 實施例2取編號為試驗1的益心復脈顆粒，測定其黃芪甲苷的含量
[0151] 步驟1，對照品溶液的制備
[0152] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含黃芪甲苷 0· 16 - 0· 24mg 即得。
[0153] 步驟2,供試品溶液的制備，方法如下：取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，至50ml 錐形瓶中，精密加4%氨水15ml，超聲處理25分鐘使充分溶散，離心（3000轉(zhuǎn)、lOmin)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通過已處理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脫，再以水5ml洗脫），用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩慢洗脫至2ml量 瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。
[0154] 步驟3,陰性樣品溶液的制備，方法如下：按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的 各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品，再按步驟2供試品溶液制 備方法，制成陰性樣品溶液。
[0155] 步驟4,注入液相色譜儀，計算黃芪甲苷含量，方法如下：采用液相色譜法，其色 譜條件為：C - 18色譜柱；流動相：A% : B% =乙腈：水（35 :65);柱溫：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;進樣量：10 - 20 μ 1。檢測器條件：增益值：100 ;漂移管溫度：50°C ;霧化室溫度設(shè)置： cooling ;氣體壓力：30psi ;秒采點數(shù)：2。
[0156] 測得每g益心復脈顆粒中黃芪甲苷的含量為0. 1654mg，結(jié)果見圖25。
[0157] 實施例3取編號為試驗2的益心復脈顆粒，測定其黃芪甲苷的含量
[0158] 步驟1，對照品溶液的制備
[0159] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含黃芪甲苷 0· 16 - 0· 24mg 即得。
[0160] 步驟2,供試品溶液的制備，方法如下：取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，至50ml 錐形瓶中，精密加4%氨水15ml，超聲處理25分鐘使充分溶散，離心（3000轉(zhuǎn)、10min)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通過已處理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脫，再以水5ml洗脫），用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩慢洗脫至2ml量 瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。
[0161] 步驟3,陰性樣品溶液的制備，方法如下：按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的 各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品，再按步驟2供試品溶液制 備方法，制成陰性樣品溶液。
[0162] 步驟4,注入液相色譜儀，計算黃芪甲苷含量，方法如下：采用液相色譜法，其色譜 條件為：C - 18色譜柱；流動相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱溫：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;進樣量：10 - 20 μ 1。檢測器條件：增益值：100 ;漂移管溫度：50°C ;霧化室溫度設(shè)置： cooling ;氣體壓力：30psi ;秒采點數(shù)：2。
[0163] 測得每g益心復脈顆粒中黃芪甲苷的含量為0. 1090mg，結(jié)果見圖26。
[0164] 實施例4取批號為20130205的益心復脈顆粒，測定其黃芪甲苷的含量。
[0165] 步驟1，對照品溶液的制備
[0166] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含黃芪甲苷 0· 16 - 0· 24mg 即得。
[0167] 步驟2,供試品溶液的制備，方法如下：取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，至50ml 錐形瓶中，精密加4%氨水15ml，超聲處理25分鐘使充分溶散，離心（3000轉(zhuǎn)、10min)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通過已處理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脫，再以水5ml洗脫），用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩慢洗脫至2ml量 瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。
[0168] 步驟3,陰性樣品溶液的制備，方法如下：按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的 各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品，再按步驟2供試品溶液制 備方法，制成陰性樣品溶液。
[0169] 步驟4,注入液相色譜儀，計算黃芪甲苷含量，方法如下：采用液相色譜法，其色譜 條件為：C - 18色譜柱；流動相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱溫：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;進樣量：10 - 20 μ 1。檢測器條件：增益值：100 ;漂移管溫度：50°C ;霧化室溫度設(shè)置： cooling ;氣體壓力：30psi ;秒采點數(shù)：2。
[0170] 測得每g益心復脈顆粒中黃芪甲苷的含量為0. 1147mg，結(jié)果見圖27。
[0171] 實施例5取批號為20130304的益心復脈顆粒，測定其黃芪甲苷的含量
[0172] 步驟1，對照品溶液的制備
[0173] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含黃芪甲苷 0· 16 - 0· 24mg 即得。
[0174] 步驟2,供試品溶液的制備，方法如下：取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，至50ml 錐形瓶中，精密加4%氨水15ml，超聲處理25分鐘使充分溶散，離心（3000轉(zhuǎn)、lOmin)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通過已處理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲醇 5ml洗脫，再以水5ml洗脫），用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩慢洗脫至2ml量 瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。
[0175] 步驟3,陰性樣品溶液的制備，方法如下：按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的 各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品，再按步驟2供試品溶液制 備方法，制成陰性樣品溶液。
[0176] 步驟4,注入液相色譜儀，計算黃芪甲苷含量，方法如下：采用液相色譜法，其色譜 條件為：C - 18色譜柱；流動相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱溫：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;進樣量：10 - 20 μ 1。檢測器條件：增益值：100 ;漂移管溫度：50°C ;霧化室溫度設(shè)置： cooling ;氣體壓力：30psi ;秒采點數(shù)：2。
[0177] 測得每g益心復脈顆粒中黃芪甲苷的含量為0. 1754mg，結(jié)果見圖28。
[0178] 實施例6取編號為試驗3的益心復脈顆粒，測定其黃芪甲苷的含量
[0179] 步驟1，對照品溶液的制備
[0180] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0. 16mg即 得。
[0181] 步驟2,供試品溶液的制備，方法如下：取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，至50ml 錐形瓶中，精密加2 %氨水9ml，超聲處理20分鐘使充分溶散，離心（3000轉(zhuǎn)、10min)，精密 移取上清液l〇ml，以0. 5ml/min的速度通過已處理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲 醇5ml洗脫，再以水5ml洗脫），用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩慢洗脫至2ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。
[0182] 步驟3,陰性樣品溶液的制備，方法如下：按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的 各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品，再按步驟2供試品溶液制 備方法，制成陰性樣品溶液。
[0183] 步驟4,注入液相色譜儀，計算黃芪甲苷含量，方法如下：采用液相色譜法，其色譜 條件為：C - 18色譜柱；流動相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱溫：35°C ;流速：0. 8ml/ min ;進樣量：10 μ 1。檢測器條件：增益值：50 ;漂移管溫度：40°C ;霧化室溫度設(shè)置： cooling ;氣體壓力：20psi ;秒采點數(shù)：1。
[0184] 測得每g益心復脈顆粒中黃芪甲苷的含量為0. 1807mg。
[0185] 實施例7取編號為試驗3的益心復脈顆粒，測定其黃芪甲苷的含量
[0186] 步驟1，對照品洛液的制備
[0187] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0. 24mg即 得。
[0188] 步驟2,供試品溶液的制備，方法如下：取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，至50ml 錐形瓶中，精密加5 %氨水21ml，超聲處理40分鐘使充分溶散，離心（3000轉(zhuǎn)、lOmin)，精密 移取上清液l〇ml，以1. 5ml/min的速度通過已處理好的C18固相萃取小柱（500mg，先以甲 醇5ml洗脫，再以水5ml洗脫），用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩慢洗脫至2ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。
[0189] 步驟3,陰性樣品溶液的制備，方法如下：按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的 各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品，再按步驟2供試品溶液制 備方法，制成陰性樣品溶液。
[0190] 步驟4,注入液相色譜儀，計算黃芪甲苷含量，方法如下：采用液相色譜法，其色譜 條件為：C - 18色譜柱；流動相：A% : B% =乙腈：水（35 :65);柱溫：40°C ;流速：1. 5ml/ min ;進樣量：20 μ 1。檢測器條件：增益值：200 ;漂移管溫度：60°C ;霧化室溫度設(shè)置： cooling ;氣體壓力：20psi ;秒采點數(shù)：10。
[0191] 測得每g益心復脈顆粒中黃芪甲苷的含量為0. 1925mg。
[0192] 實施例8取編號為試驗3的益心復脈顆粒，測定其黃芪甲苷的含量
[0193] 步驟1，對照品洛液的制備
[0194] 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0. 20mg即 得。
[0195] 步驟2,供試品溶液的制備，方法如下：取益心復脈顆粒約3. 0g，精密稱定，至50ml 錐形瓶中，精密加4%氨水15ml，超聲處理25分鐘使充分溶散，離心（3000轉(zhuǎn)、10min)，精密 移取上清液l〇ml，以lml/min的速度通過已處理好的PLS萃取小柱（500mg，先以甲醇5ml 洗脫，再以水5ml洗脫），用水5ml洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇2ml緩慢洗脫至2ml量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。
[0196] 步驟3,陰性樣品溶液的制備，方法如下：按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的 各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲苷的陰性樣品，再按步驟2供試品溶液制 備方法，制成陰性樣品溶液。
[0197] 步驟4,注入液相色譜儀，計算黃芪甲苷含量，方法如下：采用液相色譜法，其色譜 條件為：C - 18色譜柱；流動相：A% : =乙腈：水（35 :65);柱溫：40°C ;流速：1. 0ml/ min ;進樣量：10 - 20 μ 1。檢測器條件：增益值：100 ;漂移管溫度：50°C ;霧化室溫度設(shè)置： cooling ;氣體壓力：30psi ;秒采點數(shù)：2。
【主權(quán)項】
1. 一種益心復脈顆粒中黃芪甲苷含量測定方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 對照品溶液的制備：取黃芪甲苷對照品適量，加入含水甲醇或流動相制成含有黃 苗甲苷0. 16~0. 24mgl/ml的溶液即可； (2) 供試品溶液的制備：取益心復脈顆粒，用濃度為2~5%堿水溶液提取，提取液過固 相萃取柱，用甲醇洗脫即可； (3) 測定法：將上述對照品溶液和對照品溶液各5~20 μ 1注入高效液相色譜儀中。2. 如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟（2)中，所述的堿水溶液為氨水，碳 酸氫鈉中一種。3. 如權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征在于，所述的堿水溶液為氨水。4. 如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟（2)中所述的固相萃取柱填料為 C18或聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。5. 如權(quán)利要求4所述的測定方法，其特征在于，步驟（2)中所述的固相萃取柱填料為 C18〇6. 如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于：步驟（2)中所述的堿水溶液提取超聲 提取，提取液離心即可。7. 如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于：步驟（2)如下：取益心復脈顆粒，精密 加3~7倍量4%的氨水，超聲處理20~40分鐘使充分溶散，離心，精密移取上清液，以 0. 5~1. 5ml/min的速度通過已處理好的C18固相萃取小柱，水洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇 洗脫至量瓶中，即得。8. 如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟（3)中所述的高效液相色譜儀色譜 條件： 蒸發(fā)光散射檢測器：包括增益值：50~200 ;漂移管溫度：40~60°C;霧化室溫度設(shè)置： 冷卻cooling ;氣體壓力：20~30psi ;秒采點數(shù)~10 ; 色譜柱：C - 18 ; 流動相：乙腈：水=31~36 :69~64 ; 柱溫：35~42°C ; 流速：〇· 8 ~1. 5ml/min〇9. 如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，還包括陰性樣品溶液的制備步驟，方法 為按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的各味藥材，按益心復脈顆粒制法制備不含黃芪甲 苷的陰性樣品，再按步驟（2)供試品溶液制備方法，制成陰性樣品溶液。10. 如權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，包括如下步驟： ⑴對照品溶液的制備：取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每lml含 黃芪甲苷0.20mg，即得； (2) 供試品溶液的制備：取益心復脈，精密稱定，至50ml錐形瓶中，精密加5倍量4%氨 水，超聲處理25分鐘使充分溶散，離心，精密移取上清液，以lml/min的速度通過已處理好 的C18固相萃取小柱，用水洗脫，洗脫液棄去，再用甲醇緩慢洗脫至量瓶中，加甲醇稀釋至 刻度搖勻，即得。 (3) ，陰性樣品溶液的制備，按益心復脈顆粒處方配比，取除黃芪的各味藥材，按益心復 脈顆粒制法制備不含黃芪的陰性樣品，再按步驟（2)供試品溶液制備方法，制成陰性樣品 溶液。 (4)，注入液相色譜儀，其色譜條件為：色譜柱C18,4. 6 X 150mm，3. 5 μ m或4. 6 X 250mm， 5μπι;流動相：乙腈：水=35 :65 ;柱溫：40°C ;流速：1.0ml/min ;進樣量：10μ1 ;蒸發(fā)光散 射檢測器條件，包括增益值：1〇〇 ;漂移管溫度：50°C ;霧化室溫度設(shè)置：冷卻cooling ;氣體 壓力：30psi ;秒采點數(shù)：2。
【文檔編號】G01N30/02GK106033075SQ201510110146
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月12日
【發(fā)明人】侯春蓮, 劉海濤, 高展, 葛丹丹, 孫玉俠, 曹鳳蘭, 徐立元, 趙光燃, 楊建會, 楊雪梅
【申請人】天士力制藥集團股份有限公司, 天津天士力（遼寧）制藥有限責任公司