一組生物標(biāo)志物的測(cè)定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一組生物標(biāo)志物的測(cè)定方法，包括以下步驟：（1）提取與凈化；（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制；將空白樣品按上述步驟（1）處理，用該空白樣品基質(zhì)溶液在 2～100 μg/L 范圍內(nèi)，配制至少三個(gè)濃度的生物標(biāo)志物系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液；（3）液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測(cè)定。本發(fā)明利用分散固相萃取技術(shù)，建立了簡(jiǎn)便、快速并能有效避免樣品中基質(zhì)干擾的樣品前處理方法，將此前處理方法結(jié)合HPLC-MS/MS 應(yīng)用于動(dòng)物組織及尿液中生物標(biāo)志物的含量的定性確證和定量檢測(cè)，方法回收率在74.2%～106.2%之間，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為6.4%～13.0%，檢出限為20.0 μg/kg, 定量限為50.0 μg/kg，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一組生物標(biāo)志物的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一組生物標(biāo)志物的測(cè)定方法，更具體地說(shuō)是采用高效液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜（LC-MS/MS)定性定量測(cè)定生物組織或尿液品中的生物標(biāo)志物含量的方法，屬于生物 標(biāo)志物測(cè)定【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著溴氰菊酯使用范圍的不斷擴(kuò)大，溴氰菊酯的毒理研究亦從單純的選 擇低等生物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究神經(jīng)毒性作用機(jī)制，擴(kuò)展到對(duì)哺乳動(dòng)物的三致作用、代謝過(guò)程 等多層次的研究。為評(píng)估其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，需要發(fā)展用于生物亞致死效應(yīng)的指示參數(shù)來(lái)更為準(zhǔn) 確地評(píng)估和預(yù)測(cè)其對(duì)環(huán)境生物的毒害情況許多研究者首先從生物化學(xué)方面探索反應(yīng)污染 物對(duì)生物早期的影響參數(shù)，其中生物標(biāo)志物法因?yàn)闇y(cè)定指標(biāo)全面、準(zhǔn)確且系統(tǒng)，而得到普遍 認(rèn)可。生物標(biāo)志物通常分為三類(lèi)：即暴露標(biāo)志物、效應(yīng)標(biāo)志物和易感性標(biāo)志物。在選擇合適 的生物標(biāo)志物時(shí)，有時(shí)需要綜合分析，權(quán)衡利弊，采取一組綜合的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
[0003] 溴氰菊酯，分子式C22H19Br2N03，分子量505. 20,結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]

【權(quán)利要求】
1. 一組生物標(biāo)志物的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取與凈化 樣品制備動(dòng)物肉、動(dòng)物肝樣品經(jīng)均質(zhì)制樣機(jī)充分粉碎，-20°c避光保存；動(dòng)物尿樣品冰 箱中-20°C避光保存，樣品使用前避光解凍： a) 動(dòng)物肉樣品：稱(chēng)取樣品2. 00±0.Olg，加基質(zhì)分散固相萃取劑研磨至色澤均一，轉(zhuǎn)移 至50mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入IOmL提取液和10μL抗氧劑溶液，渦旋IOs后用細(xì)胞 破碎儀超聲提取5min，8000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈聚丙烯離心管中； 殘?jiān)尤?mL提取液，重復(fù)提取一次，合并上清液，將合并后的上清液4°C10000r/min離心 5min，所得上清液于40°C下氮?dú)獯抵两?；用乙腈水?:9)定容至lmL，定溶液渦旋后轉(zhuǎn)移 至2mLEP管中，4°C12000r/min離心lOmin，吸取上層清液至棕色進(jìn)樣小瓶，HPLC-MS/MS分 析； b) 肝臟樣品：稱(chēng)取樣品2. 00±0.Olg，加基質(zhì)分散固相萃取劑研磨至色澤均一，轉(zhuǎn)移至 50mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入IOmL提取液和10μL抗氧劑溶液，渦旋IOs后用細(xì)胞破碎 儀超聲提取5min，8000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈聚丙烯離心管中；殘?jiān)?入5mL提取液，重復(fù)提取一次，合并上清液，將合并后的上清液4°ClOOOOr/min離心5min， 所得上清液于40°C下氮?dú)鉂饪s至2mL左右，加入5X2mL乙腈飽和正己烷脫脂2次，離心，將 棄去正己烷后的提取液繼續(xù)40°C下氮?dú)鉂饪s至近干；用乙腈：水（1:9)定容至lmL，渦旋后 轉(zhuǎn)移至2mLEP管中，4°C12000r/min離心10min，吸取上層清液至棕色進(jìn)樣小瓶，HPLC-MS/ MS進(jìn)樣分析； c) 尿液樣品：用移液槍取I.OmL動(dòng)物尿樣品于50mL聚丙烯離心管中，用甲酸銨緩沖 液調(diào)節(jié)至中性，加入10μL抗氧劑和ImL甲醇，潤(rùn)旋30s后8000r/min離心5min，轉(zhuǎn)出上清 液，加5mL正己烷脫脂2次后，加載至事先用甲醇和水活化好的HLB小柱，接取流出樣液， 4°C12000r/min離心IOmin,吸取上清液進(jìn)棕色進(jìn)樣小瓶，HPLC-MS/MS分析； (2) 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 將空白樣品按上述步驟（1)處理，用該空白樣品基質(zhì)溶液在2?100μg/L范圍內(nèi)，配 制至少三個(gè)濃度的生物標(biāo)志物系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液； ⑶液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS)測(cè)定 將步驟（2)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜 峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；在相同條件下將步驟（1)中凈化 后的樣品液注入LC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得樣品液中生物標(biāo)志物的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲 線，得到樣品液中生物標(biāo)志物含量，然后根據(jù)樣品液所代表試樣的質(zhì)量計(jì)算得到樣品中生 物標(biāo)志物含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樣品中生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，步驟 (1)中基質(zhì)分散固相萃取劑是十八烷基硅烷鍵合相（C18),每克樣品中C18加入量為50mg。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種樣品中生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，步 驟（1)中提取溶液為含易揮發(fā)有機(jī)酸的乙腈水溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樣品中生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，步驟 (1)中抗氧劑是維生素C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（1)中樣 品凈化過(guò)程中氮吹至近干后，定容液乙腈-水的比例與初始流動(dòng)相一致。
6. 據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（3)中液相 色譜的流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為體積比是0. 1 %的甲酸水溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（3)中液 相色譜使用梯度洗脫的方法，梯度洗脫的程序是：
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（3)中液 相色譜的色譜柱填料為C18,粒徑為3μπι;步驟（3)中質(zhì)譜檢測(cè)使用電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，電噴 霧電壓：+5500V&-4500V;電離方式：ESI+&ESI_;正負(fù)離子同時(shí)掃描；離子源溫度：550°C;霧 化氣壓力：〇· 31MPa;氣簾氣壓力：0· 207MPa;輔助氣壓力：0· 369MPa。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，所述的生 物標(biāo)志物是IR, 3R-二溴菊酸[lR-cis) _3_ (2, 2-dibromoethenyl) -2, 2-dimethylcyclo propanecarboxylicacid]、3_ 苯氧基苯甲酸（3-phenoxybenzoicacid，3_PBA)、8-輕 基脫氧鳥(niǎo)苷（8H3HdG)、6-甲氧基鳥(niǎo)噪呤（6_Methoxyguanine)、5-輕基色胺（Serotonin hydrochloride，5-HT)、5-羥吲哚乙酸（5-HYDR0XYIND0LE-3-ACETICACID，5-HIAA)、 3-硝基丙酸（3-NITR0PR0PI0NICACID，3-NPA)、多巴胺（3-Hydroxytyramine，DA)、腎上 腺素（L(-)-Epin印hrine，EP)、還原型谷胱甘肽（GSH)、氧化型谷胱甘肽（GSSG)、維生素 C(L(+)-Ascorbicacid,VC)〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種生物標(biāo)志物含量的測(cè)定方法，其特征在于，步驟（3)中 質(zhì)譜檢測(cè)使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM)掃描模式，各生物標(biāo)志物的母、子離子及MRM監(jiān)測(cè)條件為：
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104458988SQ201410705215
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】曹文卿, 靜平, 李建軍, 林黎明, 楊桂朋, 封立平 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心