一種雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物堿的快速分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物堿成分的獨(dú)立、 快速分析。
【背景技術(shù)】
[0002] 雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.f.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，主要分布在 中國(guó)南方，是一種重要的傳統(tǒng)中藥材。用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、紅斑狼倉(cāng)、接觸 性皮炎等自身免疫性疾病，均有顯著性療效。
[0003] 倍半萜吡啶生物堿是雷公藤屬植物中一類非常重要的活性成分，研宄表明該類化 合物具有抗免疫、殺蟲(chóng)、抗-HIV(J.Nat.Prod. 2000, 63, 357)、抗癌等活性。因此，吸引了眾 多的科學(xué)家來(lái)進(jìn)行研宄。高效的分析方法對(duì)生物領(lǐng)域的研宄至關(guān)重要，因?yàn)樯镱I(lǐng)域往 往涉及痕量分析。目前主要的分析是核磁共振，但核磁鑒定需要獲得純品，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn) 對(duì)雷公藤中含量相對(duì)很低的未知的倍半萜吡啶生物堿進(jìn)行快速分析。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是一 種重要的分析復(fù)雜體系中未知痕量物質(zhì)的方法，目前的方法往往需要數(shù)據(jù)庫(kù)（J.Am.Chem. Soc. 2009, 131，5030 ;Anal.Chem. 2008, 80, 1280)，但液質(zhì)聯(lián)用的數(shù)據(jù)庫(kù)十分有限，不同的儀 器之間二級(jí)質(zhì)譜的重現(xiàn)性較差，此外，獲得痕量的標(biāo)準(zhǔn)天然產(chǎn)物是十分困難的；植物中存在 眾多的同分異構(gòu)體增加了分析的困難。因此，需要建立一種實(shí)用的、快速的分析方法用于 雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物堿的快速分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可靠、快速的質(zhì)譜方法用于雷公藤中未知的倍半萜吡啶 生物堿的快速分析。本方法結(jié)合液相色譜分離技術(shù)，利用兩種方法獲得獲得提取物中化合 物二級(jí)質(zhì)譜圖，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜的輪廓圖并結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜中的特征離子對(duì)未知的倍半萜吡啶 生物堿化合物進(jìn)行分析。
[0005] 因此，本發(fā)明提供的雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物堿的分析方法包括如下步 驟：（1)雷公藤中活性成分提??；（2)利用電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)已知的單一 倍半萜吡啶生物堿的碎片離子進(jìn)行分析；（ 3)液質(zhì)聯(lián)用分析，即利用高效液相色譜-電噴 霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀獲得復(fù)雜體系中倍半萜吡啶生物堿的二級(jí)質(zhì)譜，即獲得未知 化合物的碎片離子；(4)通過(guò)比較已知化合物與復(fù)雜體系中倍半萜吡啶生物堿碎片離子的 輪廓圖以及比較它們的特征碎片離子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜體系中未知的倍半萜吡啶生物堿進(jìn) 行快速的結(jié)構(gòu)分析分析。
[0006] 具體地，本發(fā)明提供的雷公藤中未知的倍半萜吡啶生物堿的分析方法包括如下步 驟：
[0007] (1).雷公藤活性成分的提取
[0008] 對(duì)雷公藤中的活性成分進(jìn)行針對(duì)性的超聲浸提，其中浸提溶解試劑為水、甲醇、乙 氰、丙酮、氯仿或者上述溶劑的任意兩者的混合溶劑，超聲時(shí)間為1-5小時(shí)，然后進(jìn)行過(guò)濾。 本發(fā)明方法提取過(guò)程既要盡可能獲得多的活性成分，又要盡量去掉其它成分例如色素、糖 等的干擾。
[0009] (2).已知的單一倍半萜吡啶生物堿的碎片離子分析
[0010] 利用電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)已知的14種單一倍半萜吡啶生物堿的 碎片離子進(jìn)行分析（表一），根據(jù)這14種化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、裂解方式以及二級(jí)譜圖的輪廓 分成7個(gè)類型。裂解方式主要有側(cè)鏈斷裂，骨架斷裂的，以及碎片之間進(jìn)行加和反應(yīng)。其中 與C-1相連接的側(cè)鏈易發(fā)生加和反應(yīng)，與C-2相連接的側(cè)鏈容易丟失。
[0011] (3).液質(zhì)聯(lián)用分析
[0012] 利用高效液相色譜對(duì)步驟（1)中獲得的混合物進(jìn)行分離，選擇C18柱，相應(yīng)的分離 條件（包括色譜柱的長(zhǎng)度、內(nèi)徑、填料、流速、流動(dòng)相組成、洗脫梯度、不同的電解質(zhì)）、質(zhì)譜 條件（儀器的參數(shù)）通過(guò)圖譜進(jìn)行優(yōu)化。應(yīng)用液相色譜-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜 儀在正離子模式下進(jìn)行全掃描分析（其中電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜是一個(gè)完整的設(shè) 備，可用于獲得一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜的譜圖）。利用兩種方法選擇碰撞能來(lái)獲得碎片離子輪廓 圖，其中分別利用恒定的與梯度的碰撞能來(lái)獲得碎片離子的輪廓圖，其中梯度的碰撞能與 化合物的分子量成正比。
[0013] (4).雷公藤提取物中倍半萜吡啶生物堿的結(jié)構(gòu)分析
[0014] 通過(guò)比較已知與復(fù)雜體系中倍半萜吡啶生物堿碎片離子的輪廓圖以及比較它們 的特征碎片離子，來(lái)鑒別不同類型的未知倍半萜吡啶生物堿化合物，其包括：其中譜圖中碎 片離子m/z206,204,或194是吡啶部分的特征離子；其中m/z310是兩個(gè)碎片離子進(jìn)行加 和反應(yīng)產(chǎn)生的，該離子與側(cè)鏈位置相關(guān)，可用于鑒定側(cè)鏈位置；其它的碎片離子主要來(lái)自于 側(cè)鏈丟失；化合物分子量在800Da以上時(shí)，選擇恒定能量方法更適合用于鑒定未知化合物， 化合物分子量在800Da以下時(shí)，選擇梯度能量方法更適合用于鑒定未知化合物。
[0015] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 1.可以快速地、獨(dú)立地完成對(duì)雷公藤中倍半萜吡啶生物堿成分，包括未知的化合 物的結(jié)構(gòu)鑒定，不需要結(jié)合其他的分析手段。
[0017] 2.可以快速地、獨(dú)立地完成對(duì)雷公藤中倍半萜吡啶生物堿成分的分析，包括某些 側(cè)鏈位置的確定。
[0018] 3.兩個(gè)碰撞能的選擇既提高了鑒定的可信度，又避免了數(shù)據(jù)的繁瑣，可用于高通 量分析。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 表一是已知的單一倍半貓P比啶生物堿的碎片離子質(zhì)譜分析（碰撞能：25eV).
[0020] 圖一是（a)已知化合物cangorinineE-1的二級(jí)圖譜，（b)已知化合物wilforine 的二級(jí)圖譜和（c)未知知化合物A的二級(jí)圖譜；
[0021] 圖二是（a)已知化合物euonymine的二級(jí)圖譜，（b)未知化合物B的二級(jí)圖譜（碰 撞能為21eV)和（c)未知知化合物B的二級(jí)圖譜（碰撞能為25eV)。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施方案為便于更好的理解本發(fā)明，但并非 對(duì)本發(fā)明的限制。
[0023] 實(shí)施例1:
[0024] (1).雷公藤活性成分提取
[0025] 雷公藤購(gòu)于成都荷花池市場(chǎng)，100%甲醇超聲浸泡一小時(shí)后低壓濃縮過(guò)濾，獲得相 應(yīng)的固體。
[0026] (2).對(duì)已知的單一倍半萜吡啶生物堿的碎片離子進(jìn)行分析
[0027]儀器：布魯克公司ESI-Q_T0F(micr0T0FQ)
[0028] 質(zhì)譜條件：離子化模式，正離子模式（+);噴霧氣壓力，30psi;氬氣為碰撞氣，碰撞 能，25eV;干燥氣溫度，180°C;毛細(xì)管端口電壓，-4500V，金屬蓋電壓，-4000V。
[0029]對(duì)已知化合物cangorinineE-1的二級(jí)圖譜進(jìn)行分析（附圖一（a))，研宄發(fā)現(xiàn) 高質(zhì)量區(qū)的碎片離子主要通過(guò)斷裂側(cè)鏈丟失，低質(zhì)量區(qū)的碎片離子，例如m/z206主要是 吡啶部分的特征離子，特征的碎片離子m/z310通過(guò)加和反應(yīng)形成。盡管已知的化合物 wilforine與cangorinineE-1是同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)也十分相似，然而它們二級(jí)譜圖的輪廓 圖并不相同（附圖一（b))，更重要的是在化合物wilforine的二級(jí)譜圖中沒(méi)有特征的碎片 離子m/z310,這說(shuō)明該離子的形成與苯甲酸側(cè)鏈的取代位置相關(guān)。
[0030] (3).液質(zhì)聯(lián)用對(duì)粗提物進(jìn)行分析
[0031]儀器：布魯克公司HPLC-ESI-Q-TOF(micrOTOFQ)
[0032] 色譜條件：安捷倫C18色譜柱（4. 6X150,3. 5ym);進(jìn)樣量：10yl;流速：1.0ml/ min;流動(dòng)相