烏蘇型三萜3,25?環(huán)氧?1α,3α,11α,12,23,25?六羥基?烏蘇?12?烯及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種式(I)所示的烏蘇型三萜3,25?環(huán)氧?1α,3α,11α,12,23,25?六羥基?烏蘇?12?烯及其制備方法，本發(fā)明所述烏蘇型三萜3,25?環(huán)氧?1α,3α,11α,12,23,25?六羥基?烏蘇?12?烯的提取、分離、純化方法簡單，抑制腫瘤細(xì)胞活性明確，具有潛在的開發(fā)為抗腫瘤藥物的價值，該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過波譜學(xué)數(shù)據(jù)得到確認(rèn)，不存在光學(xué)異構(gòu)體，可以避免光學(xué)異構(gòu)體潛在的風(fēng)險；。
【專利說明】
烏蘇型三萜3,25-環(huán)氧-1 α , 3α , 11 α , 12,23,25-六羥基-烏蘇-12-稀及其制備方法和應(yīng)用 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[00011 本發(fā)明涉及一種烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯及其制備方法和應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 衛(wèi)矛科植物中的巧茶屬（Catha Benth.)、南蛇藤屬（Celastrus L.)、十齒花屬 (Dipentodon Dunn)、衛(wèi)矛屬（Euonymus I·)、溝辦屬（Glyptopetalum Thw·)、美登木屬 (Maytenus Molina)、假衛(wèi)矛屬（Microtropis wall.ex Mcissa)、核子木屬（Perrottetia Η.B.K.)、雷公藤屬(Tripterygium Hook.F.)的某些植物在我國作為藥用植物和民間藥用 植物。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其具有清熱、祛風(fēng)、除濕、活血、解毒、消腫的功效，常用于治療風(fēng)濕積累 的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿痛、筋骨痛、牙痛、閉經(jīng)、痢疾、跌打損傷、腸風(fēng)痔漏、毒蛇咬傷、瘡瘍、 癰癤等癥;現(xiàn)代藥理研究表明本科植物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗生育、昆蟲拒食及毒殺等 活性，目前多用于治療風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血液病及皮膚病，也用作農(nóng)用殺蟲劑。
[0003] 因此對該類植物進行系統(tǒng)、科學(xué)的研究，探明其有效成分及作用機理，發(fā)現(xiàn)一些結(jié) 構(gòu)新穎的活性成分，將對更深層開發(fā)利用衛(wèi)矛科藥用植物的食療保健產(chǎn)品、開發(fā)治療藥物 及臨床應(yīng)用產(chǎn)生重要意義。
[0004] 三花假衛(wèi)矛（學(xué)名：Microtropis triflora)是衛(wèi)矛科假衛(wèi)矛屬（Microtropis Wal 1. ex Meissn.)植物，灌木，高2.5~5米，是中國的特有植物。分布于中國大陸的云南、貴 州、四川、湖北等地，生長于海拔1300~2100米的地區(qū)，一般生長在林中以及山坡林緣。
[0005] 本發(fā)明以三花假衛(wèi)矛植物藤莖為研究對象，進行提取、分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定得到 3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯，屬于烏蘇型三萜化合物，該化合物 具有一定程度的抗腫瘤活性。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇- 12-烯及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 一種烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯，其結(jié)構(gòu)式 如式(I)所示：
[0010] 一種式（I)所示的烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯的制備方法，所述的制備方法按如下步驟進行：
[0011] (1)甲醇浸提:將三花假衛(wèi)矛的藤莖粉碎干燥，加入甲醇浸提提取，之后濾除不溶 物，濾液減壓蒸干得到甲醇浸膏；
[0012] 步驟(1)中，所述甲醇浸提提取的具體操作方法為:將粉碎干燥后的三花假衛(wèi)矛藤 莖與甲醇以料液質(zhì)量比1:3~5混合，常溫(20~30°C)浸提5~10天，過濾得到甲醇提取液， 濾渣重復(fù)浸提2~4次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到甲醇浸膏。
[0013] (2)乙酸乙酯萃取:步驟（1)所得甲醇浸膏用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓蒸干得到 乙酸乙酯浸膏；
[0014] 步驟(2)中，所述乙酸乙酯萃取的具體操作方法為:將步驟（1)所得甲醇浸膏分散 于5~10倍質(zhì)量的水中，得到懸浮液，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓 回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏。
[0015] (3) -次柱層析：用200~300目柱層析硅膠對步驟(2)所得乙酸乙酯浸膏進行柱層 析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比5:1~1:5的混合液和乙酸乙酯(純)為洗脫劑，進行梯度 洗脫，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得粗品；
[0016] 步驟(3)中，所述梯度洗脫的具體操作方法為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為 5:1、1:1、1:3、1:5的混合液、乙酸乙酯（純)為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為5~ 7mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為300~400min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓 蒸除溶劑得粗品。
[0017] (4)二次柱層析：用300~400目柱層析硅膠繼續(xù)對步驟(3)所得粗品進行柱層析分 離，以石油醚/乙酸乙酯體積比4:1~1: 2的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，收集含目標(biāo)化 合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到固體物質(zhì)；
[0018] 步驟(4)中，所述梯度洗脫的具體操作方法為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為 4:1、2:1、1:1、1:2的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為3~4mL/min，每種梯 度的洗脫劑的洗脫時間為50~70min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到固體 物質(zhì)。
[0019] (5)洗滌除雜：將步驟(4)所得固體物質(zhì)用石油醚/乙酸乙酯混合溶劑進行洗滌除 雜，最后干燥得到所述式（I)所示的烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯；
[0020] 步驟(5)所述的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑中，石油醚與乙酸乙酯的體積比為1:1; 所述洗滌除雜的具體操作方法為:在離心管中加入所述固體物質(zhì)，再加入固體物質(zhì)的質(zhì)量2 ~3倍的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑，40ΚΗζ超聲10s，離心，去除上清液，重復(fù)洗滌3次，最后 干燥得到產(chǎn)物。
[0021 ]本發(fā)明所述步驟(3)、（4)的柱層析過程中，可通過薄層層析(TLC)檢測收集含目標(biāo) 化合物(烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯）的洗脫液;所述 的目標(biāo)化合物用TLC檢測時，以石油醚:乙酸乙酯=1:2為展開劑，其R f值為0.3。
[0022] 經(jīng)實驗證明，本發(fā)明所述烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏 蘇-12-烯在制備抗腫瘤活性藥物中具有應(yīng)用前景。
[0023] 本發(fā)明所述烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯與 DDP對照組相比較，高濃度時對人乳腺癌Bcap37細(xì)胞及人肝癌SMMC7721細(xì)胞具有顯著的體 外增殖抑制作用，且對S麗C7721細(xì)胞的抑制作用強于Bcap37細(xì)胞，這提示該化合物具有潛 在的抗腫瘤活性。
[0024]本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23， 25-六羥基-烏蘇-12-烯的提取、分離、純化方法簡單，抑制腫瘤細(xì)胞活性明確，具有潛在的 開發(fā)為抗腫瘤藥物的價值，該化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過波譜學(xué)數(shù)據(jù)得到確認(rèn)，不存在光學(xué)異構(gòu) 體，可以避免光學(xué)異構(gòu)體潛在的風(fēng)險。 (四）
【附圖說明】
[0025]圖1為實施例5中DDP、烏蘇型三萜(I)對兩種癌細(xì)胞的半致死濃度(IC50);
[0026] 圖2為實施例5中烏蘇型三萜(I)對兩種癌細(xì)胞的生長抑制率。 (五)
【具體實施方式】
[0027] 下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此。
[0028] 實施例1:3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯的制備 [0029] (1)甲醇浸提:將粉碎干燥后的三花假衛(wèi)矛藤莖500g與甲醇2000mL混合，常溫浸提 7天，過濾得到甲醇提取液，濾渣重復(fù)浸提3次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到甲 醇浸膏60g。
[0030] (2)乙酸乙酯萃取:將步驟（1)所得甲醇浸膏60g分散于水300mL中，得到懸浮液，用 等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏20g。
[0031] (3)-次柱層析：用200~300目柱層析硅膠200g對步驟（2)所得乙酸乙酯浸膏20g 進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為5:1、1:1、1:3、1:5的混合液和乙酸乙酯 (純)為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為7mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為 300min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得粗品1.3g;
[0032] (4)二次柱層析：用300~400目柱層析硅膠100g繼續(xù)對步驟(3)所得粗品1.3g進行 柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為4 :1、2:1、1:1、1:2的混合液為洗脫劑，進行 梯度洗脫，洗脫劑的流速為4mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為50min，收集含目標(biāo)化 合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到固體物質(zhì)〇. 2g;
[0033] (5)洗滌除雜:在離心管中加入步驟(4)所得固體物質(zhì)0.2g，再加入石油醚/乙酸乙 酯體積比1:1的混合溶劑0.4mL，40KHZ超聲10s，離心，去除上清液，重復(fù)洗滌3次，最后干燥 得到產(chǎn)物3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯0 · 15g。
[0034] 實施例2:3，25-環(huán)氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯的制備：
[0035] (1)甲醇浸提:將粉碎干燥后的三花假衛(wèi)矛藤莖1000g與甲醇3000mL混合，常溫浸 提5天，過濾得到甲醇提取液，濾渣重復(fù)浸提4次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到 甲醇浸膏11 〇g。
[0036] (2)乙酸乙酯萃取:將步驟（1)所得甲醇浸膏110g分散于水1000mL中，得到懸浮液， 用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏38g。
[0037] (3)-次柱層析：用200~300目柱層析硅膠300g對步驟（2)所得乙酸乙酯浸膏38g 進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為5:1、1:1、1:3、1:5的混合液和乙酸乙酯 (純)為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為5mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為 400min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得粗品2.8g;
[0038] (4)二次柱層析：用300~400目柱層析硅膠250g繼續(xù)對步驟(3)所得粗品2.8g進行 柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為4 :1、2:1、1:1、1:2的混合液為洗脫劑，進行 梯度洗脫，洗脫劑的流速為3mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為70min，收集含目標(biāo)化 合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到固體物質(zhì)〇. 45g;
[0039] (5)洗滌除雜：在離心管中加入步驟(4)所得固體物質(zhì)0.45g，再加入石油醚/乙酸 乙酯體積比1:1的混合溶劑1.0mL，40KHZ超聲10s，離心，去除上清液，重復(fù)洗滌3次，最后干 燥得到產(chǎn)物3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯0.41g。
[0040] 實施例3:3，25-環(huán)氧-Ια，3α，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯的制備：
[0041] (1)甲醇浸提:將粉碎干燥后的三花假衛(wèi)矛藤莖500g與甲醇2500mL混合，常溫浸提 10天，過濾得到甲醇提取液，濾渣重復(fù)浸提2次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到 甲醇浸膏65g。
[0042] (2)乙酸乙酯萃取:將步驟（1)所得甲醇浸膏65g分散于水400mL中，得到懸浮液，用 等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏22g。
[0043] (3)-次柱層析：用200~300目柱層析硅膠200g對步驟(2)所得乙酸乙酯浸膏22g 進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為5:1、1:1、1:3、1:5的混合液和乙酸乙酯 (純)為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為6mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為 350min，收集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得粗品1.5g;
[0044] (4)二次柱層析：用300~400目柱層析硅膠150g繼續(xù)對步驟(3)所得粗品1.5g進行 柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為4 :1、2:1、1:1、1:2的混合液為洗脫劑，進行 梯度洗脫，洗脫劑的流速為3mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為65min，收集含目標(biāo)化 合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到固體物質(zhì)〇.25g;
[0045] (5)洗滌除雜:在離心管中加入步驟(4)所得固體物質(zhì)0.25g，再加入石油醚/乙酸 乙酯體積比1:1的混合溶劑0.75mL，40KHZ超聲10s，離心，去除上清液，重復(fù)洗滌3次，最后干 燥得到產(chǎn)物3，25-環(huán)氧-Ια，3a，1 Ια，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯0 · 22g。
[0046] 實施例4:化合物測試 [0047]表1:實驗所用儀器
質(zhì)譜儀 ESI-MS LCQ-Flcct Thermo Fisher Scientific 參司
[0049] 熔點分析儀 ΜΡΛΙΟΟ 美國SRS公司
[0050] 試劑:核磁共振使用氘代DMS0 (二甲亞砜)試劑，質(zhì)譜使用德國默克(Merck)色譜純 試劑。
[0051 ]對實施例1、實施例2或?qū)嵤├?制得的烏蘇型三萜化合物（I)進行理化性質(zhì)和波譜 學(xué)分析，m.p.288-290°C，ESI-MS測定值m/z:521[M+H] +，結(jié)合匪R數(shù)據(jù)確定其分子式為 C30H48〇7，分子量為520，不飽和度為7。
[0052]表2:所得烏蘇型三萜化合物（I)的NMR數(shù)據(jù)

[0055] 實施例5:抗腫瘤活性測試
[0056] 我們對實施例1制得的烏蘇型三萜(I)進行了體外抗腫瘤活性測試。
[0057]方法：取對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔100此細(xì)胞懸液接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種24h后給藥（100μL孔），分別設(shè)細(xì)胞對照組以及4個濃度受試藥物組。 繼續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入100yL MTT(lmg/mL，以DMEM培養(yǎng)液溶解），37°C孵育2h，棄去各孔內(nèi) 液體后加入150yL酸化異丙醇(含0.04mol/L HC1)，避光放置30min，DG3022A型酶聯(lián)免疫檢 測儀測定570nm處吸光度，計算各受試藥物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，以孫瑞元教授編寫的 NDST計算機程序計算各受試藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
[0058]結(jié)果:實施例1所制得的烏蘇型三萜（I)與DDP對照組相比較，高濃度時對人乳腺癌 Bcap37細(xì)胞及人肝癌SMMC7721細(xì)胞具有顯著的體外增殖抑制作用，其中對SMMC7721細(xì)胞的 抑制作用強于Bcap37細(xì)胞。這提示該化合物是潛在的抗腫瘤活性的藥物(如圖1、2所示）。
【主權(quán)項】
1. 一種烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-la，3a，1 la，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯，其結(jié)構(gòu)式如 式(I)所示：2. -種如權(quán)利要求1所述的式（I)所示烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-la，3a，1 la，12，23，25-六 羥基-烏蘇-12-烯的制備方法，其特征在于，所述的制備方法按如下步驟進行： (1) 甲醇浸提:將三花假衛(wèi)矛的藤莖粉碎干燥，加入甲醇浸提提取，之后濾除不溶物，濾 液減壓蒸干得到甲醇浸膏； (2) 乙酸乙酯萃?。翰襟E（1)所得甲醇浸膏用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓蒸干得到乙酸 乙酯浸膏； (3) -次柱層析：用200~300目柱層析硅膠對步驟(2)所得乙酸乙酯浸膏進行柱層析分 離，以石油醚/乙酸乙酯體積比5:1~1:5的混合液和乙酸乙酯為洗脫劑，進行梯度洗脫，收 集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得粗品； (4) 二次柱層析：用300~400目柱層析硅膠繼續(xù)對步驟(3)所得粗品進行柱層析分離， 以石油醚/乙酸乙酯體積比4:1~1:2的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，收集含目標(biāo)化合物 的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到固體物質(zhì)； (5) 洗滌除雜:將步驟(4)所得固體物質(zhì)用石油醚/乙酸乙酯混合溶劑進行洗滌除雜，最 后干燥得到所述式（I)所示的烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-la，3a，1 la，12，23，25-六羥基_烏蘇_ 12-稀。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)甲醇浸提的操作方法為:將 粉碎干燥后的三花假衛(wèi)矛藤莖與甲醇以料液質(zhì)量比1:3~5混合，常溫浸提5~10天，過濾得 到甲醇提取液，濾渣重復(fù)浸提2~4次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到甲醇浸膏。4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)乙酸乙酯萃取的操作方法 為:將步驟(1)所得甲醇浸膏分散于5~10倍質(zhì)量的水中，得到懸浮液，用等體積的乙酸乙酯 萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏。5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，所述梯度洗脫的操作方法 為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為5:1、1:1、1 :3、1:5的混合液、乙酸乙酯為洗脫劑，進行 梯度洗脫，洗脫劑的流速為5~7mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為300~400min，收 集含目標(biāo)化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得粗品。6. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述梯度洗脫的操作方法 為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為4:1、2:1、1:1、1:2的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫， 洗脫劑的流速為3~4mL/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為50~70min，收集含目標(biāo)化合 物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到固體物質(zhì)。7. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)洗滌除雜的操作方法為:在 離心管中加入所述固體物質(zhì)，再加入固體物質(zhì)的質(zhì)量2~3倍的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑， 40KHz超聲10s，離心，去除上清液，重復(fù)洗滌3次，最后干燥得到產(chǎn)物;所述的石油醚/乙酸乙 酯混合溶劑中，石油醚與乙酸乙酯的體積比為1:1。8. 如權(quán)利要求1所述的烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-la，3a，1 la，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯在制備抗腫瘤活性藥物中的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求8所述的烏蘇型三萜3，25-環(huán)氧-la，3a，1 la，12，23，25-六羥基-烏蘇-12-烯在制備抗人乳腺癌或人肝癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07J71/00GK106046109SQ201610438998
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】王奎武, 周蔓青
【申請人】浙江工商大學(xué)