雷公藤甲素誘導(dǎo)建立的卵巢癌多藥耐藥細胞株及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人卵巢癌耐藥細胞株及其用途，具體涉及以人卵巢癌SKOV3為親 代細胞，通過逐步增加化療藥物雷公藤甲素（TPL)作用濃度，建立了卵巢癌多藥耐藥細胞 株SKOV3/TPL，屬于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 在最近一次世界范圍內(nèi)腫瘤發(fā)病率統(tǒng)計中，卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖器官惡性 腫瘤中第三位，病死率高居第一位，嚴重危害著女性的健康及生命?；熓锹殉舶┲委煹闹?要手段之一，在卵巢癌的綜合治療中占有重要的地位，但臨床上化療耐藥是導(dǎo)致卵巢癌化 療失敗的主要原因。耐藥性的產(chǎn)生是多因素的，與藥物的傳輸、代謝和細胞修復(fù)的改變都有 關(guān)系。雷公藤甲素（triptolide，TPL)是植物雷公藤的主要有效成份之一，具有抗腫瘤、抗 炎、抗生育和調(diào)節(jié)免疫等生物活性。近幾年人們對TPL治療癌癥的機制做了大量的研宄。 發(fā)現(xiàn)TPL對肺癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌等多種實體瘤細胞具有廣譜的細胞毒效應(yīng)； 還能與多種化療藥物協(xié)同作用，增強化療效果或逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥。經(jīng)體內(nèi)外研宄證實，與 傳統(tǒng)抗腫瘤藥物多柔比星、絲裂霉素、順鉑、紫杉醇相比TPL具有更強的抗腫瘤活性，因此 采用TPL治療也成為了最有希望的卵巢癌治療途徑之一。但不得不令人們關(guān)注的另一個事 實是，在長期的體外細胞培養(yǎng)過程中，仍會出現(xiàn)TPL耐藥現(xiàn)象進而導(dǎo)致腫瘤的惡性發(fā)展。本 發(fā)明通過建立TPL誘導(dǎo)的卵巢癌耐藥株，來探討此類藥物在未來卵巢癌治療的可行性與療 效，進而為其可能產(chǎn)生耐藥的機制提供理論依據(jù)。SK0V3細胞是卵巢腺癌細胞株，來源于卵 巢癌患者腹水，由美國G. Trempe于1973年建立，是研宄卵巢癌很常用的一種細胞株。目前， 國內(nèi)外尚沒有SK0V3對TPL的耐藥細胞株，因此有必要建立該耐藥腫瘤細胞株。
[0003] 腫瘤耐藥細胞株的建立通常有兩種方法，一是逐步增加藥物濃度、持續(xù)誘導(dǎo)法，二 是大劑量沖擊間斷給藥法。國內(nèi)外均有研宄對這兩種方法進行比較，認為不同誘導(dǎo)方式可 能獲得不同耐藥機理的耐藥細胞株，同時也可能影響腫瘤細胞耐藥程度，持續(xù)誘導(dǎo)比沖擊 誘導(dǎo)更易產(chǎn)生耐藥性。持續(xù)誘導(dǎo)法以腫瘤細胞最終能在特定濃度化療藥物中穩(wěn)定生長作為 誘導(dǎo)成功的判定標準，細胞耐藥性穩(wěn)定、直觀，因此本發(fā)明主要采用該方法來誘導(dǎo)耐藥細胞 的產(chǎn)生。
[0004] 腫瘤細胞耐藥程度的判定常用耐藥指數(shù)（resistant index，RI)來表示，RI是耐 藥細胞半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC5tl)與親代細胞半數(shù)抑制濃度的 比值。Snow等按照耐藥指數(shù)的高低將耐藥性分為低度（< 5)、中度（5-15)、高度（> 15)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于建立卵巢癌多藥耐藥細胞株SK0V3/TPL，為腫瘤相關(guān)研宄提供 耐藥腫瘤細胞模型，并可通過對比其與親代細胞的遺傳差異進而研宄藥物的作用機制。
[0006] 本發(fā)明選擇人卵巢癌SK0V3細胞株作為親代細胞，從IOnM逐步增加中藥雷公藤 的單體提取物雷公藤甲素（Triptolide，TPL)的作用濃度至400nM，建立了一種卵巢癌多 藥耐藥細胞株，命名為SK0V3/TPL，分類命名為人卵巢癌細胞系，微生物保藏號為CGMCC No. 10306,保藏日期為2015年Ol月04日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所。
[0007] 本發(fā)明進一步提供了制備所述的卵巢癌多藥耐藥細胞株的方法，其特征在于：包 括以下步驟：（1)人卵巢癌SK0V3細胞株，復(fù)蘇后用含10%小牛血清、lOOU/ml青霉素和 100U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液于37°C、5% C02、95%濕度條件下培養(yǎng)；
[0008] (2)取對數(shù)生長期SK0V3細胞，換新鮮培養(yǎng)液，加入雷公藤甲素（TPL)，使其作用濃 度為10nM，在37°C、5% C02、95%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持IOnM藥物濃度直至 存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0009] (3)適當增加 TPL的作用濃度，在37°0、5%〇)2、95%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換 液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；
[0010] (4)重復(fù)步驟（3)直到獲得能在400nM TPL中穩(wěn)定生長、傳代及復(fù)蘇的SK0V3/TPL 細胞株。
[0011] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（3)每次增加 TPL的作用濃度為50nM。
[0012] 在誘導(dǎo)過程中，確定適當?shù)腡PL增加濃度非常重要，理想狀況是既通過增加藥物 濃度篩選出少數(shù)耐藥細胞又不致于使全部細胞死亡，從而不斷獲得有更高耐藥性的SK0V3 細胞。經(jīng)過探索，在我們的發(fā)明中采用每次增加50nM TPL的方法取得了較好效果，歷時9個 月建立了 SK0V3/TPL耐藥細胞株。用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)、MTT法繪制細胞生長曲線、 檢測細胞耐藥指數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)，SK0V3/TPL細胞大小、形態(tài)不一，生長速度明顯減慢，對TPL 明顯耐藥，耐藥指數(shù)（RI)為50. 95,除對TPL耐藥外，對MTX、5-FU、Ara-C、GEM、VP-16、MMC、 ADM、MIT、TAX、VCR 有交叉耐藥。
[0013] 本發(fā)明提供了所述的卵巢癌多藥耐藥細胞株在腫瘤相關(guān)研宄中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0014] 圖1是倒置相差顯微鏡下SK0V3活細胞觀察圖；
[0015] 圖2是倒置相差顯微鏡下SK0V3/TPL活細胞觀察圖；
[0016] 圖3是光學(xué)顯微鏡下SK0V3細胞爬片HE染色觀察圖；
[0017] 圖4是光學(xué)顯微鏡下SK0V3/TPL細胞爬片HE染色觀察圖；
[0018] 圖5是SK0V3及SK0V3/TPL細胞生長曲線圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0020] 實施例1卵巢癌多藥耐藥細胞株SK0V3/TPL的誘導(dǎo)建立
[0021] SK0V3/TPL多藥耐藥細胞株按以下步驟建立：（1)人卵巢癌SK0V3細胞株，復(fù)蘇后 用1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)于37°C、5%C0 2、95% 濕度條件下培養(yǎng)；（2)取對數(shù)生長期SK0V3細胞，換新鮮培養(yǎng)液，加入雷公藤甲素（TPL)Ji 其作用濃度為ΙΟηΜ，在37°C、5% C02、95%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持IOnM藥物 濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生長、傳代；（3)適當增加 TPL的作用濃度，在37°C、5% C02、95 %濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩(wěn)定生 長、傳代；（4)重復(fù)步驟（3)直到獲得能在400nM TPL中穩(wěn)定生長、傳代及復(fù)蘇的SK0V3/TPL 細胞株。每階段增加 TPL量為50nM。
[0022] 當細胞依次對 10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM TPL穩(wěn) 定耐藥后，及時凍存該濃度耐藥細胞于液氮中。凍存液由20%小牛血清、10% DMS0、70% 1640培養(yǎng)液組成，凍存過程應(yīng)逐步降溫，采取4°C 30分鐘一-20°C 1小時一-70°C過夜一 液氮的順序進行。凍存細胞的復(fù)蘇按以下程