本申請屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗合成酶綜合征ej自身抗體的檢測方法與應(yīng)用，具體地涉及抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀檢測方法和免疫印跡檢測方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

特發(fā)性炎癥性肌病(idiopathicinflammatorymyopathies，iim),又稱肌炎(myositis),是一組以侵害骨骼肌為主的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。根據(jù)最近的診斷分類標(biāo)準(zhǔn)，iim可分為多發(fā)性肌炎(polymyositis，pm)、皮肌炎(dermatomyositis，dm)、免疫介導(dǎo)的壞死性肌炎(immune-mediatednecrotizingmyopathy，imnm)、非特異性肌炎(nonspecificmyositis，nsm)和包涵體肌炎(inclusionbodymyositis，sibm)。臨床特點(diǎn)表現(xiàn)為四肢近端肌無力、特征性皮疹、系統(tǒng)性損害以及血清中存在多種自身抗體(marinosc.dalakas.inflammatorymusclediseases.nengljmed2015；372:1734-1747)。肌炎患者的自身抗體主要分為肌炎特異性自身抗體(myositisspecificautoantibodies，msas)和肌炎相關(guān)性自身抗體(myositisassociatedautoantibodies,maas)。maas多見于自身免疫性結(jié)締組織病的重疊綜合征，而msas一般僅見于肌炎患者，具有高度選擇性、排他性，兩種msas很少出現(xiàn)在同一個(gè)患者。

至今已經(jīng)被鑒定的msas大約有17種，盡管目前肌炎的診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)并不包括自身抗體的檢測，但是越來越多的研究顯示肌炎特異性自身抗體與肌炎患者特異的臨床表現(xiàn)具有相關(guān)性，它們可能作為肌炎的血清標(biāo)志物，輔助肌炎的診斷與疾病分型，甚至可以預(yù)測臨床并發(fā)癥以及對治療的反應(yīng)性(betteridgez,mchughn.myositis-specificautoantibodies:animportanttooltosupportdiagnosisofmyositis.jinternmed2016；280:8-23)。

氨基酰轉(zhuǎn)運(yùn)rna合成酶(aminoacyl-trnasynthetase，ars)是一類存在細(xì)胞漿的蛋白質(zhì)，通過催化氨基酸連接到特異的轉(zhuǎn)運(yùn)rna從而參與蛋白質(zhì)的合成。抗氨基酰轉(zhuǎn)運(yùn)rna合成酶的自身抗體，是特發(fā)性炎癥性肌病中所占比例最多的一類肌炎特異性自身抗體，陽性率約為25-35％。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8種抗合成酶自身抗體如jo-1、pl12、pl7、ej、oj、ha、ks和zo，其中抗jo-1抗體是最常見的，約在15-30％的特發(fā)性炎癥性肌病患者中存在，在60-70％的間質(zhì)性肺疾病患者中檢測到，其余的所有抗體約在10％的特發(fā)性炎癥性肌病患者中存在(mahlerm,millerfw,fritzlermj.idiopathicinflammatorymyopathiesandtheanti-synthetasesyndrome:acomprehensivereview.autoimmunrev.2014,13:367-71.)。最初的研究顯示抗合成酶抗體只存在特發(fā)性炎癥性肌病患者中，因此把它們歸為肌炎特異性自身抗體。后來的研究發(fā)現(xiàn)抗合成酶抗體在其他的自身免疫結(jié)締組織疾病中也存在，含有這類抗體的患者具有共同的特異性的臨床表現(xiàn)，包括肌炎、間質(zhì)性肺疾病、關(guān)節(jié)炎、發(fā)熱、雷諾氏現(xiàn)象和技工手等臨床表現(xiàn),統(tǒng)稱為抗合成酶綜合征(anti-synthetasesyndrome)。肌肉的組織學(xué)研究也顯示抗合成酶綜合征是特發(fā)性炎癥性肌病中獨(dú)立的一個(gè)亞型。

抗ej抗體是抗合成酶抗體中的一種，靶抗原是甘氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)rna合成酶(targoffin.autoantibodiestoaminoacyl-transferrnasynthetasesforisoleucineandglycine.twoadditionalsynthetasesareantigenicinmyositis.jimmunol.1990，144:1737-43.)。第一個(gè)發(fā)現(xiàn)ej抗體陽性的患者有雷諾氏現(xiàn)象、輕度的指端硬化和無力，肌酸激酶水平增高，但是沒有肌活檢和肌電圖的檢查，也不伴有間質(zhì)性肺疾病。targoffin用放射免疫沉淀方法分析了637例患者(包括肌炎和其他疾病)的ej抗體，發(fā)現(xiàn)5例患者存在ej抗體，他們都具有肌炎、皮肌炎的典型皮疹和間質(zhì)性肺疾病等臨床表現(xiàn)。其中一個(gè)患者還診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡，該患者出現(xiàn)肌炎之前的4個(gè)月ej抗體呈陽性(targoffin,trieuep,plotzph,millerfw.antibodiestoglycyl-transferrnasynthetaseinpatientswithmyositisandinterstitiallungdisease.arthritisrheum.1992，35:821-30.)。一個(gè)多中心的研究顯示50％的ej抗體陽性的患者被診斷為皮肌炎和無肌病性皮肌炎(hamaguchiy,fujimotom,matsushitat,etal.commonanddistinctclinicalfeaturesinadultpatientswithanti-aminoacyl-trnasynthetaseantibodies:heterogeneitywithinthesyndrome.plosone2013；8:e60442)。因此ej自身抗體的檢測對于肌炎的分類是非常重要的。

檢測ej自身抗體的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、放射標(biāo)記的免疫沉淀方法、免疫印跡法，上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：(1)酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)。elisa雖然為自身抗體的檢測提供敏感性高、快速、高通量且能夠定量的方法，但是目前ej自身抗體尚無商業(yè)化的elisa試劑盒，自行包被抗原需要高度純化的ej抗原(商業(yè)化購買或?qū)嶒?yàn)室表達(dá)純化)，而且抗原包被的條件需要最優(yōu)化，容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；同時(shí)elisa試劑盒需要進(jìn)行批量檢測，對于發(fā)病率不是很高的肌炎，不適合作為臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測。(2)采用商業(yè)化的免疫印跡膜條或者購買純化的抗原蛋白進(jìn)行免疫印跡,但是這些膜條對抗體滴度不能進(jìn)行定量而且在國內(nèi)的推廣還有限。(3)免疫沉淀法是檢測肌炎特異性自身抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，一般是采用s35標(biāo)記hela細(xì)胞或k562細(xì)胞，然后將待測血清與細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，sds聚丙烯酰胺凝膠電泳分離沉淀物，放射自顯影，這是檢測ej自身抗體的金標(biāo)準(zhǔn)。作為金標(biāo)準(zhǔn)的放射標(biāo)記免疫沉淀法有很高的特異性和敏感性，而且這種方法沉淀的是以天然構(gòu)象存在的抗原以及與靶抗原相互作用的蛋白分子，但是放射同位素只能用于裝備良好的實(shí)驗(yàn)室，而且這種方法難以區(qū)別分子量接近的不同種類的自身抗原。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，解決目前國內(nèi)沒有商業(yè)化檢測ej抗體的elisa試劑盒以及免疫印跡膜條不能測定滴度的缺陷，以及自行包被ej抗原的elisa試劑盒高成本、高假陽性率和放射標(biāo)記免疫沉淀法的安全性問題，本發(fā)明的目的在于提供抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射性檢測方法，具體地包括抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀檢測方法和免疫印跡檢測方法。

本發(fā)明的目的還在于提供抗合成酶綜合征ej自身抗體的上述非放射性檢測方法的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射性檢測方法，包括：抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀檢測方法和免疫印跡檢測方法。

所述的抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀檢測方法，包括以下步驟：

(1)將帶有flag標(biāo)簽的penter-ej質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎(hek)293細(xì)胞48小時(shí)，通過westernblot法用flag抗體檢測所述penter-ej質(zhì)粒在所述人胚腎(hek)293細(xì)胞中的過表達(dá)；

(2)用proteing磁珠分別與20ulej抗體陽性的抗合成酶綜合征患者血清或健康對照血清進(jìn)行結(jié)合，然后與步驟(1)中所述過表達(dá)ej的hek293細(xì)胞裂解液孵育進(jìn)行抗原吸附，洗脫后進(jìn)行sds-page凝膠電泳，用所述flag抗體進(jìn)行檢測。

所述的抗合成酶綜合征ej自身抗體的免疫印跡檢測方法，包括以下步驟：

(1)將帶有flag標(biāo)簽的penter-ej質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎(hek)293細(xì)胞48小時(shí)，通過westernblot法用flag抗體檢測所述penter-ej質(zhì)粒在所述人胚腎(hek)293細(xì)胞中的過表達(dá)；

(2)將20ug步驟(1)中所述過表達(dá)ej的hek293細(xì)胞裂解液進(jìn)行sds-page凝膠電泳，用ej抗體陽性血清作為一抗，用兔抗人iggh&l作為二抗進(jìn)行檢測。

所述的抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射性檢測方法的應(yīng)用，用于檢測肌炎患者的抗ej自身抗體。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本申請的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本申請的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1是本申請所使用的penter-ej質(zhì)粒圖譜；

圖2是本申請測序證實(shí)penter-ej質(zhì)粒中ej序列和讀碼框的準(zhǔn)確性；

圖3是本發(fā)明westernblot法檢測penter-ej質(zhì)粒在hek293細(xì)胞的過表達(dá)；

圖4是本發(fā)明采用ej抗體陽性的抗合成酶綜合征患者血清和健康對照血清與過表達(dá)ej的hek293細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，westernblot檢測沉淀的ej蛋白，從而證實(shí)抗合成酶綜合征患者血清中ej抗體能夠識別hek293細(xì)胞中的含flag標(biāo)簽的ej；

圖5是本發(fā)明將過表達(dá)ej的hek293細(xì)胞裂解液進(jìn)行sds-page凝膠電泳，用ej抗體陽性血清作為一抗，用兔抗人iggh&l作為二抗進(jìn)行檢測，證實(shí)ej抗體陽性血清能夠識別hek293細(xì)胞中的帶有flag標(biāo)簽的ej；

圖6是本發(fā)明的非放射標(biāo)記免疫沉淀方法篩選肌炎患者血清中的ej抗體，im為肌炎。

具體實(shí)施方式

以下將配合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本申請的實(shí)施方式，借此對本申請如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀檢測方法

1、材料

penter-ej質(zhì)粒(維真生物公司，ch810182)

flag抗體(sigma-aldrich公司，f1804)

pureproteomeproteing磁珠(millipore公司，lskmagg10)

2、方法

抗合成酶綜合征ej自身抗體的非放射標(biāo)記免疫沉淀檢測方法，包括以下步驟：

(1)將帶有flag標(biāo)簽的penter-ej質(zhì)粒(如附圖1所示)進(jìn)行測序，證實(shí)ej序列和讀碼框的準(zhǔn)確性(如附圖2所示)；

(2)將2ugpenter-ej、4ugpenter-ej分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎(hek)293細(xì)胞48小時(shí)，sds裂解液裂解hek293細(xì)胞，進(jìn)行sds-page凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，采用flag抗體進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染penter-ej質(zhì)粒的hek293細(xì)胞中有約為75kda的特異性條帶(如附圖3所示)，以上結(jié)果提示penter-ej質(zhì)粒能在hek293細(xì)胞中過表達(dá)，表達(dá)的蛋白質(zhì)約為75kda的帶有flag標(biāo)簽的ej；

(3)取50ulproteing磁珠懸液分別與20ulej抗體陽性的抗合成酶綜合征患者血清或健康對照血清于4℃持續(xù)混勻16h以捕獲抗體，反應(yīng)后用500μlpbs(含0.1％20)洗滌上述磁珠3-5次，加入200ug過表達(dá)ej的hek293細(xì)胞裂解液，并用含1％蛋白酶抑制劑的ripa裂解液補(bǔ)足體積至500ul，室溫下旋轉(zhuǎn)混勻1-2小時(shí)進(jìn)行抗原吸附；重復(fù)上述清洗磁珠步驟3-5次，向其中加入40μl1×sds-pageloadingbuffer混合均勻，95℃加熱10min，立即收集上清液至新的ep管；然后將上述樣品于10％sds-page電泳后轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，加入flag抗體雜交，ecl化學(xué)發(fā)光，證實(shí)抗合成酶綜合征患者血清的ej抗體能夠特異性地將hek293細(xì)胞中過表達(dá)的帶flag標(biāo)簽的ej沉淀(如附圖4所示)。

實(shí)施例2抗合成酶綜合征ej自身抗體的免疫印跡檢測方法

1、材料

penter-ej質(zhì)粒(維真生物公司，ch810182)

flag抗體(sigma-aldrich公司，f1804)

ej抗體陽性血清(1:1000稀釋)

兔抗人iggh&l(1:5000，abcam公司，ab6759))

2、方法

抗合成酶綜合征ej自身抗體的免疫印跡檢測方法，包括以下步驟：

(1)將2ugpenter-ej，4ugpenter-ej分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞48小時(shí)，sds裂解液裂解hek293細(xì)胞，進(jìn)行sds-page凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，采用flag抗體進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染penter-ej質(zhì)粒的hek293細(xì)胞中有約為75kda的特異性條帶(如附圖3所示)，以上結(jié)果提示penter-ej質(zhì)粒能在hek293細(xì)胞中過表達(dá)，表達(dá)的蛋白質(zhì)約為75kda的帶有flag標(biāo)簽的ej；

(2)將30ug和60ug過表達(dá)ej的hek293細(xì)胞裂解液或未轉(zhuǎn)染penter-ej的hek293細(xì)胞裂解液進(jìn)行sds-page凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，用ej抗體陽性血清作為一抗4℃孵育過夜，用兔抗人iggh&l作為二抗室溫孵育1h，ecl化學(xué)發(fā)光，發(fā)現(xiàn)ej抗體陽性血清能夠特異性識別未轉(zhuǎn)染penter-ej質(zhì)粒的hek293細(xì)胞中約75kda的蛋白質(zhì)，說明ej這種合成酶在hek293細(xì)胞有內(nèi)源性表達(dá)；同時(shí)ej抗體陽性血清也能夠特異性識別帶有flag標(biāo)簽的ej(如附圖5所示)。

實(shí)施例3檢測200例肌炎患者血清的ej抗體的陽性率

肌炎患者血清的ej抗體的陽性率，包括以下步驟：

(1)接種30％hek293細(xì)胞于75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)小于24小時(shí)；

(2)將20ugpenter-ej質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞48小時(shí)；

(3)采用1ml含蛋白酶抑制劑的ripa裂解液裂解hek293細(xì)胞，蛋白進(jìn)行定量；

(4)采用flag抗體證實(shí)hek293細(xì)胞中過表達(dá)的ej；

(5)取20ul炎性肌病患者待測血清、陽性血清、陰性血清分別與200ug過表達(dá)ej的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，進(jìn)行sds-page凝膠電泳，然后用flag抗體進(jìn)行檢測，確定ej抗體在肌炎患者中的陽性率約為1.5％(如附圖6所示)。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。