專利名稱：具有抗糖尿病作用的物質(zhì)的探索方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖尿病治療劑和胰島素促泌劑的治療方法。
背景技術(shù)：
糖尿病為由于胰島素分泌不足或其靶細(xì)胞側(cè)的感受能力低下等導(dǎo)致的以糖代謝為中心的代謝異常，它的最大特征是引起高血糖。高血糖如果長(zhǎng)期持續(xù)，就會(huì)產(chǎn)生以血管障礙為主要原因的，視網(wǎng)膜癥、腎病、神經(jīng)障礙等各種臟器或神經(jīng)的嚴(yán)重的并發(fā)癥。因此，糖尿病的治療中控制血糖值使其維持在正常值極為重要，長(zhǎng)期以來(lái)就致力于研究其實(shí)現(xiàn)方法。
糖尿病中，發(fā)病遲緩，并不一定必須采用胰島素治療來(lái)維持生命的類型(II型糖尿病)，可以通過(guò)運(yùn)動(dòng)療法或食物療法和藥物組合來(lái)控制血糖值進(jìn)行治療。作為藥物，作為口服降糖劑之一的磺酰脲類胰島素促泌劑在臨床上得到廣泛應(yīng)用。此外，那格列奈或瑞格列奈之類的所謂非磺酰脲K+ATP通道阻滯劑類的胰島素促泌劑也在市售。
磺酰脲類藥物是通過(guò)促進(jìn)胰臟β細(xì)胞的胰島素分泌來(lái)降低血糖值的II型糖尿病的治療藥，降糖作用的強(qiáng)弱和作用持續(xù)時(shí)間等各異的多種磺酰脲類藥物已廣為人知[Joslin’s Diabetes Mellitus 13thEdition，29，505-525(1994)]。
但磺酰脲類藥物共有的副作用或并發(fā)癥，或?qū)酋ｋ孱愃幬锏臒o(wú)效癥也被發(fā)現(xiàn)[Joslin’s Diabetes Mellitus 13thEdition，29，505-525(1994)]。
使用磺酰脲類藥物時(shí)主要的并發(fā)癥可列舉出如低血糖癥[Bio.Med.J.，296，949-950(1988)、Joslin’s Diabetes Mellitus13thEdition，29，505-525(1994)]。
現(xiàn)有可利用的磺酰脲類藥物或那格列奈和瑞格列奈的所謂非磺酰脲K+ATP通道阻滯劑均為非血糖值依賴性促胰島素分泌，如果用量錯(cuò)誤則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的低血糖，或出現(xiàn)不能充分控制血糖值等問(wèn)題，因而不一定能滿足要求。有報(bào)道說(shuō)，在以往的6個(gè)月內(nèi)，接受過(guò)磺酰脲類藥物的患者的20.2％出現(xiàn)低血糖癥狀[Acta.Med.Scand.Supp1.605，7-48(1977)、Joslin’s Diabetes Mellitus 13thEdition，29，505-525(1994)]。另外，上述患者中有6％每月都會(huì)經(jīng)歷低血糖。
由上述理由來(lái)看，期待能開(kāi)發(fā)出與磺酰脲類藥物或那格列奈和瑞格列奈的所謂非磺酰脲K+ATP通道阻滯劑不同的，不會(huì)引起低血糖等并發(fā)癥的糖尿病治療劑。
有報(bào)道，具有與上述非磺酰脲K+ATP通道阻滯劑不同結(jié)構(gòu)的稠合嘌呤衍生物、稠環(huán)吡嗪衍生物等能夠成為可以相應(yīng)于血糖值促進(jìn)胰島素分泌的降糖劑[WO00/01388、WO01/47931、特開(kāi)2000-154139]。但是相應(yīng)于血糖值促進(jìn)胰島素分泌的降糖劑效率高的發(fā)現(xiàn)方法還未可知。
稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的特異結(jié)合，及該結(jié)合活性與稠合嘌呤衍生物的血糖低下作用之間的關(guān)系也未可知。
具有用序列號(hào)1～3表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(以下也稱p31)均以具有NADPH依賴性的視黃醇和短鏈醇的氧化還原酶活性的酶而眾所周知[Biochimica et Biophysica Acta，1338，47(1997)]，但該酶與糖尿病的相關(guān)性尚無(wú)報(bào)道。
三嗪衍生物具有激酶抑制作用，可以用于糖尿病的治療是已知的(WO01/47921)，但未表現(xiàn)出有具體的糖尿病治療作用。并且三嗪衍生物具有促胰島素分泌作用也屬未知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種不引起低血糖等并發(fā)癥的糖尿病治療藥及胰島素促泌劑的探索方法。
本發(fā)明等人深入研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稠合嘌呤衍生物的胰島素促泌活性與稠合嘌呤衍生物和與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的結(jié)合活性相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及以下的(1)～(24)項(xiàng)。
(1)具有抗糖尿病作用物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，選自下述通式(I)或通式(II)表示的化合物中的化合物(以下簡(jiǎn)稱稠合嘌呤衍生物)和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而阻礙稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
(式(I)中，R1A表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基，R2A表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基，R3A表示氫原子、低級(jí)烷基或取代或非取代芳烷基，X1和X2分別獨(dú)立地表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基，n表示0～3的整數(shù)) {式(II)中，X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基)或N＝C-W[式中，W表示鹵原子、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、-NR4R5(式中，R4和R5相同或不同，表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳烷基，或者R4和R5與相鄰的氮原子一起形成雜環(huán)基)、-OR6(式中，R6表示取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳烷基)、-SR6a(式中R6a與上述R6同義)、取代或非取代低級(jí)烷基或氰基]，R2表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代的芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與上述R4和R5同義)、-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示鹵原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與上述R4和R5同義)、或-CHO，R3表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或低級(jí)烷氧基烷基，n表示0～3的整數(shù)，V1表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代芳香族雜環(huán)基，V2表示取代低級(jí)烷基、或取代或非取代芳香族雜環(huán)基；V1表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基、且(a)X...Y...Z表示R1aN-C＝O(式中，R1a表示在上述R1的定義中除取代低級(jí)烷基以外的基團(tuán))，R2表示取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與上述同義)、-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal與上述同義)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與上述R4和R5同義)、或-CHO，或者(b)X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1與上述同義)，R3表示低級(jí)烷氧基烷基，或者(c)X...Y...Z表示R1bN-C＝O(式中，R1b表示取代低級(jí)烷基)，或者(d)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W與上述同義)，R2表示取代或非取代低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與上述同義)、或-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示鹵原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與上述同義)、或-CHO，或者(e)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W與上述同義)，R3表示低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、低級(jí)烷氧基烷基時(shí)，V2也可以表示低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基}(2)具有抗糖尿病作用物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，上述(1)的稠合嘌呤衍生物和與該稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而阻礙該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
(3)與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，上述(1)的稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物與胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而阻礙稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物結(jié)合的物質(zhì)的步驟；[5]利用[4]得到的物質(zhì)，選擇與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
(4)與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，上述(1)的稠合嘌呤衍生物和該稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而阻礙稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
(5)使與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)活性變化的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)與上述(1)的稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相接觸時(shí)，該蛋白質(zhì)的活性的步驟；[2]測(cè)定與被檢物質(zhì)不接觸時(shí)該蛋白質(zhì)的活性的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而使該蛋白質(zhì)活性變化的物質(zhì)的步驟。
(6)抑制與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)與上述(1)的稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相接觸時(shí)，該蛋白質(zhì)的活性的步驟；[2]測(cè)定與被檢物質(zhì)不接觸時(shí)該蛋白質(zhì)的活性的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而抑制該蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)的步驟。
(7)使與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)功能變化的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)與上述(1)的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體相接觸時(shí)，該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞應(yīng)答的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下的該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞應(yīng)答的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而使該轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞應(yīng)答發(fā)生變化的物質(zhì)的步驟。
(8)使編碼與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量變化的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)與上述(1)的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體相接觸時(shí)，編碼該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下編碼該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而使編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量發(fā)生變化的物質(zhì)的步驟。
(9)使與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的表達(dá)量變化的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)與上述(1)的稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體相接觸時(shí)，該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的表達(dá)量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的表達(dá)量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而使該蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生變化的物質(zhì)的步驟。
(10)上述(1)～(9)的任意一項(xiàng)的探索方法，稠合嘌呤衍生物為下述式(III)表示的化合物。
(11)上述(2)和(4)～(9)的任意一項(xiàng)探索方法，其特征在于，使用固定了上述(1)的稠合嘌呤衍生物的載體。
(12)上述(11)的探索方法，載體為瓊脂糖凝膠顆粒。
(13)上述(11)或(12)的探索方法，稠合嘌呤衍生物為下述式(IV)表示的化合物。
(14)固定了上述(1)的稠合嘌呤衍生物的載體。
(15)上述(14)的載體，稠合嘌呤衍生物為上述(13)的式(IV)表示的稠合嘌呤衍生物。
(16)上述(14)或(15)的載體，載體為瓊脂糖凝膠顆粒。
(17)上述(2)及(4)～(13)的任意一項(xiàng)所述的探索方法，與上述(1)的稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)為選自下述[i]～[iii]中的任意一種蛋白質(zhì)。
具有用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
在用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中，由1個(gè)以上的氨基酸被缺失、置換、插入或添加而成的氨基酸序列組成，且與上述(1)的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)。
由具有與用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列60％以上相同性的氨基酸序列組成，且與上述(1)的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)。
(18)由上述(1)～(13)和(17)的任意一項(xiàng)探索方法得到的物質(zhì)或該物質(zhì)的可藥用鹽。
(19)含有以上述(18)的物質(zhì)或該物質(zhì)的可藥用鹽為有效成分的藥物。
(20)含有以上述(18)的物質(zhì)或該物質(zhì)的可藥用鹽為有效成分的糖尿病治療藥。
(21)含有以上述(18)的物質(zhì)或該物質(zhì)的可藥用鹽為有效成分的胰島素促泌劑。
(22)含有用下述通式(V)表示的化合物或其可藥用鹽為有效成分的胰島素促泌劑。
[式中，R1B、R2B、R3B相同或不同，表示氨基、單或二取代氨基、或含有N的取代或非取代雜環(huán)基(該雜環(huán)基通過(guò)N原子與三嗪環(huán)結(jié)合)](23)促進(jìn)胰島素分泌的方法，包括以上述(22)的通式(V)表示的化合物或其可藥用鹽的有效量給藥的步驟。
(24)在制造胰島素促泌劑中應(yīng)用的上述(22)的通式(V)表示的化合物或其可藥用鹽的使用。
以下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
1.用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物是指下述通式(I)或通式(II)表示的化合物。
(式(I)中，R1A表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基，R2A表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基，R3A表示氫原子、低級(jí)烷基或取代或非取代芳烷基，X1和X2分別獨(dú)立的表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基，n表示0～3的整數(shù)) {式(II)中，X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基)或N＝C-W[式中，W表示鹵原子、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、-NR4R5(式中，R4和R5相同或不同，表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳烷基，或者R4和R5與相鄰的氮原子一起形成雜環(huán)基)、-OR6(式中，R6表示取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳烷基)、-SR6a(式中R6a與上述R6同義)、取代或非取代低級(jí)烷基或氰基]，R2表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代的芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與上述R4和R5同義)、-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示鹵原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與上述R4和R5同義)、或-CHO，R3表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或低級(jí)烷氧基烷基，n表示0～3的整數(shù)，V1表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代芳香族雜環(huán)基，V2表示取代低級(jí)烷基、或取代或非取代芳香族雜環(huán)基；當(dāng)V1表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基、且(a)X...Y...Z表示R1aN-C＝O(式中，R1a表示在上述R1的定義中除取代低級(jí)烷基以外的基團(tuán))，R2表示取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與上述同義)、-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal與上述同義)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與上述R4和R5同義)、或-CHO，或者(b)X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1與上述同義)，R3表示低級(jí)烷氧基烷基，或者(c)X...Y...Z表示R1bN-C＝O(式中，R1b表示取代低級(jí)烷基)，或者(d)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W與上述同義)，R2表示取代或非取代低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與上述同義)、或-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示鹵原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與上述同義)、或-CHO，或者(e)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W與上述同義)，R3表示低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、低級(jí)烷氧基烷基時(shí)，V2也可以表示低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基}。
式(I)的各基團(tuán)定義中，作為低級(jí)烷基或包括低級(jí)烷基部分的取代基(例如芳烷基)的低級(jí)烷基部分，可使用碳原子數(shù)1～9個(gè)左右的烷基，烷基這一用語(yǔ)中包括由直鏈狀、支鏈狀、環(huán)狀及由它們的組合構(gòu)成的烷基。
環(huán)狀烷基或烷基中的環(huán)狀烷基部分可具有1或2個(gè)以上的環(huán)，作為R1A表示的低級(jí)烷基，優(yōu)選為直鏈或支鏈狀的低級(jí)烷基、1～3個(gè)環(huán)形的環(huán)狀低級(jí)烷基(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、3-去甲金剛烷等)，作為R2A表示的低級(jí)烷基，優(yōu)選為直鏈或支鏈狀的低級(jí)烷基、或單環(huán)性的環(huán)狀低級(jí)烷基。
作為直鏈或支鏈狀的低級(jí)烷基，可列舉出例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基，或正壬基等。作為環(huán)狀的低級(jí)烷基，可列舉出例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、去甲金剛烷基、金剛烷基等。其中優(yōu)選叔丁基或環(huán)戊基。
作為芳基或包括芳基部分的取代基(芳烷基等)中的芳基部分，可使用由單環(huán)性或2個(gè)以上的稠合環(huán)組成的芳香基。更具體來(lái)說(shuō)優(yōu)選為構(gòu)成環(huán)的碳原子數(shù)6～14個(gè)左右的芳基，例如適宜使用苯基、萘基、茚基或蒽基等。作為芳烷基可使用例如碳原子數(shù)7～15個(gè)的芳烷基，更具體來(lái)說(shuō)優(yōu)選為芐基、苯乙基、二苯甲基、萘甲基等。
作為芳香族雜環(huán)基，可使用由單環(huán)性或由2個(gè)以上的稠合環(huán)組成的芳香族雜環(huán)基。對(duì)含于芳香族雜環(huán)的雜原子的種類和個(gè)數(shù)沒(méi)有特殊限定，例如可含有1個(gè)或2個(gè)以上選自氮原子、硫原子及氧原子中的雜原子。更具體來(lái)說(shuō)優(yōu)選為成環(huán)原子數(shù)6～14個(gè)左右的芳香族雜環(huán)基，例如適宜選用呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、三嗪基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹啉基、異喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基，或嘌呤基等。
芳環(huán)或芳香族雜環(huán)上存在取代基時(shí)，其取代基的種類和個(gè)數(shù)沒(méi)有特殊限定，當(dāng)存在2個(gè)以上的取代基時(shí)，它們可以相同或不同。例如環(huán)上可有1～3個(gè)左右的取代基。作為芳環(huán)或芳香族雜環(huán)上的取代基，可列舉出例如取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代低級(jí)鏈烯基、取代或非取代低級(jí)炔基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、羥基、取代或非取代低級(jí)烷氧基、取代或非取代芳烷氧基、取代或非取代芳氧基、取代或非取代芳?；⒌图?jí)烷氧羰基、取代或非取代低級(jí)烷硫基、取代或非取代低級(jí)烷基磺?；Ⅳ然?、取代或非取代氨基甲?；⑷〈蚍侨〈图?jí)烷?；?、鹵素(本說(shuō)明書中所說(shuō)的鹵素可以指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意一種)、硝基、氨基、單或二低級(jí)烷基取代氨基、氰基等。
上述官能基中，作為低級(jí)烷基或包括低級(jí)烷基部分的官能基(例如芳烷基、低級(jí)烷氧基、芳烷氧基、低級(jí)烷氧羰基、低級(jí)烷硫基、低級(jí)烷基磺酰基、低級(jí)烷酰基、單或二低級(jí)烷基取代氨基等)的低級(jí)烷基，可使用上述說(shuō)明的基團(tuán)。低級(jí)烷基或低級(jí)烷基部分有取代基時(shí)，其取代基的個(gè)數(shù)和種類沒(méi)有特殊限定，當(dāng)存在2個(gè)以上的取代基時(shí)，它們可以相同或不同。例如可有1～3個(gè)左右的取代基。這樣的取代基可列舉出例如羥基、鹵原子、羧基、磺基、磷?；?、及由這些酸性基衍生而來(lái)的酯(低級(jí)烷酯、芳烷基酯、芳基酯等)等。作為有取代基的烷基的例子，更具體來(lái)說(shuō)有羥乙基、三氟甲基等。而低級(jí)烷基取代氨基中的2個(gè)烷基可以相同或不同。
此外，上述官能基中，芳烷基或芳烷氧基的芳烷基部分與上述芳烷基同義，芳基、芳氧基、芳?；姆蓟糠峙c上述芳基同義。作為低級(jí)鏈烯基，可使用直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)2～6的鏈烯基。可使用例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、甲基丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、戊烯基、己烯基等。作為低級(jí)炔基，可使用直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)2～6的炔基?？墒褂美缫胰不?、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。低級(jí)鏈烯基或炔基中的不飽和鍵的個(gè)數(shù)沒(méi)有特殊限定，但優(yōu)選為1個(gè)。
上述低級(jí)鏈烯基、低級(jí)炔基、芳烷基、芳基、芳烷氧基、芳氧基、芳?；哂腥〈鶗r(shí)，取代基的個(gè)數(shù)、種類或取代位置沒(méi)有特殊限定，當(dāng)含有2個(gè)以上的取代基時(shí)，它們可以相同或不同。例如可有1～3個(gè)左右的取代基，作為取代基，作為關(guān)于低級(jí)烷基的取代基可采用舉例說(shuō)明的基團(tuán)。
此外，在上述的通式(I)中，X1和X2的取代位置沒(méi)有特殊限定，分別可以取代環(huán)上的任意位置。并且，當(dāng)X1和X2為除氫原子以外的取代基時(shí)，它們結(jié)合的碳原子的立體構(gòu)型為S型或R型均可。n優(yōu)選為0。
式(II)的各基團(tuán)定義中，作為低級(jí)烷基、低級(jí)烷硫基、低級(jí)烷氧羰基和低級(jí)烷氧基烷基的低級(jí)烷基部分，包括碳原子數(shù)1～10個(gè)左右的直鏈狀、支鏈狀、環(huán)狀和由它們的組合構(gòu)成的烷基。環(huán)狀的低級(jí)烷基可具有1個(gè)或2個(gè)以上的環(huán)。作為直鏈或支鏈狀的低級(jí)烷基，可列舉出例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。作為環(huán)狀的低級(jí)烷基，可列舉出例如環(huán)丙基、環(huán)丙甲基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、1-甲基環(huán)己基、4-甲基環(huán)己基、去甲金剛烷基、金剛烷基、二環(huán)[2.2.1]庚基、二環(huán)[2.2.2]辛基、二環(huán)[3.3.0]辛基、二環(huán)[3.3.1]壬基等。
低級(jí)烷氧基烷基和芳烷基的亞烷基部分，與上述直鏈狀或支鏈狀的低級(jí)烷基中去掉一個(gè)氫原子者同義。
芳基和芳烷基的芳基部分由單環(huán)性或2個(gè)以上的稠合環(huán)構(gòu)成，可列舉出構(gòu)成環(huán)的碳原子數(shù)6～14個(gè)左右的例如苯基、萘基、茚基或蒽基等。
作為芳香族雜環(huán)基，可列舉出例如含有至少1個(gè)選自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的5元環(huán)或6元環(huán)的單環(huán)性芳香族雜環(huán)基、3～8元的環(huán)稠合而成的二環(huán)或三環(huán)性環(huán)中含有至少1個(gè)選自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的稠環(huán)性芳香族雜環(huán)基等。更具體來(lái)說(shuō)可列舉出構(gòu)成環(huán)的碳原子數(shù)為5～14個(gè)左右的，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、三嗪基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹啉基、異喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基，或嘌呤基等。
作為脂環(huán)式雜環(huán)基，可列舉出例如含有至少1個(gè)選自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的5元環(huán)或6元環(huán)的單環(huán)性脂環(huán)式雜環(huán)基、3～8元的環(huán)稠合而成的二環(huán)或三環(huán)性環(huán)中含有至少1個(gè)選自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的稠環(huán)性脂環(huán)式雜環(huán)基等。更具體來(lái)說(shuō)可列舉出吡咯烷基、2，5-二氧吡咯烷基、噻唑烷基、噁唑烷基、2-氧基噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、嗎啉基、硫代碼啉基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫呋喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、四氫喹喔啉基、八氫喹啉基、二氫吲哚基、1，3-二氧異吲哚基、1，3-二氧雜戊環(huán)、1，3-二氧雜戊環(huán)基-2-螺環(huán)戊基等。
作為與相鄰的氮原子一起形成的雜環(huán)基，可列舉出例如含有至少1個(gè)氮原子的5元或6元的單環(huán)性雜環(huán)基(該單環(huán)雜環(huán)基也可含有其它的氮原子、氧原子或硫原子)、3～8元的環(huán)稠合而成的二環(huán)或三環(huán)性環(huán)中含有至少1個(gè)選自氮原子、氧原子及硫原子中的原子的稠環(huán)性脂環(huán)式雜環(huán)基(該單環(huán)雜環(huán)基也可含有其它的氮原子、氧原子或硫原子)等。更具體來(lái)說(shuō)可列舉出吡咯烷基、噻唑烷基、噁唑烷基、哌啶基、高哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、嗎啉基、硫代碼啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、八氫喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、吲哚基、異吲哚基、嘌呤基、二氫吲哚基、吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、咪唑基等。
作為鹵素，可列舉出氟、氯、溴、碘的各原子。
作為取代芳基、取代芳烷基、取代芳香族雜環(huán)基和取代脂環(huán)式雜環(huán)基的取代基，可相同或不同，可列舉出取代數(shù)1～3的取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳氧基、取代或非取代芳?；?、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳烷氧基、取代或非取代低級(jí)鏈烯基、取代或非取代低級(jí)炔基、取代或非取代低級(jí)烷氧基、取代或非取代低級(jí)烷氧羰基、取代或非取代低級(jí)烷硫基、取代或非取代低級(jí)烷基磺酰基、取代或非取代低級(jí)烷酰基、單或二低級(jí)烷基取代氨基甲酰基、單或二低級(jí)烷基取代氨基、鹵原子、羧基、羥基、硝基、氨基、氰基等。此處，作為低級(jí)鏈烯基，可列舉出直鏈狀或支鏈狀的碳原子數(shù)2～6的，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、甲基丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、戊烯基、己烯基等。作為低級(jí)炔基，可列舉出直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)2～6的，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。低級(jí)鏈烯基和低級(jí)炔基中的不飽和鍵的個(gè)數(shù)沒(méi)有特殊限定，但優(yōu)選為1個(gè)。低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷氧羰基、低級(jí)烷硫基、低級(jí)烷基磺?；?、低級(jí)烷?；位蚨图?jí)烷基取代氨基甲?；皢位蚨图?jí)烷基取代氨基的低級(jí)烷基部分與上述低級(jí)烷同義。芳烷基和芳烷氧基的亞烷基部分與上述亞烷基部分同義。芳基、芳氧基和芳?；姆蓟糠峙c上述芳基同義。鹵素與上述鹵素同義。作為取代低級(jí)烷基、取代芳基、取代芳氧基、取代芳?；⑷〈纪榛?、取代芳烷氧基、取代低級(jí)鏈烯基、取代低級(jí)炔基、取代低級(jí)烷氧基、取代低級(jí)烷氧羰基、取代低級(jí)烷硫基、取代低級(jí)烷基磺酰基和取代低級(jí)烷?；械娜〈?，可列舉出相同或不同的取代數(shù)1～3的羥基、與上述同義的鹵素、羧基、磺基、磷?；⒓坝蛇@些酸性基衍生而來(lái)的酯(低級(jí)烷酯、芳烷基酯、芳基酯等；這些酯的低級(jí)烷基部分、芳烷基部分和芳基部分分別與上述同義)、二低級(jí)烷基取代氨基甲酰和二低級(jí)烷基取代氨基中，分別與氨基甲酰和氨基結(jié)合的2個(gè)低級(jí)烷基可以相同也可以不同。
作為取代低級(jí)烷基的取代基，可列舉出相同或不同的取代數(shù)1～3的低級(jí)烷氧基、羥基、氰基、迭氮基、羧基、磷?；蛴蛇@些酸性基衍生而來(lái)的酯(低級(jí)烷酯、芳烷基酯、芳基酯等；這些酯的低級(jí)烷基部分、芳烷基部分和芳基部分分別與上述同義)、低級(jí)烷硫基、低級(jí)烷氨基羰基、低級(jí)烷氧羰基、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、-NR11R12(式中，R11和R12相同或不同，表示氫原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷?；?、芳基、芳烷基或芳烷氧基，或者R11和R12與相鄰的氮原子一起形成雜環(huán)基)、鹵素、可被低級(jí)烷基取代的芳基磺酰氧基、低級(jí)烷基磺?；⒌图?jí)烷基磺酰氧基、三氟甲基磺酰氧基等。
這里，低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷硫基、低級(jí)烷氨基羰基、低級(jí)烷氧羰基、低級(jí)烷酰基、可被低級(jí)烷基取代的芳基磺酰氧基、低級(jí)烷基磺?；偷图?jí)烷基磺酰氧基的低級(jí)烷基部分與上述低級(jí)烷基同義。芳基、芳烷基、芳烷氧基和芳基磺酰氧基的芳基部分與上述芳同義。芳烷基的亞烷基部分與上述亞烷基部分同義。鹵素、芳香族雜環(huán)基、脂環(huán)式雜環(huán)基和與相鄰的氮原子一起形成的雜環(huán)基與上述同義。取代芳香族雜環(huán)基和取代脂環(huán)式雜環(huán)基的取代基與上述同義。
此外，式(II)中，V1或V2的取代位置沒(méi)有特殊限定，分別可以在環(huán)上的任意位置取代。并且，當(dāng)V1或V2為除氫原子以外的取代基時(shí)，它們結(jié)合的碳原子的立體構(gòu)型為S型或R型均可。n優(yōu)選為0。
作為可用于本發(fā)明的化合物，可列舉出優(yōu)選為，式(I)中，R1為氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基，R2為低級(jí)烷基，或取代或非取代芳基，R3為氫原子，或取代或非取代芳烷基，X1為氫原子、低級(jí)烷基、或取代或非取代芳烷基，和X2為氫原子，n為0的化合物，或者式(II)中，X...Y...Z為R1N-C＝O(式中，R1表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基)，R2為氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代的芳香族雜環(huán)基，R3為氫原子或低級(jí)烷基，V1為氫原子，V2為取代低級(jí)烷基，n為0的化合物；更優(yōu)選為，式(I)中，R1為氫原子、正丙基、環(huán)戊基或叔丁基，R2為正丙基、乙基或芐基，R3為氫原子、甲基或芐基，X1為氫原子、低級(jí)烷基，或取代或非取代芳烷基，X2為氫原子，n為0的化合物，或者式(II)中，X...Y...Z為R1N-C＝O(式中，R1表示乙基、正丙基、環(huán)丙基甲基或芐基)，R2為正丙基、環(huán)丁基或環(huán)戊基，R3為氫原子，V1為氫原子，V2為吡啶甲基，n為0的化合物。
作為用于本發(fā)明的更優(yōu)選的稠合嘌呤衍生物，具體來(lái)說(shuō)，可列舉如下述表1中的化合物。
表1-1 化合物號(hào)R1R2R3X11 (CH2)2CH3H 2 (CH2)2CH3H 3 (CH2)2CH3H 4 (CH2)2CH3H 5 (CH2)2CH3HH6 (CH2)2CH3H 7 (CH2)2CH3H 8 (CH2)2CH3H 9 (CH2)2CH3H 10(CH2)2CH3H 11(CH2)2CH3H 12(CH2)2CH3H 13(CH2)2CH3H 14(CH2)2CH3H
表1-2 化合物號(hào) R1R2R3X115 (CH2)2CH3H 16 (CH2)2CH3H 17 (CH2)2CH3H 18 (CH2)2CH3H 19 (CH2)2CH3H 20 (CH2)2CH3H 26 (CH2)2CH3H
表1-3 化合物號(hào) R1R2R3X127 (CH2)2CH3H 28 (CH2)2CH3H 29 (CH2)2CH3CH3 30 (CH2)2CH3H 31 (CH2)2CH3H 32
表1-4 化合物號(hào) R1R2R3X133 H (CH2)2CH3H 34 H (CH2)2CH3 35(CH2)2CH3H 36 (CH2)2CH3H 37(CH2)2CH3H 38 (CH2)2CH3H 39 (CH2)2CH3H 40(CH2)2CH3H 41 (CH2)2CH3H 42 (CH2)2CH3H 43(CH2)2CH3H 44 (CH2)2CH3H 45 (CH2)2CH3H
表1-5 化合物號(hào)R1R2R3X146 (CH2)2CH3H 47(CH2)2CH3H 48 (CH2)2CH3H 49 (CH2)2CH3H 50(CH2)2CH3H 51 (CH2)2CH3H 52 (CH2)2CH3H 53 (CH2)2CH3H 54 (CH2)2CH3H 55 (CH2)2CH3H 56 (CH2)2CH3H 57 (CH2)2CH3H
表1-6 化合物號(hào)R1R2R3X158 (CH2)2CH3H 59(CH2)2CH3H 60 (CH2)2CH3H 61(CH2)2CH3H 62(CH2)2CH3H 63(CH2)2CH3H 64(CH2)2CH3H 65(CH2)2CH3H
表1-7 化合物號(hào)R1R2R3X166 (CH2)2CH3H 67(CH2)2CH3H 68(CH2)2CH3H 69(CH2)2CH3H 70(CH2)2CH3H 71 (CH2CH3H 72 H73 (CH2)2CH3H 74 (CH2)2CH3H
表1-8 化合物號(hào) R1R2R3X175 (CH2)2CH3H 76 (CH2)2CH3H 77 (CH2)2CH3H 78 (CH2)2CH3H 79 (CH2)2CH3H 80 (CH2)2CH3H 81 (CH2)2CH3H 82 (CH2)2CH3H 83 (CH2)2CH3H 84 CH3H 85 C6H5H
表1-9 化合物號(hào) R1R2R3X1X286(CH2)2CH3H H87(CH2)2CH3H H88(CH2)2CH3H H89(CH2)2CH3H H90(CH2)2CH3H H91(CH2)2CH3HH92(CH2)2CH3H H93(CH2)2CH3H H
表1-10 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào)R1R2R3Va94 CH3(CH2)2 H 95 CH3(CH2)2 H 96 CH3(CH2)2 H 97 CH3(CH2)2 H 98 CH3(CH2)2 H 99 CH3(CH2)2 H 100 CH3(CH2)2 H 101 CH3(CH2)2CH3(CH2)2H 102 CH3(CH2)2H 103 CH3(CH2)2 H 104 CH3(CH2)2(CH3)3CH 105 CH3(CH2)2 H 106 CH3(CH2)2H H
表1-11 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào) R1R2R3Va107 H108 (CH3)3C H109 CH2CH3 H110 (CH2)2CH3111 (CH2)2CH3 112 (CH2)2CH3 113 (CH2)2CH3 H114 (CH2)2CH3 H115 (CH2)2CH3 H116 (CH2)2CH3 H117 (CH2)2CH3 H118 (CH2)2CH3 H
表1-12 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào)R1R2R3Va119(CH2)2CH3 H 120(CH2)2CH3 H 121(CH2)2CH3 H 122(CH2)2CH3 H 123(CH2)2CH3 H 124(CH2)2CH3 H 125(CH2)2CH3 H 126(CH2)2CH3 H 127(CH2)2CH3 H 128 CH3(CH2)2Br 129 CH3(CH2)2SCH3 130 CH3(CH2)2
表1-13 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào)R1R2R3Va131(CH2)2CH3 H 132(CH2)2CH3H 133(CH2)2CH3 H 134(CH2)2CH3CHO135(CH2)2CH3ClCH2 136(CH2)2CH3(CH3)2NHCH2H 137(CH2)2CH3 H 138(CH2)2CH3CH3CH2OCH2H 139(CH2)2CH3 H 140(CH2)2CH3CO2CH3 141(CH2)2CH3142(CH2)2CH3 H 143(CH2)2CH3H
表1-14 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào)R1R2R3Va144 CH3(CH2)2 H 145 CH3(CH2)2 H 146 CH3(CH2)2H 147 CH3(CH2)2 H 148 CH3(CH2)2 H 149 CH3(CH2)2 H 150 CH3(CH2)2 H 151 CH3(CH2)2H 152 CH3(CH2)2 H
表1-15 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào)R1R2R3Va153 CH3(CH2)2 H 154 CH3(CH2)2 H 155 CH3(CH2)2H 156 CH3(CH2)2 H 157 CH3(CH2)2CH3CH2SCH2H 158 CH3(CH2)2H
表1-16 (X--Y--Z＝N＝C-W)化合物號(hào) WR2R3Va159 Cl 160 H 161 H 162H163 (CH3)3C H 164 H 165 H 166 SCH3(CH3)3C H 167 CH2CH3 H 168 C≡N H 169 H
表1-17 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào)R1R2R3Va170 H 171 H 172 H 173 H 174 H 175H 176 (CH3)3C H 177 H 178H 179 (CH3)3C H
表1-18 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào)R1R2R3V1V2180 CH3(CH2)2CH3CH2OCH2H H181 CH3(CH2)2CH3CH2OCH2H H182 CH3(CH2)2 H H
表1-19 (X--Y--Z＝R1N-C＝O)化合物號(hào)R1R2R3Va183CH3(CH2)2CH3H 184CH3(CH2)2CH3(CH2)3H 185CH3(CH2)2CH3(CH2)2H 186CH3(CH2)2 H 187CH3(CH2)2 H 188CH3(CH2)2 H 189 H 190 H 191 H 192CH3(CH2)2 H
作為更優(yōu)選的化合物，可列舉用下述通式(III)表示的上述表1中的化合物編號(hào)16表示的化合物(以下有時(shí)稱化合物16)。
用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物的制備方法上述式(I)所表示的化合物的代表化合物的制備方法，具體的記載于WO98/15555中，并且在特開(kāi)平3-204880、WO00/01388、J.Med.Chem.，35，3578(1992)、J.Med.Chem.，36，2508(1993)、J.Heteocyclic Chem.，30，241(1993)等中也有說(shuō)明。
上述式(II)所表示的化合物的代表化合物的制備方法，具體的記載于WO01/47931等中。
此外，原料化合物和中間體化合物中的各官能基的轉(zhuǎn)變和取代基所含的官能基的轉(zhuǎn)變，可以根據(jù)上述文獻(xiàn)記載的方法以外的公知的其它方法(例如，Comprehensive Organic Transformations，secondedition，R.C.Larock，John Wiley & Sons Inc.(1999)中記載的方法等)進(jìn)行。
通過(guò)適當(dāng)組合上述方法，且根據(jù)必要對(duì)這些方法加以修飾和改變，也可以制造出上述式(I)和式(II)所包含的任意的化合物。
在上述制備方法中得到的中間體化合物和目標(biāo)化合物可以通過(guò)有機(jī)合成化學(xué)中常用的精制方法，例如中和、過(guò)濾、提取、清洗、干燥、濃縮、重結(jié)晶、各種色譜法等方法進(jìn)行分離·精制。并且中間體化合物不需要特殊精制也可供用于后面的反應(yīng)。
制造用式(I)和式(II)表示的化合物的鹽時(shí)，將游離形態(tài)的化合物溶解或混懸于適當(dāng)?shù)娜軇┖?，加入適當(dāng)?shù)乃峄驂A形成鹽，根據(jù)必要可進(jìn)行分離·精制。將所得目標(biāo)物質(zhì)以鹽的形式轉(zhuǎn)換為游離形式后，可以轉(zhuǎn)變?yōu)樗Ｍ柠}。
3.用稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的具有抗糖尿病作用的物質(zhì)的探索方法通過(guò)①測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，使上述1.所述的稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量；和②測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量；③比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下的該測(cè)定值；④通過(guò)選擇因被檢物質(zhì)而阻礙稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物結(jié)合的物質(zhì)，能夠選擇具有抗糖尿病作用的物質(zhì)。
標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物的制備方法上述探索方法也可以直接使用上述1的稠合嘌呤衍生物，優(yōu)選使用被標(biāo)記的該稠合嘌呤衍生物。
作為被標(biāo)記的該化合物，可列舉出例如用3H、125I、13C等放射標(biāo)記、用FITC(異硫氰酸熒光素)等熒光標(biāo)記、被生物素標(biāo)記的該稠合嘌呤衍生物等，優(yōu)選用3H放射標(biāo)記的該稠合嘌呤衍生物。
上述1的稠合嘌呤衍生物可以參照公知的方法進(jìn)行標(biāo)記，例如放射標(biāo)記時(shí)，合成上述2的本發(fā)明的探索方法所用的稠合嘌呤衍生物時(shí)，可列舉出使用市售的被放射標(biāo)記的原料的方法，例如通過(guò)使官能基中有鹵基的稠合嘌呤衍生物和有放射性同位素的氫直接接觸反應(yīng)，將該放射性元素導(dǎo)入上述1的稠合嘌呤衍生物的方法。
具體來(lái)說(shuō)，即在上述探索方法中使用化合物16的標(biāo)記物時(shí)，通過(guò)將用表1中的化合物編號(hào)23表示的化合物的R體在鈀存在下、3H氣氛下催化氫化，能夠得到化合物16的3H標(biāo)記物。
胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的調(diào)制方法用于本發(fā)明探索方法的胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物，可為任何來(lái)自動(dòng)物的細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物，可列舉出優(yōu)選的來(lái)自大鼠、小鼠、狗、人等的該細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物。
此外，本發(fā)明的探索方法中，只要發(fā)現(xiàn)與稠合嘌呤衍生物的特異性結(jié)合，也可以使用含有胰臟β細(xì)胞的臟器或組織。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的探索方法可使用能從大鼠、小鼠、狗、人等的動(dòng)物的胰臟、胰島、胰臟中分離出來(lái)的胰臟β細(xì)胞本身、或培養(yǎng)該細(xì)胞所得的細(xì)胞培養(yǎng)物或它們的處理物。
作為胰臟β細(xì)胞，可以使用根據(jù)常規(guī)方法從胰臟中能夠分離出的胰臟β細(xì)胞本身，優(yōu)選使用不死化或細(xì)胞株化的細(xì)胞。
作為不死化或細(xì)胞株化的胰臟β細(xì)胞具體來(lái)說(shuō)可列舉出BRIN-BD11細(xì)胞〔Diabetes，45，1132-1140(1996)〕、INS-1細(xì)胞〔Endocrinology，130，167-178(1992)〕、βTC細(xì)胞〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，9037-9041(1988)〕、或、MIN6細(xì)胞〔Endocrinology，127，126-132(1990)〕、RINm5F〔Diabetes，31，521-531(1982)〕、HIT-T15細(xì)胞(ATCC CRL-1777)等，更優(yōu)選為MIN6細(xì)胞。
作為胰臟β細(xì)胞的處理物可列舉出，從胰臟β細(xì)胞或含有該細(xì)胞的組織的表面活性劑處理物、超聲波處理物、機(jī)械磨碎處理物、溶劑處理物、酶處理物、胰臟β細(xì)胞或含有該細(xì)胞的組織的固定化物、胰臟β細(xì)胞或含有該細(xì)胞的組織中，根據(jù)常規(guī)方法能夠調(diào)制的細(xì)胞膜級(jí)分、蛋白質(zhì)級(jí)分物、酶標(biāo)準(zhǔn)品等。
上述表面活性劑處理物，可以使用例如Trition X-100、NP-40、毛地黃皂苷(洋地黃皂苷)、蔗糖單己酸酯(sucrose monocapronate)等的一般用于動(dòng)物細(xì)胞膜的可溶化的表面活性劑來(lái)進(jìn)行調(diào)制。
機(jī)械磨碎處理物可使用均化器、超聲波、法式壓力機(jī)等進(jìn)行調(diào)制。
蛋白質(zhì)級(jí)分物和酶標(biāo)準(zhǔn)品，可以從細(xì)胞或組織的機(jī)械磨碎處理物中，單獨(dú)或組合使用溶劑提取法、采用硫銨等的鹽析法、脫鹽法、采用有機(jī)溶劑等的沉淀法，采用二乙基氨基乙基(DEAE)瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75(三菱化學(xué)社制)等樹(shù)脂的陰離子交換色譜法，采用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等樹(shù)脂的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法，采用丁基纖維素、苯基纖維素等樹(shù)脂的疏水性色譜法，使用分子篩的凝膠過(guò)濾法、親和層析法、色素聚焦等，等電點(diǎn)電泳等的電泳法等方法，進(jìn)行調(diào)制。
標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或其處理物的結(jié)合物的檢出方法標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或其處理物的結(jié)合物，可以通過(guò)將與胰臟β細(xì)胞或其處理物結(jié)合的標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物和未結(jié)合的標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物分離后，檢出標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物的方法來(lái)測(cè)定。
作為與胰臟β細(xì)胞或其處理物結(jié)合的標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物和未結(jié)合的標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物的分離方法，采用胰臟β細(xì)胞或非溶解性胰臟β細(xì)胞的處理物進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)時(shí)，可列舉出利用離心分離的分離方法?？闪信e出，當(dāng)胰臟β細(xì)胞的處理物為蛋白質(zhì)級(jí)分或酶標(biāo)準(zhǔn)品等可溶性物質(zhì)時(shí)，通過(guò)凝膠過(guò)濾分離出含有蛋白質(zhì)或酶標(biāo)準(zhǔn)品等級(jí)分的方法。
對(duì)于標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物，當(dāng)該衍生物用放射性同位素標(biāo)記時(shí)用液體閃爍計(jì)數(shù)器，當(dāng)用熒光物質(zhì)標(biāo)記時(shí)用熒光檢測(cè)器等，當(dāng)用生物素標(biāo)記時(shí)，使其與適當(dāng)?shù)拿附Y(jié)合的抗生物素蛋白反應(yīng)后，可以通過(guò)測(cè)定該酶活性進(jìn)行檢出、測(cè)定。并可以由該測(cè)定值確定標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或其處理物的結(jié)合物的量。
胰島素促泌活性的測(cè)定方法可以確認(rèn)通過(guò)上述方法，作為阻礙稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或其處理物的結(jié)合的物質(zhì)而選擇的物質(zhì)為具有抗糖尿病作用的物質(zhì)，例如可根據(jù)，使胰臟β細(xì)胞或含有該細(xì)胞的組織和上述選擇出的物質(zhì)在葡萄糖存在下接觸時(shí)，通過(guò)與該物質(zhì)的接觸，胰臟β細(xì)胞的胰島素分泌被促進(jìn)而得以確認(rèn)[Diabetorogia，36，1139(1993)]。
以稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合活性為指標(biāo)，以選擇阻礙其結(jié)合的物質(zhì)為特征的具有抗糖尿病作用物質(zhì)的探索方法的上述[1]～[3]的探索方法，與以胰臟β細(xì)胞的胰島素促泌活性為指標(biāo)，直接促進(jìn)該活性的物質(zhì)的探索方法相比較，是一種在操作性、迅速性等方面格外優(yōu)良的方法。
4.使用與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的具有抗糖尿病作用的物質(zhì)的探索方法[1]與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的選擇方法作為用于本發(fā)明的與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的選擇方法，只要是與稠合嘌呤衍生物特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的選擇方法，可以采用任何公知的方法，可列舉出例如，將稠合嘌呤衍生物固定化在稱作載體的不溶性的高分子上，與用于結(jié)合活性評(píng)價(jià)的細(xì)胞提取液混合后，洗凈、鑒定與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的分子的親和層析法[CurrentProtocols in Protein Science(Chapter 9)，John Wiley & Sons(2001)]。
(1)載體的調(diào)制方法用于選擇與本發(fā)明所用的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的載體，只要是能夠固定化稠合嘌呤衍生物的載體，可使用任意載體。期待優(yōu)選在載體表面有能夠通過(guò)與稠合嘌呤衍生物的化學(xué)反應(yīng)而結(jié)合的官能基，且蛋白質(zhì)的非特異性吸附小，可操作性優(yōu)異的載體。
具體來(lái)說(shuō)，作為載體材料可列舉出例如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯等。作為載體的大小，可列舉出直徑為10nm～1mm，優(yōu)選50nm～100μm的顆粒。作為載體的形狀，可列舉出多孔質(zhì)、貫通孔質(zhì)、無(wú)孔質(zhì)等。作為用于本發(fā)明更優(yōu)選的載體，可列舉出例如，NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences公司制)、Affi-Gel 10(Bio-Rad公司制)等。
本發(fā)明中能夠固定化于載體的稠合嘌呤衍生物，只要是能夠固定化于載體的稠合嘌呤衍生物，可使用任何稠合嘌呤衍生物。能夠固定化于載體的稠合嘌呤衍生物的具體例子可列舉出如下述式(IV)所表示的化合物(以下稱為化合物155)。
使稠合嘌呤衍生物與載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)，只要在本發(fā)明的使用中沒(méi)有阻礙，則可采用任何反應(yīng)。
通過(guò)使載體上的官能基與稠合嘌呤衍生物反應(yīng)，能夠制作稠合嘌呤衍生物固定化載體。例如，可以使具有作為官能基的羧酸琥珀酰亞胺的載體與稠合嘌呤衍生物的溶液接觸，使載體上的羧酸琥珀酰亞胺和稠合嘌呤衍生物發(fā)生反應(yīng)。此時(shí)的溶劑和反應(yīng)條件為上述的固定化反應(yīng)進(jìn)行的溶劑和反應(yīng)條件的組合，含有羧酸琥珀酰亞胺的載體、稠合嘌呤衍生物在進(jìn)行上述的固定化反應(yīng)以外的分解反應(yīng)或縮合反應(yīng)時(shí)，只要是不引起阻礙本發(fā)明的目的的溶劑和反應(yīng)條件的組合，任意的溶劑和反應(yīng)條件的組合均可。具體來(lái)說(shuō)，可以使含有羧酸琥珀酰亞胺的載體和含有1μmol/l～1mol/l稠合嘌呤衍生物的溶液相接觸，靜置，或一邊用旋轉(zhuǎn)機(jī)、攪拌器等平穩(wěn)攪拌，一邊在0℃～100℃下反應(yīng)1秒～1000小時(shí)，調(diào)制成稠合嘌呤衍生物固定化載體。作為溶劑可列舉出例如含有鹽、表面活性劑、緩沖成分的水溶液、水、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)、二氧六環(huán)、甲醇等。
反應(yīng)結(jié)束后，為了除去未反應(yīng)的稠合嘌呤衍生物，洗凈稠合嘌呤衍生物被固定化的載體。洗滌方法只要是能夠使固定化稠合嘌呤衍生物的載體被穩(wěn)定有效的回收、且未反應(yīng)的稠合嘌呤衍生物被有效除去的方法，就可以使用任何公知的方法。例如，如果載體為顆粒，可以在反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(15000rpm、5分鐘、室溫)，除去上清液后，在溶劑中混濁，重復(fù)同樣的離心分離、除去上清液的操作，進(jìn)行清洗。如果載體為板時(shí)，板可以用溶劑洗凈。此外，根據(jù)必要，利用相同的方法，可以置換為適于保存或與細(xì)胞提取液相混合的溶劑。作為溶劑，可列舉出例如含有鹽、表面活性劑、緩沖成分的水溶液、水、DMF、DMSO、THF、二氧六環(huán)、甲醇等。
稠合嘌呤衍生物固定化載體上殘留有未反應(yīng)的官能基時(shí)，根據(jù)必要，可封閉未反應(yīng)的官能基。封閉可通過(guò)使與官能基反應(yīng)、且與被固定于載體的稠合嘌呤衍生物不反應(yīng)的化合物和稠合嘌呤衍生物固定化載體發(fā)生反應(yīng)而進(jìn)行。封閉中，只要是與官能基反應(yīng)、且與被固定于載體的稠合嘌呤衍生物不反應(yīng)的化合物均可使用。例如，如果載體的官能基為羧酸琥珀酰亞胺，可以使用tris-乙醇胺封閉稠合嘌呤衍生物固定化載體上的未反應(yīng)的羧酸琥珀酰亞胺基。
用于本發(fā)明的稠合嘌呤衍生物可通過(guò)間隔化合物在載體上固定化。間隔化合物只要在本發(fā)明的使用中沒(méi)有障礙即可采用任何化合物，可列舉出例如，Pierece公司、Molecular Probe公司和ShearWater公司等銷售的間隔化合物。具體來(lái)說(shuō)可列舉出琥珀酰亞胺基6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺基]己酸酯(LC-SPDP)(Pierece公司制)、3-(2-吡啶二硫基)丙酸(S-1531)琥珀酰亞胺酯(Molecular Probe公司制)等間隔化合物。此外，也可使用6-氨基己酸、4-氨基正酪酸等間隔化合物。
通過(guò)間隔化合物中介的稠合嘌呤衍生物與載體的結(jié)合方法，只要在本發(fā)明的使用中沒(méi)有障礙，采用任何方法均可。可列舉出例如，向載體導(dǎo)入間隔化合物后，使稠合嘌呤衍生物與該間隔化合物結(jié)合的方法，或間隔化合物在稠合嘌呤衍生物上結(jié)合后，在載體上固定化該間隔化合物的方法。
此外，也可以化學(xué)保護(hù)這些間隔化合物的一個(gè)官能基，與載體或稠合嘌呤衍生物反應(yīng)后，使產(chǎn)物脫保護(hù)，再與稠合嘌呤衍生物或載體反應(yīng)，調(diào)制而成稠合嘌呤衍生物固定化載體。
在載體上導(dǎo)入間隔化合物后，與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的方法，例如，通過(guò)含有作為官能基的羧酸琥珀酰亞胺基的載體和含有伯胺或仲胺的羧酸化合物的間隔化合物反應(yīng)，能夠在載體表面做成帶有羧基的載體。作為具有伯胺或仲胺的羧酸化合物，可列舉出例如6-氨基己酸、4-氨基正丁酸等。
此時(shí)的溶劑和反應(yīng)條件為上述的固定化反應(yīng)進(jìn)行的溶劑和反應(yīng)條件的組合，載體、間隔化合物在進(jìn)行上述的固定化反應(yīng)以外的分解反應(yīng)或縮合反應(yīng)時(shí)，只要是不引起阻礙該固定化反應(yīng)的溶劑和反應(yīng)條件的組合，任意的溶劑和反應(yīng)條件的組合均可。具體來(lái)說(shuō)，可以使載體與含有1μmol/l～50mol/l的具有伯胺或仲胺的化合物，例如6-氨基己酸、4-氨基正丁酸等的溶液相接觸，靜置，或一邊用旋轉(zhuǎn)機(jī)、攪拌器等平穩(wěn)攪拌，一邊在0℃～100℃下反應(yīng)1秒～1000小時(shí)，調(diào)制成在表面帶有羧基的載體。作為溶劑，可列舉出例如水、DMF、DMSO、THF、二氧六環(huán)、甲醇等。
反應(yīng)結(jié)束后，為了除去未反應(yīng)的間隔化合物，洗凈載體。洗凈方法只要是能夠使固定化間隔化合物的載體被穩(wěn)定有效的回收、且未反應(yīng)的間隔化合物被有效除去的方法，就可以使用任何公知的方法。例如，如果載體為顆粒，反應(yīng)結(jié)束后，可以通過(guò)離心分離(15000rpm、5分鐘、室溫)，除去上清液后，在溶劑中混懸，重復(fù)同樣的離心分離、除去上清液的操作，能夠洗凈。如果載體為板時(shí)，板可以用溶劑洗凈。此外，根據(jù)必要，利用相同的方法，可以置換為適于以后反應(yīng)的溶劑。
通過(guò)由此得到的載體上的羧基和稠合嘌呤衍生物反應(yīng)，能夠制造出稠合嘌呤衍生物固定化載體。具體來(lái)說(shuō)，使固定化間隔化合物的載體和稠合嘌呤衍生物溶液相接觸，能夠使載體上的羧基與稠合嘌呤衍生物發(fā)生反應(yīng)。
此時(shí)的溶劑和反應(yīng)條件為上述的固定化反應(yīng)進(jìn)行的溶劑和反應(yīng)條件的組合，固定化間隔化合物的載體、稠合嘌呤衍生物在進(jìn)行上述的固定化反應(yīng)以外的分解反應(yīng)或縮合反應(yīng)時(shí)，只要是不引起阻礙該固定化反應(yīng)的溶劑和反應(yīng)條件的組合，任意的溶劑和反應(yīng)條件的組合均可。具體來(lái)說(shuō)，可以使固定化間隔化合物的載體與含有1μmol/l～50mol/l的稠合嘌呤衍生物相接觸，靜置，或一邊用旋轉(zhuǎn)機(jī)、攪拌器等平穩(wěn)攪拌，一邊在0℃～100℃下反應(yīng)1秒～1000小時(shí)，能夠在載體表面調(diào)制成固定化稠合嘌呤衍生物的載體。作為溶劑，可列舉出例如含有鹽、表面活性劑、緩沖成分的水溶液、水、DMF、DMSO、THF、二氧六環(huán)、甲醇等。
反應(yīng)結(jié)束后，為了除去未反應(yīng)的稠合嘌呤衍生物，通過(guò)上述方法洗凈稠合嘌呤衍生物固定化載體。
稠合嘌呤衍生物固定化載體上殘留有未反應(yīng)的官能基時(shí)，根據(jù)必要，可通過(guò)上述方法封閉未反應(yīng)的官能基。
此外，作為其它的稠合嘌呤衍生物固定化載體的制備方法，可列舉出使稠合嘌呤衍生物與間隔化合物反應(yīng)，合成為用于稠合嘌呤衍生物與載體結(jié)合的間隔化合物—稠合嘌呤衍生物復(fù)合體，使該化合物與載體結(jié)合的方法。
間隔化合物—稠合嘌呤衍生物復(fù)合體可通過(guò)間隔化合物與稠合嘌呤衍生物復(fù)合體反應(yīng)而調(diào)制。此時(shí)的溶劑和反應(yīng)條件為上述反應(yīng)進(jìn)行的溶劑和反應(yīng)條件的組合，間隔化合物、稠合嘌呤衍生物、間隔化合物—稠合嘌呤衍生物復(fù)合體，在進(jìn)行上述結(jié)合反應(yīng)以外的分解反應(yīng)或稠合反應(yīng)時(shí)、只要是不引起阻礙間隔化合物和稠合嘌呤衍生物的復(fù)合體形成的溶劑和反應(yīng)條件的組合，任何溶劑和反應(yīng)條件的組合均可。
具體來(lái)說(shuō)，例如，可以混合含有1μmol/l～1mol/l羧酸琥珀酰亞胺的間隔化合物和含有1μmol/l～1mol/l稠合嘌呤衍生物，靜置，或一邊用旋轉(zhuǎn)機(jī)、攪拌器等平穩(wěn)攪拌，一邊在0℃～100℃下反應(yīng)1秒～1000小時(shí)，制備成間隔化合物——稠合嘌呤衍生物復(fù)合體。作為溶劑可列舉出例如含有鹽、表面活性劑、緩沖成分的水溶液，水、DMF、DMSO、THF、二氧六環(huán)、甲醇等。
所生成的間隔化合物——稠合嘌呤衍生物復(fù)合體可通過(guò)薄層色譜、HPLC、二相分離等方法分離、精制。
通過(guò)將載體和使用上述方法調(diào)制而成的間隔化合物——稠合嘌呤衍生物復(fù)合體反應(yīng)，可調(diào)制成稠合嘌呤固定化載體。
此時(shí)的溶劑和反應(yīng)條件為上述的固定化反應(yīng)進(jìn)行的溶劑和反應(yīng)條件的組合，載體、間隔化合物——稠合嘌呤衍生物復(fù)合體，在進(jìn)行上述的固定化反應(yīng)以外的分解反應(yīng)或稠合反應(yīng)時(shí)、只要是不引起阻礙該復(fù)合體與單體的結(jié)合反應(yīng)的溶劑和反應(yīng)條件的組合，任何溶劑和反應(yīng)條件的組合均可。
具體來(lái)說(shuō)，使載體與含有1μmol/l～1mol/l的間隔化合物——稠合嘌呤衍生物復(fù)合體的溶液相接觸，可列舉出與將上述間隔化合物固定化于載體同樣的方法的固定化方法。
使由此得到的稠合嘌呤衍生物固定化載體與溶劑接觸，可以進(jìn)行保存。此時(shí)的溶劑和保存條件只要使稠合嘌呤衍生物固定化載體穩(wěn)定，任何溶劑和保存條件的組合均可。具體來(lái)說(shuō)，作為溶劑可列舉出例如含有鹽、表面活性劑、緩沖成分的水溶液、水、DMF、DMSO、THF、二氧六環(huán)、甲醇等。優(yōu)選保存在室溫下，更優(yōu)選在遮光下，用氦、氬等惰性氣體置換。
(2)含有結(jié)合稠合嘌呤衍生物的蛋白質(zhì)(以下稱為稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì))的細(xì)胞提取液的調(diào)制方法。
用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，只要是與稠合嘌呤衍生物特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，就沒(méi)有來(lái)源上的限定，可列舉出，優(yōu)選源自真核生物的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選源自動(dòng)物的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)選為源自哺乳動(dòng)物的器官、臟器、組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)。
作為器官、臟器或組織，可以是公知的任何組織，優(yōu)選胰臟、胰島等臟器或組織。作為細(xì)胞，可以是公知的任何細(xì)胞，優(yōu)選胰臟β細(xì)胞株、胰臟β細(xì)胞初次培養(yǎng)細(xì)胞等臟器或組織。具體來(lái)說(shuō)，作為β細(xì)胞株可列舉出BRIN-BD11細(xì)胞[Diabetes，45，1132-1140(1996)]、INS-1細(xì)胞[Endocrinology，130，167-178(1992)]、βTC細(xì)胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，9037-9041(1988)]、MIN6細(xì)胞[Endocrinology，127，126-132(1990)]、HIT-T15細(xì)胞(ATCC CRL-1777)、及RINm5F[Diabetes，31，521-531(1982)]等的細(xì)胞。作為β細(xì)胞初次培養(yǎng)細(xì)胞，可列舉出對(duì)從胰臟、胰導(dǎo)等的組織中回收的細(xì)胞進(jìn)行短期培養(yǎng)的細(xì)胞。
這些細(xì)胞可以參照《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)法入門》[學(xué)會(huì)出版中心(1993)]中記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)。
從上述的器官、臟器、組織或細(xì)胞中，調(diào)制含有稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的試劑的方法，只要是能夠回收蛋白質(zhì)的方法，即可采用公知的方法，例如可采用《蛋白質(zhì)·酶的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)法》修訂第2版(南江堂，1994)等記載的方法進(jìn)行調(diào)制。作為器官、臟器、組織或細(xì)胞的破碎方法，可采用公知的任何方法，可通過(guò)將使用Waring混合機(jī)、Polytron粉碎機(jī)、Dounce型均化器或超聲波粉碎機(jī)等裝置的機(jī)械性破碎、使用低滲溶液的物理性破碎、使用表面活性劑的可溶化、離心分離等操作進(jìn)行組合，調(diào)制該蛋白質(zhì)試樣。
該蛋白質(zhì)試劑可以在冷藏狀態(tài)或冰凍狀態(tài)下保存。
(3)用于本發(fā)明的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的探索方法用于本發(fā)明的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)可使用上述(1)的方法制備的稠合嘌呤衍生物固定化載體及上述(2)的方法調(diào)制的蛋白質(zhì)試劑來(lái)進(jìn)行探索。
稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的探索方法只要是能夠探索稠合嘌呤衍生物的方法，可采用公知的任何方法，例如可采用《蛋白質(zhì)·酶的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)法》修訂第2版(南江堂，1994)等記載的方法進(jìn)行探索。
具體來(lái)說(shuō)，可以使上述(1)的方法制備的稠合嘌呤衍生物固定化載體分散在上述(2)的方法調(diào)制的蛋白質(zhì)試樣液中，靜置或一邊用旋轉(zhuǎn)攪拌器等平穩(wěn)攪拌，一邊在0℃～50℃下反應(yīng)1秒～1000小時(shí)，使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)吸附在稠合嘌呤衍生物固定化載體上。該結(jié)合反應(yīng)后，通過(guò)洗滌稠合嘌呤衍生物固定化載體除去非特異性吸附在稠合嘌呤衍生物固定化載體上的蛋白質(zhì)。結(jié)合或洗滌所用的溶液只要是本方法可以使用的，即可采用任何溶液，可列舉出例如《蛋白質(zhì)·酶的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)法》修訂第2版(南江堂，1994)等記載的溶液。
吸附在稠合嘌呤衍生物固定化載體上的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，通過(guò)減弱與稠合嘌呤衍生物的結(jié)合的方法，可以從稠合嘌呤衍生物固定化載體上洗脫。減弱稠合嘌呤衍生物與該蛋白質(zhì)結(jié)合的方法，只要是本方法可以使用的，即可采用任何方法，可列舉出例如添加變性劑、增加鹽濃度、加熱、添加表面活性劑等方法。作為變性劑可列舉出SDS、尿素、鹽酸胍等，作為鹽可列舉出氯化鈉、氯化鉀等，作為表面活性劑可列舉出Nonidet P40、Triton、Tween、洋地黃皂苷等。此外，加熱是指例如升溫至30～100℃。如此精制而成的結(jié)合蛋白質(zhì)可通過(guò)SDS-PAGE、二維電泳、質(zhì)譜分析等的蛋白質(zhì)分析方法進(jìn)行檢出。
通過(guò)比較該結(jié)合蛋白對(duì)稠合嘌呤衍生物固定化載體和只實(shí)施了封閉的載體的結(jié)合性，可以探索出與稠合嘌呤衍生物特異性結(jié)合的蛋白。
(4)稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的鑒定方法稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE法進(jìn)行分離，用考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色后，可以從凝膠中切出。凝膠中的蛋白質(zhì)可以通過(guò)具有賴氨酰內(nèi)肽酶(lysyl endo peptidase)或以胰蛋白酶等特異性切斷點(diǎn)的內(nèi)蛋白水解酶的處理，被分成肽片段。所得肽片段經(jīng)過(guò)反相HPLC精制后，可以采用氣相蛋白序列分析儀或質(zhì)譜儀研究該蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。使用這部分氨基酸序列的信息，通過(guò)在PIR、SwissProt等氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)或GenBank等堿基序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索，可以知道該蛋白質(zhì)與公知蛋白質(zhì)的同源性。
作為用上述方法鑒定的蛋白質(zhì)，可列舉出具有如序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)作為NADPH依賴性的具有視黃醇或短鏈醇氧化還原酶活性的酶而眾所周知[Biochimica et BiophysicaActa，1338，47(1997)]。
(5)用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)作為用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，只要是能通過(guò)上述(3)和(4)的方法鑒定的蛋白質(zhì)，可使用任意蛋白質(zhì)，且它的來(lái)源也沒(méi)有特殊限制，具體來(lái)說(shuō)，可列舉出(i)具有用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)在用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中，由1個(gè)以上的氨基酸缺失、置換、插入或添加的氨基酸序列形成的，且與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)；(iii)由具有與用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列有60％以上的同源性的氨基酸序列形成的，且與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)。
在用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中，由1個(gè)以上的氨基酸缺失、置換、插入或添加的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)可使用《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)(2001)(以下簡(jiǎn)稱分子克隆第3版)、《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons(1987-1997)(以下簡(jiǎn)稱最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)、Nucleic AcidsResearch，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等記載的部位特異性突變導(dǎo)入法，例如可以通過(guò)在編碼用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)的DNA中導(dǎo)入部位特異性突變，獲得該蛋白質(zhì)。
缺失、置換、插入或添加的氨基酸的數(shù)量沒(méi)有特別限定，可以是通過(guò)上述的部位特異性突變法能夠缺失、置換、插入或添加的數(shù)量，即1至數(shù)十個(gè)，優(yōu)選1～20個(gè)，更優(yōu)選1～10個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選1～5個(gè)。
用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中，1個(gè)以上的氨基酸缺失、置換、插入或添加是指，在同一序列中的任意位置出現(xiàn)1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入或添加，缺失、置換、插入或添加可同時(shí)發(fā)生，置換、插入或添加的氨基酸序列可以是天然型或非天然型的。作為天然型氨基酸殘基，可列舉出L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L--半胱氨酸等。
以下所示為可以相互置換的氨基酸殘基的例子。在同一組中含有的氨基酸殘基可以相互置換。
A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C組天冬酰胺、谷氨酰胺D組賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸G組苯丙氨酸、酪氨酸上述所得用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中，為使由1個(gè)以上的氨基酸缺失、置換、插入或添加的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)成為可與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)，應(yīng)與用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列的同源性在60％以上，通常為80％以上，優(yōu)選為95％以上，更優(yōu)選為98％以上。
氨基酸序列或堿基序列的同源性可以采用Karlin and Altschul的算法BLAST〔Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)〕或FASTA〔Methods Enzymol.，183，63(1990)〕來(lái)確定。以算法BLAST為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)出了名為BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。以BLAST為基礎(chǔ)通過(guò)BLASTN解析堿基序列時(shí)，參數(shù)例如Score＝100，wordlength＝12。以BLAST為基礎(chǔ)通過(guò)BLASTX解析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)例如Score＝50，wordlength＝3。使用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，采用各程序的默認(rèn)參數(shù)。這種解析方法的具體操作是公知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
上述所得的用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中，由1個(gè)以上的氨基酸缺失、置換、插入或添加的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)是否為能夠與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)，可通過(guò)以下方法來(lái)確認(rèn)。
使上述(1)的方法中得到的固定了稠合嘌呤衍生物的載體和蛋白質(zhì)在不阻礙稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)結(jié)合的溶劑中以充分時(shí)間接觸。反應(yīng)后，通過(guò)離心分離分離該載體，將該載體混懸于對(duì)該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)沒(méi)有解離作用的溶劑中。可通過(guò)重復(fù)同樣操作以清洗該載體。
與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過(guò)弱化與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的方法，可以從該稠合嘌呤衍生物固定化載體中洗脫。作為弱化稠合嘌呤衍生物與結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的方法，可采用上述(3)的方法。將洗脫的蛋白質(zhì)供用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)該電泳可以確認(rèn)該蛋白質(zhì)的譜帶時(shí)，可判定該蛋白質(zhì)為與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)。
用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的調(diào)制方法(1)從臟器等中的調(diào)制可用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，只要是可采用本發(fā)明的方法，即可使用公知的任何方法進(jìn)行調(diào)制，例如可采用《蛋白質(zhì)·酶的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)法》(日文)修訂第2版(南江堂，1994)等記載的方法進(jìn)行調(diào)制。
本發(fā)明探索方法所用的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)可通過(guò)破碎真核生物的器官、臟器、組織或細(xì)胞，作為未精制級(jí)分、部分精制級(jí)分、精制級(jí)分調(diào)制。作為真核生物，可以是公知的任意生物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。作為器官、臟器或組織，可以是公知的任意器官、臟器或組織，可列舉出例如胰臟、胰島等。作為細(xì)胞可列舉出例如BRIN-BD11細(xì)胞[Diabetes，45，1132-1140(1996)]、INS-1細(xì)胞[Endocrinology，130，167-178(1992)]、βTC細(xì)胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，9037-9041(1988)]、MIN6細(xì)胞[Endocrinology，127，126-132(1990)]、HIT-T15細(xì)胞(ATCC CRL-1777)、及RINm5F[Diabetes，31，521-531(1982)]等的細(xì)胞。作為器官、臟器、組織或細(xì)胞的破碎方法，可采用公知的任何方法，可通過(guò)將使用Waring混合機(jī)、Polytron粉碎機(jī)、Dounce型均化器或超聲波粉碎機(jī)等裝置的機(jī)械性破碎、使用低滲溶液的物理性破碎、使用表面活性劑的可溶化、離心分離等操作進(jìn)行組合，調(diào)制含有稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)級(jí)分。
該蛋白質(zhì)試劑可以在冷藏狀態(tài)或冰凍狀態(tài)下保存。
作為從該蛋白質(zhì)級(jí)分中精制稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，可采用將離子交換色譜、疏水性色譜、凝膠過(guò)濾、使用稠合嘌呤衍生物的載體的親和層析等方法單獨(dú)或組合來(lái)進(jìn)行精制的方法。
稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的量，通過(guò)使用與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的免疫蛋白印跡法等來(lái)測(cè)定。
對(duì)精制蛋白質(zhì)對(duì)稠合嘌呤衍生物的結(jié)合活性的程度可使用上述[1](1)的方法調(diào)制而成的固定了稠合嘌呤衍生物的載體來(lái)測(cè)定。具體來(lái)說(shuō)，例如，對(duì)稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合復(fù)合體，通過(guò)弱化該結(jié)合的方法可以從該結(jié)合復(fù)合體中洗脫稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。作為弱化稠合嘌呤衍生物與結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的方法，可采用上述[1](3)的方法。將洗脫的蛋白質(zhì)供用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)該電泳能夠確認(rèn)該蛋白質(zhì)的譜帶時(shí)，可測(cè)定被分級(jí)的級(jí)分中含有該蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的程度。
此外，該稠合嘌呤結(jié)合蛋白質(zhì)的活性已知的情況下，可通過(guò)測(cè)定該蛋白質(zhì)的活性來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)合活性。
例如，具有用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)(以下稱為p31蛋白)可參照Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons(2001)中記載的方法測(cè)定該蛋白質(zhì)的活性，以測(cè)定它和稠合嘌呤衍生物的結(jié)合活性。
此外，作為從上述調(diào)制而成的蛋白質(zhì)級(jí)分中精制稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，可列舉通過(guò)使用與該蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的親和層析進(jìn)行精制的方法。即，獲得與該蛋白質(zhì)反應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體后，可采用Harlow，E.and Lane，D.Using antibodiesAlaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，USA(1999)等中記載的方法等使該載體與色譜載體交聯(lián)，調(diào)制親和柱，使用該柱從蛋白質(zhì)級(jí)分或部分精制級(jí)分中精制稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。
(2)使用重組細(xì)胞的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的調(diào)制用于本發(fā)明的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)可使用編碼該蛋白質(zhì)的DNA進(jìn)行調(diào)制。該DNA可根據(jù)上述[1](4)鑒定的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基酸序列來(lái)制備，可通過(guò)使用編碼該氨基酸序列的合成DNA，對(duì)從生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞、組織等中調(diào)制而成的cDNA文庫(kù)，進(jìn)行菌落雜交、噬菌斑雜交等方法來(lái)獲得(《分子克隆》第三版)。
此外，以該氨基酸序列為檢索項(xiàng)，通過(guò)檢索公知的數(shù)據(jù)庫(kù)也可以獲得編碼具有該氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA的堿基序列。
作為能夠由上述方法獲得的DNA，具體來(lái)說(shuō)可列舉出例如(i)具有用序列號(hào)4～6中任一項(xiàng)表示的堿基序列的DNA；(ii)編碼上述[1](5)的(i)～(iii)的任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)的DNA；(iii)與具有用序列號(hào)4～6中任一項(xiàng)表示的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的DNA。
在嚴(yán)格條件下可以雜交的DNA是指例如，通過(guò)以具有用序列號(hào)4～6中任一項(xiàng)表示的堿基序列的DNA的全部或用限制酶消化該DNA得到的DNA片段等作為探針，用菌落雜交、噬菌斑雜交法或Southern印跡雜交法等方法得到的DNA。具體來(lái)說(shuō)，為通過(guò)使用固定化來(lái)自菌落或噬菌斑的DNA，在0.9mol/l的氯化鈉存在下，在65℃下進(jìn)行雜交后，用0.1～2倍濃度的SSC溶液(1倍濃度的SSC溶液的組成為150mmol/l氯化鈉和15mmol/l的檸檬酸鈉)，在65℃下洗滌濾膜得到的能夠鑒定的DNA。雜交可參照分子克隆第3版，最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、DNA Cloning 1Core Techniques，A Practical Approach，SecondEdition，Oxford University(1995)等記載的方法進(jìn)行。
作為可以雜交的DNA，具體來(lái)說(shuō)可列舉出，用上述BLAST或FASTA等和上述的參數(shù)計(jì)算時(shí)，與用序列號(hào)4～6中任一項(xiàng)表示的堿基序列至少有60％以上的同源性的DNA，優(yōu)選有80％以上的同源性的DNA，更優(yōu)選有95％以上的同源性的DNA，再優(yōu)選有98％以上的同源性的DNA。
稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)可參照分子克隆第3版或最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法等記載的方法，例如可通過(guò)以下方法，在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA來(lái)制備。
以全長(zhǎng)cDNA為基礎(chǔ)，根據(jù)需要，調(diào)制含有編碼該蛋白質(zhì)部分的適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段。
并且根據(jù)需要調(diào)制可置換堿基，使編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)部分的堿基序列成為最適于宿主細(xì)胞表達(dá)的密碼子的DNA。該DNA對(duì)有效制備稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)是有用的。
通過(guò)在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的啟動(dòng)子下游插入該DNA片段或全長(zhǎng)cDNA，制備重組載體。
將該重組載體導(dǎo)入適合于該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
作為宿主細(xì)胞，是細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等只要能表達(dá)目的基因的物質(zhì)均可使用。
作為表達(dá)載體，可采用在上述宿主細(xì)胞中可自主復(fù)制乃至整合入染色體中的，在能夠轉(zhuǎn)錄編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA的位置上含有啟動(dòng)子的物質(zhì)。
將細(xì)菌等的原核生物作為宿主細(xì)胞使用時(shí)，含有編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA而形成的重組載體在原核生物中可自主復(fù)制的同時(shí)，優(yōu)選由啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、本發(fā)明的DNA、轉(zhuǎn)錄終止序列等構(gòu)成的載體。也可含有控制啟動(dòng)子的基因。
作為表達(dá)載體，可列舉出例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均為Boehringer Mannheim公司制)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pKYP10(特開(kāi)昭58-110600)、pKYP200〔Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)〕、pLSA1〔Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)〕、pGEL1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)〕、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrs30〔自大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)調(diào)制〕、pTrs32〔自大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)調(diào)制〕、pGHA2〔自大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)調(diào)制、特開(kāi)昭60-221091〕、pGKA2〔自大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)調(diào)制、特開(kāi)昭60-221091〕、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J.Bacteriol.，172，2392(1990)〕、pGEX(Pharmacia公司制)、pET system(Novagen公司制)等。
作為啟動(dòng)子，只要是在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的物質(zhì)均可。可列舉出例如，trp啟動(dòng)子(Ptrp)、lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子等的來(lái)自大腸桿菌或噬菌體的啟動(dòng)子?；蛞部梢允褂檬筆trp兩個(gè)串聯(lián)的啟動(dòng)子(Ptrp×2)、tac啟動(dòng)子、lacT7啟動(dòng)子、letI啟動(dòng)子這樣的人工設(shè)計(jì)改變的啟動(dòng)子。
優(yōu)選使用作為核糖體結(jié)合序列的SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密碼子之間調(diào)節(jié)至適當(dāng)距離(例如6～18堿基)的質(zhì)粒。
作為本發(fā)明的重組載體的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)中轉(zhuǎn)錄終止序列并不一定是必須的，但優(yōu)選在結(jié)構(gòu)基因的正下方配置轉(zhuǎn)錄終止序列。
作為宿主細(xì)胞，可列舉出屬于埃希桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、微桿菌屬、假單胞菌屬的微生物，例如大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌GI698、大腸桿菌TB1、無(wú)花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短桿菌ATCC14066(Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066)、黃色短桿菌ATCC14067(Brevibacterium flavum ATCC14067)、乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869(Brevibacterium lactofermentum ATCC13869)、谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)、谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869(Corynebacterium glutamicumATCC13869)、嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC13870(Corynebacteriumacetoacidophilum ATCC13870)、嗜氨微桿菌ATCC15354(Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、假單胞菌屬D-0110(Pseudomonas sp.D-0110)等。
作為重組載體的導(dǎo)入方法，只要是能向上述宿主細(xì)胞導(dǎo)入DNA的方法均可使用。例如使用鈣離子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕，裸細(xì)胞法(特開(kāi)昭63-2483942)，或Gene，17，107(1982)或Molecular & General Genetics，168，111(1979)中記載的方法等。
使用酵母作為宿主細(xì)胞時(shí)，作為表達(dá)啟動(dòng)子，可列舉出例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作為啟動(dòng)子，只要是能在酵母菌株中發(fā)揮功能的物質(zhì)均可使用?？闪信e出例如己糖激酶等的糖酵解系統(tǒng)的基因的啟動(dòng)子、PHO5啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、gal1啟動(dòng)子、gal10啟動(dòng)子、熱休克多肽啟動(dòng)子、MFα1啟動(dòng)子、CUP1啟動(dòng)子等。
作為宿主細(xì)胞，可列舉出屬于糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克雷維氏酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)等的微生物，例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克雷維氏酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽絲孢酵母屬(Trichosporon pullulans)、河岸許旺氏酵母(Schwanniomyces alluvius)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)等。
作為重組載體的導(dǎo)入方法，只要是能向上述酵母導(dǎo)入DNA的方法均可使用。例如使用電穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、原生質(zhì)球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]、醋酸鋰法[J.Bacteriology，153，163(1983)]、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中記載的方法等。
使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主時(shí)，作為表達(dá)載體，可列舉出例如pcDNAI、pCDM8(Invitrogen公司制)、pAGE107〔特開(kāi)平3-22979、Cytotechnology，3，133(1990)〕、pAS3-3(特開(kāi)平2-227075)、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103〔J.Biochem.，101，1307(1987)〕、pAGE210等。
作為啟動(dòng)子，只要是能在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能的物質(zhì)均可使用。可列舉出例如巨細(xì)胞病毒(CMV)的IE(immediate early)基因的啟動(dòng)子，SV40的初期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、SRa啟動(dòng)子等。并且可將人CMV的IE基因的增強(qiáng)子與啟動(dòng)子一起使用。
作為宿主細(xì)胞，可列舉出人細(xì)胞的類淋巴(Namalwa)細(xì)胞、猴細(xì)胞的COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞的CHO細(xì)胞、HBT5637(特開(kāi)昭63-299)等。
作為向動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入重組載體的方法，只要是能向動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入DNA的方法均可使用?？闪信e出例如電穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸鈣法(特開(kāi)平2-227075)、脂轉(zhuǎn)染法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)〕、Virology，52，456(1973)等。
使用昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，例如通過(guò)最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)、Bio/Technology，6，47(1988)等中記載的方法能夠表達(dá)多肽。
即，向昆蟲細(xì)胞中共同導(dǎo)入重組基因?qū)胼d體和桿狀病毒，從昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中得到重組病毒后，進(jìn)一步使昆蟲細(xì)胞感染該重組病毒，能夠表達(dá)多肽。
作為該方法所用的基因?qū)胼d體，可列舉出例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均為Invitorogen公司制)等。
作為桿狀病毒，可使用例如感染夜盜蛾科昆蟲的病毒——苜蓿夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus)等。
作為昆蟲細(xì)胞，可使用秋粘蟲的卵巢細(xì)胞Sf9、Sf21〔Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)〕、Trichoplusiani、粉紋夜蛾的卵巢細(xì)胞High 5(Invitrogen公司制)等。
作為調(diào)制重組病毒用的、向昆蟲細(xì)胞共同導(dǎo)入上述重組基因?qū)胼d體和桿狀病毒的方法，可列舉出例如磷酸鈣法(特開(kāi)平2-227075)、脂轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
使用植物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，作為表達(dá)載體，可列舉出例如Ti質(zhì)粒、煙草花葉病毒等。
作為啟動(dòng)子，只要是能在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的物質(zhì)均可使用?？闪信e出例如菜花樣花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子、水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子等。
作為宿主細(xì)胞，可列舉出煙草、馬鈴薯、西紅柿、胡蘿卜、大豆、油菜、紫花苜蓿、稻子、小麥、大麥等的植物細(xì)胞等。
作為重組載體的導(dǎo)入方法，只要是能向植物細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法均可使用，可列舉出例如使用土壤桿菌屬(Agrobacterium)(特開(kāi)昭59-140885、特開(kāi)昭60-70080、特開(kāi)昭WO94/00977)、電穿孔法(特開(kāi)昭60-251887)、粒子槍(基因槍)的方法(日本特許第2606856、日本特許第2517813)等。
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)以上所得轉(zhuǎn)化體，使培養(yǎng)物中蓄積生成稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，通過(guò)從該培養(yǎng)物中采集的方法，能夠制備稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體的方法，可參照培養(yǎng)宿主所用的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。
該轉(zhuǎn)化體為以大腸菌等原核生物或酵母等真核生物為宿主時(shí)得到的轉(zhuǎn)化體時(shí)，作為培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，只要是含有使該轉(zhuǎn)化體可以利用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類等、并能有效進(jìn)行該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基均可。
作為碳源，只要是能使該轉(zhuǎn)化體可以利用的物質(zhì)均可，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等的碳水化合物、乙酸、丙酸等的有機(jī)酸、乙醇、丙醇等的醇類等。
作為氮源，可使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽，其他的含氮化合物，以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆糟及大豆糟水解物、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。
作為無(wú)機(jī)鹽，可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)應(yīng)在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度可為15～40℃，培養(yǎng)時(shí)間通常為16小時(shí)～7天。培養(yǎng)中的pH優(yōu)選保持在3.0～9.0。PH的調(diào)整可用有機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、銨等。
并且根據(jù)需要，也可在培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素或四環(huán)素等抗生素。
在用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子作啟動(dòng)子的重組載體上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，根據(jù)需要，可向培養(yǎng)基中添加誘發(fā)因子。例如，通過(guò)使用lac啟動(dòng)子的重組載體培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)可向培養(yǎng)基中添加異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷等，通過(guò)使用trp啟動(dòng)子的重組載體培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)可向培養(yǎng)基中添加吲哚丙烯酸。
作為培養(yǎng)以動(dòng)物細(xì)胞為宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可使用常用的RPMI1640培養(yǎng)基[The Journal of the American MedicalAssociation，199，519(1967)]、Eagle氏MEM培養(yǎng)基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco改良MEM培養(yǎng)基[Virology，8，396(1959)]、199培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950)]或向這些培養(yǎng)基中添加胎牛血清等的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在的條件下進(jìn)行1～7天。
并且根據(jù)需要，也可在培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基中添加卡那霉素或青霉素等抗生素。
作為培養(yǎng)以昆蟲細(xì)胞為宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可使用常用的TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen公司制)、Sf-900 II SFM培養(yǎng)基(Life Technologies公司制)、ExCell400、ExCell405(均為JRHBiosciences公司制)、Grace′s Insect Medium〔Nature，195，788(1962)〕等。
培養(yǎng)通常在pH6～7、25～30℃等的條件下進(jìn)行1～5天。
并且根據(jù)需要，也可在培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基中添加慶大霉素等抗生素。
以植物細(xì)胞為宿主得到的轉(zhuǎn)化體作為細(xì)胞，可使植物的細(xì)胞或器官分化進(jìn)行培養(yǎng)。作為培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可使用常用的Murashige&Skoogl(MS)培養(yǎng)基、懷特(White)培養(yǎng)基、或向這些培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等植物激素的培養(yǎng)基等。
培養(yǎng)通常在pH5～9、20～40℃等的條件下進(jìn)行3～60天。
并且根據(jù)需要，也可在培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基中添加卡那霉素或潮霉素等抗生素。
如上所述，通過(guò)對(duì)源自具有整合入編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA的重組載體的微生物、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體采用常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)生成蓄積，由該培養(yǎng)物中收集稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，可制備稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。
通過(guò)酵母、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞表達(dá)時(shí)，能夠得到添加有糖或糖鏈的蛋白質(zhì)。
作為生產(chǎn)稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的形態(tài)，除了以原結(jié)構(gòu)制備稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)以外，參照分子克隆第3版所記載的方法，可以作為連接標(biāo)記肽的融合蛋白質(zhì)，或作為連接信號(hào)序列的分泌蛋白質(zhì)來(lái)制備。
作為融合標(biāo)記肽，可列舉出myc多肽、β-半乳糖苷酶、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合領(lǐng)域、氯霉素·乙?；D(zhuǎn)移酶、聚(精氨酸)、聚(谷氨酸)、蛋白質(zhì)G、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、聚組氨酸鏈(His-tag)、S肽、DNA結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)、Tac抗原、硫氧還蛋白、綠熒光蛋白、FLAG肽及任意抗體的表位等。作為信號(hào)序列，可列舉出任意的分泌蛋白質(zhì)的信號(hào)序列〔山川彰夫，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，13，469-474(1995)〕。
作為稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，有宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的方法、宿主細(xì)胞外分泌的方法、或宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)的方法，通過(guò)改變使用的宿主細(xì)胞或生產(chǎn)的宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)可以選擇該方法。
稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)或宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)時(shí)，通過(guò)參照Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.，264，17619(1989)]、Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)]、或特開(kāi)平5-336963、WO94/23021等中記載的方法，可以使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)向宿主細(xì)胞外積極的分泌。
即，使用基因重組的方法，通過(guò)在含有稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)活性部位的多肽的前端添加信號(hào)肽的形式表達(dá)，可以使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)向宿主細(xì)胞外積極的分泌。
此外，參照特開(kāi)平2-227075記載的方法，通過(guò)使用二氫葉酸還原酶的基因等的基因擴(kuò)增系統(tǒng)，也可以提高生產(chǎn)量。
并且，通過(guò)導(dǎo)入基因的動(dòng)物或植物細(xì)胞的再分化，制造導(dǎo)入基因的動(dòng)物個(gè)體(轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物)或植物個(gè)體(轉(zhuǎn)基因植物)，利用該個(gè)體也可以制備稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。
當(dāng)轉(zhuǎn)化體為動(dòng)物個(gè)體或植物個(gè)體時(shí)，參照常規(guī)方法飼養(yǎng)或栽培，使該蛋白質(zhì)蓄積生成，通過(guò)從該動(dòng)物個(gè)體或植物個(gè)體中采集該蛋白質(zhì)，可以制備稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。
作為使用動(dòng)物個(gè)體的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的制備方法，可列舉出例如可參照公知的方法[American Journal of ClinicalNutrition，63，639S(1996)、American Journal of ClinicalNutrition，63，627S(1996)、Bio/Technology，9，830(1991)]導(dǎo)入基因而形成的動(dòng)物中稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的制備方法。
動(dòng)物個(gè)體情況下，例如，飼養(yǎng)導(dǎo)入編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，使該蛋白質(zhì)在動(dòng)物中生成蓄積，通過(guò)從該動(dòng)物個(gè)體中采集該蛋白質(zhì)，可以制備稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。作為在該動(dòng)物中生成蓄積的部位，可列舉出例如動(dòng)物的乳(特開(kāi)昭63-309192)、卵等。此時(shí)作為所用的啟動(dòng)子，只要是能在動(dòng)物中表達(dá)的啟動(dòng)子均可使用，例如優(yōu)選使用乳腺細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的α酪蛋白啟動(dòng)子、β酪蛋白啟動(dòng)子、β乳球蛋白啟動(dòng)子、乳清酸性蛋白啟動(dòng)子等。
作為使用植物個(gè)體的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的制備方法，可列舉出例如參照公知的方法[組織培養(yǎng)，20(1994)、組織培養(yǎng)，21(1995)、Trends in Biotechnology，15，45(1997)]栽培導(dǎo)入編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)基因植物，使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)在該植物中生成蓄積，通過(guò)從該植物個(gè)體中采集稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，可以制備稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。
為分離精制由上述轉(zhuǎn)化體制備的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，可使用通常的酶的分離精制法。例如，稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)以溶解狀態(tài)表達(dá)時(shí)，培養(yǎng)終止后，通過(guò)對(duì)細(xì)胞離心分離進(jìn)行回收，在水系緩沖液中進(jìn)行混懸、通過(guò)超聲波粉碎機(jī)、涂刮機(jī)、Manton·Gaulin式均化器、細(xì)胞粉碎機(jī)(dynomill)進(jìn)行破碎細(xì)胞，得到無(wú)細(xì)胞提取液。從離心分離該無(wú)細(xì)胞提取液得到的上清液中，使用通常的酶的分離精制法，即單獨(dú)或組合使用溶劑提取法、采用硫銨等的鹽析法、脫鹽法、采用有機(jī)溶劑等的沉淀法，采用二乙氨基乙基(DEAE)瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75(三菱化學(xué)公司制)等樹(shù)脂的陰離子交換色譜法，采用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等樹(shù)脂的陽(yáng)離子交換色譜法，采用丁基纖維素、苯基纖維素等樹(shù)脂的疏水性色譜法，使用分子篩的凝膠過(guò)濾法、親和層析法、層析聚焦等，等電點(diǎn)電泳等的電泳法等方法，能夠得到精制標(biāo)準(zhǔn)品。
此外，當(dāng)稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)形成不溶物而表達(dá)時(shí)，通過(guò)進(jìn)行同樣的細(xì)胞回收后，破碎、離心分離，回收作為沉淀級(jí)分的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的不溶物?；厥盏某砗相堰恃苌锝Y(jié)合蛋白質(zhì)的不溶物用蛋白質(zhì)改性劑變?yōu)榭扇芑?。稀釋且透析該可溶性溶液，通過(guò)降低該可溶性溶液中的蛋白質(zhì)改性劑的濃度，使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)恢復(fù)正常的立體結(jié)構(gòu)。該操作后，通過(guò)與上述相同的分離精制法，可得到稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的精制標(biāo)準(zhǔn)品。
稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)或稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)中添加有糖鏈的該蛋白質(zhì)的衍生物在細(xì)胞外分泌時(shí)，可以從培養(yǎng)上清液中回收該蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)的衍生物。即，通過(guò)用與上述相同的方法對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離處理獲得上清液，通過(guò)用與上述相同的分離精制法從該培養(yǎng)上清液中，可以得到精制標(biāo)準(zhǔn)品。
并且，稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)可以使用編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA在體外的轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)來(lái)制造。
作為體外轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)，可參照公知的方法[Kigawa T.等，J.Biomol.NMR，6，129(1998)、Spirin A.S.等，Science，242，1162(1988)、Kigawa T.&Yokoyama S.，J.Biochem.，110，166(1991)]使用體外轉(zhuǎn)錄·翻譯系統(tǒng)。即，將編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA連接在SP6、T7、T3等啟動(dòng)子的下游處，通過(guò)與各自的啟動(dòng)子特異性RNA聚合酶反應(yīng)，在體外合成大量的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)RNA后，利用無(wú)細(xì)胞系的翻譯系統(tǒng)，例如使用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物、小麥胚芽提取液或大腸桿菌提取液等的翻譯系統(tǒng)，可以生成稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)。從該反應(yīng)液中，通過(guò)同樣的分離精制法，可以得到精制標(biāo)準(zhǔn)品。
此外，用于本發(fā)明探索方法的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)可通過(guò)Fmoc法(芴基甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化學(xué)合成法進(jìn)行制造?；蛘?，也可利用Advanced ChemTech公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、島津制作所等的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
作為如此取得的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，可列舉出例如含有用序列號(hào)1～3任一可表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
具有用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)抗糖尿病作用的物質(zhì)的探索方法。
具有抗糖尿病作用的物質(zhì)可通過(guò)以下步驟獲得①測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)接觸時(shí)的該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量；②測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)接觸時(shí)的該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量；③比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下的該測(cè)定值；④選擇因被檢物質(zhì)而阻礙該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合的物質(zhì)。
作為上述方法所使用的稠合嘌呤衍生物，可列舉出用上述2的方法制備的上述1的化合物，作為稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，可列舉出如上述4[2]的方法制備的上述4[1]的蛋白質(zhì)。具體來(lái)說(shuō)，可列舉出上述4[1](5)的(i)～(iii)的蛋白質(zhì)。
作為測(cè)定稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合體的量的方法，可列舉出例如通過(guò)結(jié)合介入特異性識(shí)別選自將稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的任意一方的分子通過(guò)物理吸附、共價(jià)鍵結(jié)合等在多孔板、色譜載體或膠乳等的珠、表面胞質(zhì)團(tuán)共振測(cè)定用的芯片或質(zhì)量測(cè)定用的靶等的固相或與稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體等、標(biāo)記肽、肽標(biāo)記物和信號(hào)肽中的肽的分子，根據(jù)需要實(shí)施抑制非特異性吸附的封閉等的處理后，添加其他分子，進(jìn)一步清洗除去未被吸附的其他分子，根據(jù)作為其他分子的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)或稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的活性、結(jié)合特性、表面胞質(zhì)團(tuán)共振的發(fā)生、或質(zhì)量分析的信號(hào)強(qiáng)度等檢出結(jié)合的其他分子，來(lái)檢出稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合量的方法。
通過(guò)用上述方法的任意一種比較被檢物質(zhì)存在下的稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合量和被檢物質(zhì)不存在下的該結(jié)合量，可以從被檢物質(zhì)中選擇以稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合的阻礙活性為指標(biāo)的具有抗糖尿病作用的物質(zhì)。
該物質(zhì)為具有抗糖尿病作用，例如具有胰島素分泌促進(jìn)作用的物質(zhì)可通過(guò)使胰臟β細(xì)胞或含有該細(xì)胞的組織與上述被選物質(zhì)在葡萄糖存在下接觸時(shí)，由該物質(zhì)使胰臟β細(xì)胞的胰島素分泌被促進(jìn)的方法來(lái)確認(rèn)〔Diabetorogia，36，1139(1993)〕。
使用稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的探索方法與稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)可通過(guò)以下步驟獲得①測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)的該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量；②測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)的該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量；③比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下的該測(cè)定值；④選擇因被檢物質(zhì)而阻礙稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合的物質(zhì)后，⑤利用④的步驟得到的物質(zhì)，選擇與稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)。
上述①～④的步驟可依據(jù)上述3的方法進(jìn)行。作為用上述①～④的步驟從被選物質(zhì)中選擇出與稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的方法，可列舉出例如根據(jù)標(biāo)記測(cè)定、比較使標(biāo)記化的該物質(zhì)與胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，標(biāo)記化的該物質(zhì)和來(lái)自胰臟的細(xì)胞或組織或它們的處理物以外的細(xì)胞等相接觸時(shí)的該物質(zhì)的活性，通過(guò)選擇胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合性高的物質(zhì)，選擇與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的方法。結(jié)合活性可參照上述3[3]的方法測(cè)定。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的與稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的探索方法。
在上述4[4]的方法中，代替胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物，使用由上述4[1]和[2]的方法得到的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，通過(guò)用上述4[4]①～④的步驟選擇的物質(zhì)，參照上述4[3]的方法，可獲得與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)。
此外，稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合可作為稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)與其他的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)來(lái)制備，也可通過(guò)使用帶有與被融合的蛋白質(zhì)的親和性的物質(zhì)特異性檢出選自標(biāo)記肽、肽標(biāo)記物或信號(hào)肽的肽來(lái)測(cè)定。例如，作為被融合的肽使用β-半乳糖苷酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白等時(shí)以該酶活性為指標(biāo)，使用綠熒光蛋白(GFP)等時(shí)以熒光為指標(biāo)，使用蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合領(lǐng)域、聚(精氨酸)、聚(谷氨酸)、蛋白質(zhì)G、麥芽糖結(jié)合多肽、聚組氨酸鏈(His-tag)、DNA結(jié)合多肽區(qū)等時(shí)以與其特異性結(jié)合分子的結(jié)合為指標(biāo)，使用myc多肽、S肽、Tac抗原、FLAG肽、任意抗體的表位等時(shí)以與特異性抗體的結(jié)合為指標(biāo)，能夠檢出。
β-半乳糖苷酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、綠熒光蛋白(GFP)、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合領(lǐng)域、聚(精氨酸)、聚(谷氨酸)、蛋白質(zhì)G、麥芽糖結(jié)合多肽、聚組氨酸鏈(His-tag)、DNA結(jié)合多肽片段等與它們的特異性抗體結(jié)合為指標(biāo)也能檢出。
此外，將稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)和稠合嘌呤衍生物的任意一方或雙方在與生物素的結(jié)合中具有特異性的分子或熒光試劑、RI標(biāo)記試劑等修飾后，通過(guò)使用上述反應(yīng)系，使用生物素等的結(jié)合特異性結(jié)合固相，或以生物素等的結(jié)合特異性或熒光、放射性等為指標(biāo)也能檢出相互作用。
并且，將蛋白質(zhì)和多肽用適當(dāng)?shù)臒晒馍貥?biāo)記，通過(guò)熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)，利用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)的只發(fā)出的熒光，可以在溶液系中檢出稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)和稠合嘌呤衍生物的相互作用。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的使與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的活性變化的物質(zhì)的探索方法使與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)活性變化的物質(zhì)可通過(guò)以下步驟獲得①測(cè)定被檢物質(zhì)和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)接觸時(shí)的該蛋白質(zhì)的活性；②測(cè)定不接觸被檢物質(zhì)時(shí)的該蛋白質(zhì)的活性；③比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下的該測(cè)定值；④選擇因被檢物質(zhì)而使該蛋白質(zhì)活性變化的物質(zhì)。
作為上述方法使用的稠合嘌呤衍生物，可列舉出用上述2的方法制備的上述1的化合物，作為稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，可列舉出用上述4[2]的方法制備的上述4[1]的蛋白質(zhì)。
在該蛋白質(zhì)的活性公知的情況下可參照公知的方法測(cè)定該酶的活性。
例如，作為該蛋白質(zhì)，使用含有用序列號(hào)1表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)時(shí)，該活性可參照Biochem.Biophys.Acta，1338，47(1977)記載的方法進(jìn)行測(cè)定。
具體來(lái)說(shuō)，可使用成為該蛋白質(zhì)的底物的NADP、NADPH或視黃醛、視黃醇、對(duì)氯苯甲醛等的醇、醛[Biochimica et Biophysica Acta，1338，47(1997)]等，通過(guò)用分光光度測(cè)定、熒光光度測(cè)定、或高效液相色譜等監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)引起的底物消失速度或產(chǎn)物的分解速度，可以測(cè)定該蛋白質(zhì)的活性。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的抑制稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)的探索方法。
抑制稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)可以從使上述[6]的方法得到的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的活性發(fā)生變化的物質(zhì)中選擇作為使該蛋白質(zhì)的活性降低的物質(zhì)。
此外，抑制稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的活性的物質(zhì)可通過(guò)以下步驟獲得調(diào)制稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基質(zhì)衍生物，向兩者結(jié)合的檢出體系中添加被檢物質(zhì)，以被檢物質(zhì)引起的該結(jié)合的阻礙為指標(biāo)，選擇作為阻礙稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基質(zhì)衍生物相結(jié)合的化合物。
具體來(lái)說(shuō)，可以從根據(jù)上述[3]的方法所選擇的與稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)相結(jié)合的化合物中，選擇抑制稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的活性的物質(zhì)。
此外，通過(guò)①測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的底物衍生物的結(jié)合量；②測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該蛋白質(zhì)和該蛋白質(zhì)的底物衍生物的結(jié)合量；③比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下的該測(cè)定值；④通過(guò)選擇因被檢物質(zhì)而阻礙該蛋白質(zhì)和該蛋白質(zhì)的底物衍生物的結(jié)合的物質(zhì)，也可以選擇抑制稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的活性的物質(zhì)。
這里，稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基質(zhì)衍生物是指從可成為稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基質(zhì)而得到的物質(zhì)中衍生出的物質(zhì)，具體來(lái)說(shuō)，例如作為稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，使用序列號(hào)1表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)時(shí)，作為該蛋白質(zhì)基質(zhì)衍生物，可列舉出NADP、NADPH的衍生物或視黃醛、視黃醇、對(duì)氯苯甲醛等的醇、醛等的成為該蛋白質(zhì)的基質(zhì)而得到的物質(zhì)的衍生物[Biochimica et BiophysicaActa，1338，47(1997)]。
作為更具體的方法，可以通過(guò)結(jié)合介入特異性識(shí)別選自將稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基質(zhì)衍生物的任意一方的分子通過(guò)物理吸附、共價(jià)鍵結(jié)合等在多孔板、色譜載體或乳膠等的珠、表面胞質(zhì)團(tuán)共振測(cè)定用的芯片或質(zhì)量測(cè)定用靶等的固相或與稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體等、標(biāo)記肽、肽標(biāo)記物和信號(hào)肽中的肽的分子，根據(jù)需要實(shí)施抑制非特異性吸附的封閉等的處理后，添加其他分子，進(jìn)一步清洗除去未吸附的其他分子，根據(jù)作為其他分子的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的活性、結(jié)合特性、表面胞質(zhì)團(tuán)共振的發(fā)生、或質(zhì)量分析的信號(hào)強(qiáng)度等檢出結(jié)合的其他分子，來(lái)檢出稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基質(zhì)衍生物的結(jié)合量。
通過(guò)從[5]～[7]的任意方法中選出2種以上的方法進(jìn)行組合，可以從由[5]～[7]的方法所選的物質(zhì)中，獲得作為胰島素促泌劑的具有優(yōu)選活性的化合物。此外，根據(jù)需要，通過(guò)下述[11]的方法，能夠獲得作為胰島素促泌劑的具有更優(yōu)選活性的化合物。
作為胰島素促泌劑具有良好活性的化合物是指例如作為胰島素促泌劑的不良活性低的化合物?？闪信e出例如，以往的胰島素促泌劑具有的副作用——體重減少、骨髓抑制、肝臟損害、腎毒性、神經(jīng)毒性等減輕的化合物。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的功能變化的物質(zhì)的探索方法使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的功能變化的物質(zhì)可通過(guò)以下步驟獲得①測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體接觸時(shí)的該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞應(yīng)答；②測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下的該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞應(yīng)答；③比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下的該測(cè)定值；④選擇因被檢物質(zhì)而使該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞應(yīng)答發(fā)生變化的物質(zhì)。
表達(dá)稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體可通過(guò)上述4[2](2)的方法進(jìn)行調(diào)制。
作為被檢物質(zhì)和該轉(zhuǎn)化株接觸時(shí)的該轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞應(yīng)答，可列舉出例如細(xì)胞內(nèi)信息傳遞、基因轉(zhuǎn)錄、糖的攝取、增殖等的變化等，這些變化可用公知的方法進(jìn)行檢出。
作為更具體的細(xì)胞的應(yīng)答，可列舉出例如花生四烯酸游離、乙酰膽堿游離、細(xì)胞內(nèi)Ca2+游離，細(xì)胞內(nèi)cAMP生成，細(xì)胞內(nèi)cGMP生成，肌醇磷酸產(chǎn)生、細(xì)胞膜電位改變、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化、c-fos活化、pH的降低，黑色素的凝集或擴(kuò)散，胰島素的分泌促進(jìn)等。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的使編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量變化的物質(zhì)的探索方法。
使編碼與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量變化的物質(zhì)可通過(guò)以下步驟獲得①測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體接觸時(shí)的該轉(zhuǎn)化體的編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量；②測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下的該轉(zhuǎn)化體的編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量；③比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下的該測(cè)定值；④選擇因被檢物質(zhì)而使編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量發(fā)生變化的物質(zhì)。
作為具體的方法，表達(dá)與被檢物質(zhì)接觸和不接觸的稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)，根據(jù)常規(guī)方法從上述4[2](2)的方法可以調(diào)制的各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞中調(diào)制總RNA或聚(A)+RNA，使用從編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA中調(diào)制而成的引物DNA，通過(guò)RT-PCR[PCRProtocols、Academic Press(1990)]測(cè)定編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量，通過(guò)比較各表達(dá)量，獲得使編碼稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量變化的物質(zhì)。
使用稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的使稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)量變化的物質(zhì)的探索方法。
使與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的表達(dá)量變化的物質(zhì)可通過(guò)以下步驟獲得①測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體接觸時(shí)的該轉(zhuǎn)化體的蛋白質(zhì)的表達(dá)量；②測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下的該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的表達(dá)量；③比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下的該測(cè)定值；④選擇因被檢物質(zhì)而使該蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生變化的物質(zhì)。
表達(dá)與稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體可通過(guò)上述4[2](2)的方法進(jìn)行調(diào)制。
作為測(cè)定稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)量的方法可舉出免疫學(xué)定量法。
作為免疫學(xué)定量法，可列舉出例如使用在液相中和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體中表位不同的2種的單克隆抗體的夾心ELISA法，使用125I等的放射性同位素標(biāo)記的識(shí)別稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)和該蛋白質(zhì)的抗體的放射免疫分析法等。
與稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體，使用該蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)的部分片段肽的精制品，通過(guò)公知的方法可以制備為多克隆抗體、單克隆抗體等。
胰島素分泌促進(jìn)活性評(píng)價(jià)作為胰島素分泌促進(jìn)活性的評(píng)價(jià)體系，也可以利用公知的任何方法。
作為使用動(dòng)物的方法，可列舉出例如采用Wistar系大鼠給藥被檢物質(zhì)時(shí)，進(jìn)行口服糖負(fù)荷試驗(yàn)，選擇有血糖抑制效果但又不引起低血糖的被檢物質(zhì)的方法(WO00/01388)。
使用摘除組織或培養(yǎng)組織的方法，使用作為在胰臟胰島、初代培養(yǎng)細(xì)胞胰臟β細(xì)胞、培養(yǎng)β細(xì)胞之中顯示相應(yīng)于5～10mmol/l的葡萄糖濃度的生理變化顯示胰島素分泌功能的培養(yǎng)β細(xì)胞BRIN-BD11細(xì)胞[Diabetes，45，1132-1140(1996)]、INS-1細(xì)胞[Endocrinology，130，167-178(1992)]、βTC細(xì)胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，85，9037-9041(1988)]、或MIN6細(xì)胞[Endocrinology，127，126-132(1990)]，選擇在低葡萄糖濃度下即使添加被檢物質(zhì)也不會(huì)促進(jìn)胰島素分泌，而在高葡萄糖濃度下添加被檢物質(zhì)也只有高葡萄糖單獨(dú)促進(jìn)胰島素分泌的被檢物質(zhì)的方法(特開(kāi)昭2000-154139)。
在培養(yǎng)β細(xì)胞株中，胰臟β細(xì)胞MIN6細(xì)胞[Endocrinology，127，126-132(1990)]胰島素含量和受葡萄糖刺激而使胰島素分泌量近似于生物體內(nèi)的胰臟β細(xì)胞，在應(yīng)答葡萄糖濃度、胰島素分泌上升這一點(diǎn)上良好的保存了生物體內(nèi)的胰臟β細(xì)胞的性質(zhì)[Endocrinology，127，126-132(1990)]。此外，MIN6細(xì)胞從對(duì)作為糖尿病治療藥而使用的磺酰脲類藥物，例如從格列本脲的應(yīng)答、促進(jìn)胰島素分泌這一點(diǎn)上來(lái)看而更優(yōu)選〔Cellular Signalling，5，777-786(1993)〕。
MIN6細(xì)胞的培養(yǎng)和使用MIN6細(xì)胞的胰島素分泌試驗(yàn)可參照Diabetologia，36，1139-1145(1993)中記載的方法進(jìn)行。
此外，化合物對(duì)胰島素分泌活性的影響，如下述那樣，可通過(guò)測(cè)定收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的胰島素含量而求出。
將24孔板中培養(yǎng)的MIN6細(xì)胞，用1ml含有2mmol/l葡萄糖的緩沖液A[119mmol/l氯化鈉、4.74mmol/l氯化鉀、2.54mmol/l氯化鈣、1.19mmol/l硫酸鎂、1.19mmol/l磷酸二氫鉀、10mmol/l2-[4-(2-羥乙基)-1-哌啶基]乙磺酸、0.1％牛血清白蛋白pH7.3]清洗2次后，在1ml的含有2mmol/l葡萄糖的緩沖液A中，在37℃下溫育45分鐘。溫育后，將培養(yǎng)上清液和各種濃度的試驗(yàn)化合物和含有8.4mmol/l的葡萄糖緩沖液A(1ml)交換，再在37℃下溫育45分鐘，收集培養(yǎng)上清液。從培養(yǎng)上清液中分泌出的抗體反應(yīng)性胰島素用含有1％牛血清白蛋白、0.1％Tween20、0.12％EDTA·2Na、0.1％迭氮化鈉的磷酸緩沖液稀釋后，用放射免疫分析法定量。以人胰島素為標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以由曲線算出各自的胰島素的含量。并且，能夠以添加代替試驗(yàn)化合物的溶劑——二甲基亞砜時(shí)得到的胰島素值為100％，計(jì)算各自的測(cè)定值的相對(duì)量(％)。
通過(guò)本發(fā)明方法選擇的具有胰島素分泌促進(jìn)活性的化合物作為通過(guò)本發(fā)明方法選擇的具有胰島素分泌促進(jìn)活性的化合物，可舉出如下述通式(V)所表示的化合物。
[式中，R1B、R2B、R3B相同或不同，表示氨基、單或二取代氨基、或含有N的取代或非取代雜環(huán)基(該雜環(huán)基通過(guò)N原子與三嗪環(huán)結(jié)合)]作為通過(guò)N原子與三嗪環(huán)結(jié)合的雜環(huán)基，可列舉出吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、嘌呤基、吡咯烷基、2，5-二氧基吡咯烷基、噻唑烷基、噁唑烷基、2-氧基噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、嗎啉基、硫代碼啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、四氫喹喔啉基、八氫喹啉基、二氫吲哚基、1，3-二氧異吲哚基等。
上述式(V)的各基的定義中，取代的意義是指例如由取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基而發(fā)生的取代等。
這里，取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基分別與上述式(II)的定義中的取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基同義。
更具體的說(shuō)，可列舉出如下述表2中記載的化合物編號(hào)193～200所表示的化合物。
表2 上述化合物可參照WO01/47921中記載的方法和公知的普通合成方法來(lái)合成。也可由ChemBrige公司購(gòu)入。
含有通過(guò)本發(fā)明方法所選物質(zhì)的藥物含有由本發(fā)明方法所選物質(zhì)為有效成分的藥物，雖可以單獨(dú)給藥該有效成分，但通常希望提供作為將該有效成分與藥理學(xué)允許的一種或一種以上的載體一起混合，用制劑學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中熟知的任意方法制備的藥品。優(yōu)選使用水或食鹽、甘氨酸、葡萄糖、人白蛋白等的水溶液的水性載體中溶解的無(wú)菌溶液。此外，也可添加使制劑溶液接近生理?xiàng)l件的緩沖劑或等滲劑那樣的藥用添加劑，例如醋酸鈉、氯化鈉、乳酸鈉、氯化鉀、檸檬酸鈉等。并且，冷凍干燥而儲(chǔ)藏，在使用時(shí)也可添加適當(dāng)溶劑使其溶解。
給藥途徑期望采用治療時(shí)最有效果的給藥途徑，可列舉出口服給藥或口腔內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi)等的非口服給藥。給藥劑型可列舉出噴霧劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、貼劑等。
作為口服給藥的適當(dāng)制劑，可列舉乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等。例如乳劑和糖漿劑這樣的液體調(diào)制物可使用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等的糖類；聚乙二醇、丙二醇等的二元醇類；芝麻油、橄欖油、大豆油等的油類；對(duì)羥基苯甲酸酯類等的防腐劑；草莓香料、薄荷香料等的香料類等作為添加劑來(lái)制造。膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等的賦形劑、淀粉、藻酸鈉等的崩解劑、硬脂酸鎂、滑石粉等的潤(rùn)滑劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等的粘合劑、脂肪酸酯等的表面活性劑、甘油等的增塑劑等作為添加劑來(lái)制造。
作為非口服給藥的適當(dāng)劑型，可列舉出注射劑、栓劑、噴霧劑等。例如，注射劑使用鹽溶液、葡萄糖溶液或以上兩者的混合物組成的載體來(lái)調(diào)制。栓劑使用可可豆脂、氫化脂肪或羧酸等的載體來(lái)調(diào)制。此外，噴霧劑使用該物質(zhì)本身乃至那些不刺激服藥者的口腔和氣管粘膜，并且可使該物質(zhì)以細(xì)小顆粒分散而容易吸收的載體進(jìn)行調(diào)制。作為載體具體可舉例乳糖、甘油等。根據(jù)該物質(zhì)和使用載體的性質(zhì)不同，可以是氣溶膠劑、干粉劑等的制劑。此外，在這些非口服制劑中也可添加作為口服制劑中的添加劑而舉例的成分。
給藥劑量或給藥次數(shù)以治療效果為目的，根據(jù)給藥方法、治療期間、年齡、體重等而不同，通常成人為每日10μg/kg～8g/kg。


圖1的A表示使用胰臟β細(xì)胞時(shí)的用3H標(biāo)記的化合物16所表示的化合物的結(jié)合飽和曲線圖。圖中，○-○表示總結(jié)合量，○----○表示非特異性結(jié)合量，●-●表示特異性結(jié)合量。
圖1的B為上述A的斯卡查德曲線圖。
圖2表示對(duì)于使用胰臟β細(xì)胞時(shí)的用3H標(biāo)記的化合物16所表示的化合物的特異性結(jié)合，稠合嘌呤衍生物的阻礙作用和胰島素分泌促進(jìn)作用的相關(guān)性圖。
圖3的A表示使用胰臟β細(xì)胞膜級(jí)分時(shí)的用3H標(biāo)記的化合物16所表示的化合物的結(jié)合飽和曲線圖。圖中，▲----▲表示總結(jié)合量，○---○表示非特異性結(jié)合量，●-●表示特異性結(jié)合量。
圖3的B為上述A的斯卡查德曲線圖。
圖4表示對(duì)于使用胰臟β細(xì)胞膜級(jí)分時(shí)的用3H標(biāo)記的化合物編號(hào)16所表示的化合物的特異性結(jié)合，稠合嘌呤衍生物的阻礙作用和胰島素分泌促進(jìn)作用的相關(guān)性圖。圖的標(biāo)記位置的數(shù)字表示化合物的編號(hào)。化合物編號(hào)中，95*表示化合物95的酒石酸鹽。
圖5表示使用胰臟β細(xì)胞的可溶性級(jí)分時(shí)的用3H標(biāo)記的化合物16所表示的化合物的結(jié)合圖。
圖6表示用9％的丙烯酰胺凝膠對(duì)重組His-p31進(jìn)行SDS-PAGE的結(jié)果圖。條1為精制的重組His-p31，條M為電泳分子量標(biāo)記物的條。箭頭表示重組His-p31蛋白質(zhì)的位置。
圖7表示使用各化合物的BIAcore計(jì)算出的His-p31蛋白質(zhì)和化合物155所表示的化合物(以下稱化合物155)的結(jié)合阻礙作用和胰島素分泌促進(jìn)活性的相關(guān)性圖。圖的曲線上的數(shù)字表示化合物編號(hào)。
圖8表示使用MIN6細(xì)胞的細(xì)胞提取液和稠合嘌呤衍生物固定化顆粒的探索胰島素促泌劑的圖。表示使用9％的丙烯酰胺凝膠進(jìn)行的SDS-PAGE圖。條1為使用未固定化合物155的顆粒從MIN6細(xì)胞提取液中精制出的蛋白質(zhì)，條2為使用化合物155固定化顆粒從MIN6細(xì)胞提取液中精制出的p31蛋白質(zhì)，條3為使用化合物155固定化顆粒，用化合物16表示的化合物從預(yù)處理過(guò)的MIN6細(xì)胞提取液中精制的蛋白質(zhì)，條4為使用化合物155固定化顆粒，用化合物17表示的化合物從預(yù)處理過(guò)的MIN6細(xì)胞提取液中精制出的蛋白質(zhì)，條M表示電泳分子量標(biāo)記物。箭頭表示p31蛋白質(zhì)的位置。
具體實(shí)施例方式
以下根據(jù)實(shí)施例、試驗(yàn)例說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例、試驗(yàn)例。
實(shí)施例1 標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物的合成如下式(VI)所示的化合物16的3H標(biāo)記物(以下稱為[3H]標(biāo)記化合物16)能夠以參照WO00/01388記載的方法合成的上述表1中化合物編號(hào)23表示的化合物的R體為原料，通過(guò)3H-gas法，由AmershamPharmacia公司合成。
實(shí)施例2 胰臟β細(xì)胞的破碎液的調(diào)制將MIN6細(xì)胞〔Endocrinology，127，126-132(1990)〕置于細(xì)胞培養(yǎng)用燒瓶(182cm2、Gliner公司制)中，在37℃、5％CO2氣氛下，用含15％胎牛血清和5g/l葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)基，日水制藥公司制)培養(yǎng)，直至匯合。并且以下操作均在冰上進(jìn)行。
MIN6細(xì)胞匯合后，除去培養(yǎng)基，用30ml冰冷卻過(guò)的磷酸緩沖生理鹽水(PSS)清洗2次。然后，添加用冰冷卻后的Tris-HCl緩沖液[10mmol/l三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mmol/l氯化鈉(NaCl)、2mmol/l乙二胺四乙酸(EDTA)、10μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、1mmol/l苯甲基磺酰氟(PMSF)、pH7.4]3ml，用細(xì)胞刮板剝離貼著燒杯的細(xì)胞，再用巴氏吸量管回收細(xì)胞。通過(guò)再重復(fù)一遍該操作，從182cm2燒瓶中得到6ml的細(xì)胞混懸液，將該細(xì)胞混懸液用勻槳機(jī)破碎細(xì)胞后，用離心分離機(jī)Himac CF7D2(日立公司制)，在4℃、10分鐘、每分3500轉(zhuǎn)下離心分離，回收其上清液作為細(xì)胞破碎液。
實(shí)施例3 胰臟β細(xì)胞的膜級(jí)分的調(diào)制將實(shí)施例2得到的細(xì)胞破碎液用離心分離機(jī)Himac CP100α(日立制作所制)、用轉(zhuǎn)頭RP50T(日立制作所制)在4℃、30分鐘、每分35000轉(zhuǎn)下離心分離后，廢棄上清液，向殘留的沉淀中加入冰冷卻過(guò)的上述Tris-HCl緩沖液，用帶有18G(Terumo社制)針頭的注射器(Terumo社制)混懸。再用離心分離機(jī)Himac CP100α、轉(zhuǎn)頭RP50T(日立制作所社制)在4℃、30分鐘、每分35000轉(zhuǎn)下離心分離后，棄去上清液，向沉淀中加入適量的冰冷卻過(guò)的Tris-HCl緩沖液，用帶有25G(Terumo社制)針頭的注射器(Terumo社制)混懸而得的物質(zhì)作為MIN6細(xì)胞的膜級(jí)分。
實(shí)施例4 胰臟β細(xì)胞的可溶化膜級(jí)分的調(diào)制將實(shí)施例3的膜級(jí)分加入冰冷卻過(guò)的可溶性緩沖液〔20mmol/lTris-HCl、500mmol/l氯化鉀(KCl)、2mmol/l EDTA、10μg/mLleupeptin、1mmol/l PMSF、1w/v％洋地黃皂苷(digitonin)、pH7.4〕6ml進(jìn)行混懸。用勻漿器均化后，直接在冰上放置30分鐘。然后用離心分離機(jī)Himac CP100α(日立制作所社制)、轉(zhuǎn)頭RP50T在4℃、60分鐘、每分35000轉(zhuǎn)下離心分離，回收所得上清液作為可溶化膜級(jí)分。再向沉淀中加入冰冷卻過(guò)的可溶性緩沖液3ml，再重復(fù)上述操作2次，將所得上清液全部混合作為可溶化膜級(jí)分。
實(shí)施例5 使用胰臟β細(xì)胞和標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)將在細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板(Corning公司制)上培養(yǎng)至大致匯合狀態(tài)的MIN6細(xì)胞用KRH緩沖液(119mmol/l NaCl、4.74mmol/l KCl、2.54mmol/l氯化鈣(CaCl2)、1.19mmol/l硫酸鎂(MgSO4)、1.19mmol/l磷酸二氫鉀(KH2PO4)、10mmol/l HEPES、2mmol/l葡萄糖、0.1w/v％牛血清白蛋白(BSA)、pH7.3)清洗2次后，向每個(gè)孔中添加KRH緩沖液1ml，在37℃下預(yù)溫育45分鐘。預(yù)溫育后除去上清液，添加0.15ml的KRH緩沖液和10nmol/l的[3H]標(biāo)記化合物16和被檢物質(zhì)使其濃度為1μmol/l，在4℃下至反應(yīng)到達(dá)平衡時(shí)為止溫育1小時(shí)以上后，使用KRH緩沖液清洗細(xì)胞2次。向每個(gè)孔中添加KRH緩沖液2ml，在室溫下放置20分鐘后，再用KRH緩沖液進(jìn)行清洗，通過(guò)使用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定各孔中殘留的放射活性來(lái)求出結(jié)合量。
將不添加被檢化合物條件下的[3H]標(biāo)記化合物16的結(jié)合量(總結(jié)合量)和10μmol/l化合物16存在下的[3H]標(biāo)記化合物16的結(jié)合量(非特異性結(jié)合量)的差作為特異性結(jié)合量。
將圖1A中的結(jié)合飽和曲線表示為圖1B中的斯卡查德曲線圖。由圖可知，使用胰臟β細(xì)胞能夠檢出與稠合嘌呤衍生物的特異性結(jié)合。此外，表3中由稠合嘌呤衍生物引起的[3H]標(biāo)記化合物16結(jié)合阻礙作用和胰島素分泌促進(jìn)活性的測(cè)定值表示為圖2中的該阻礙作用和胰島素分泌促進(jìn)作用的相關(guān)性?？芍獌勺饔玫南嚓P(guān)系數(shù)為0.679，為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相關(guān)。
表3

實(shí)施例6 使用胰臟β細(xì)胞的膜級(jí)分和標(biāo)記化稠合嘌呤衍生物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)向細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板(Corning公司制)中加入膜級(jí)分(150μg/ml)、[3H]標(biāo)記化合物16和含有未放射標(biāo)記的被檢化合物的如實(shí)施例2所述的Tris-HCl緩沖液，在室溫下溫育1小時(shí)。再通過(guò)用采集器Filtermate 196-UniFilter 24(Packard公司制)抽濾，在UniFilter-24GF/B filter plate(Packard公司制)上回收膜級(jí)分，將該膜級(jí)分用1ml的洗滌緩沖液(10mmol/l Tris-HCl、100mmol/l NaCl、2mmol/l EDTA 0.1w/v％BSA、pH7.4)清洗4次，干燥后，以150μl/孔添加Microscinti 20(Packard公司制)，使用微板閃爍計(jì)數(shù)器Top Count(Packard公司制)測(cè)定放射活性。以不添加化合物16時(shí)的放射活性作為總結(jié)合量，以添加10μmol/l化合物16時(shí)的放射活性作為非特異性結(jié)合量，用總結(jié)合量減去非特異性結(jié)合量的差作為特異性結(jié)合量。
將圖3A中的結(jié)合飽和曲線表示為圖3B中的斯卡查德曲線圖。由結(jié)果可知，通過(guò)使用胰臟β細(xì)胞的膜級(jí)分，可以檢出與稠合嘌呤衍生物的特異性結(jié)合。此外，圖4顯示了由稠合嘌呤衍生物引起的[3H]標(biāo)記化合物16結(jié)合阻礙作用和胰島素分泌促進(jìn)作用的相關(guān)性?？芍獌勺饔玫南嚓P(guān)系數(shù)為0.705，為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相關(guān)。
實(shí)施例7 使用胰臟β細(xì)胞的可溶化膜級(jí)分的結(jié)合實(shí)驗(yàn)除了使用蛋白質(zhì)濃度為500μg/ml的可溶化膜級(jí)分以外，用與上述實(shí)施例6相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此外，在調(diào)制溶解液為目標(biāo)濃度時(shí)，可使用不含表面活性劑的可溶化緩沖液，稀釋至溶解液中表面活性劑的濃度為0.1w/v％。因此，溫育溶液的組成為0.1w/v％の洋地黃皂苷、20mmol/l Tris-HCl、500mmol/l KCl、2mmol/l EDTA、10μg/mL亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、1mmol/l PMSF、pH為7.4。
以不添加化合物16表示的化合物時(shí)的放射活性作為總結(jié)合量，以添加10μmol/l該化合物時(shí)的放射活性作為非特異性結(jié)合量，用總結(jié)合量減去非特異性結(jié)合量的差作為特異性結(jié)合量。
圖5表示總結(jié)合量和非特異性結(jié)合量。由結(jié)果可知，通過(guò)使用胰臟β細(xì)胞的可溶化膜級(jí)分，可檢出稠合嘌呤衍生物的特異性結(jié)合。
實(shí)施例8 胰島素分泌量的測(cè)定MIN6細(xì)胞的培養(yǎng)和使用MIN6細(xì)胞的胰島素分泌試驗(yàn)參照Diabetorogia，36，1139-1145(1993)中記載的方法進(jìn)行。
即，在14.5mmol/l的葡萄糖存在下，化合物對(duì)胰島素分泌活性的影響可通過(guò)測(cè)定用下述方法收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的胰島素的量來(lái)評(píng)價(jià)。
將在24孔板上培養(yǎng)的MIN6細(xì)胞用含2mmol/l葡萄糖的緩沖液A(119mmol/l NaCl、4.74mmol/l KCl、2.54mmol/l CaCl2、1.19mmol/l MgSO4、1.19mmol/l KH2PO4、10mmol/l 2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸、0.1％BSA、pH7.3)清洗2次后，在1ml的含2mmol/l葡萄糖的緩沖液A中，在37℃溫育45分鐘后，將培養(yǎng)上清液與各種濃度的試驗(yàn)化合物和含8.4mmol/l葡萄糖的緩沖液A(1ml)交換，再在37℃溫育45分鐘，收集培養(yǎng)上清液。
從培養(yǎng)上清液中分泌出的抗體反應(yīng)性胰島素用含有1％BSA、0.1％Tween20、0.12％EDTA·2Na、0.1％迭氮化鈉的磷酸緩沖液稀釋后，用放射免疫分析法〔Methods in Investigative and DiagnosticEndocrinology，Vol.2A，2B，North-Holland Publishing Co.，Amsterdam(1973)〕定量。以人胰島素為標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以由該曲線算出各自的胰島素的含量。
實(shí)施例9 以微生物的培養(yǎng)液為探索源的具有抗糖尿病作用物質(zhì)的探索方法。
依據(jù)實(shí)施例6的方法，可以使用胰臟β細(xì)胞膜級(jí)分，從微生物的培養(yǎng)液中選擇出具有抗糖尿病作用的物質(zhì)。
采用平板稀釋法將從土壤中分離出來(lái)的微生物在裝有由0.5％葡萄糖、3.0％可溶性淀粉、2.0％大豆粉、0.5％酵母提取物、0.5％玉米漿、0.3％碳酸鈣(CaCO3)(蒸煮前pH7.2)組成的培養(yǎng)基的試管中，在28℃、攪拌機(jī)上培養(yǎng)4天。培養(yǎng)結(jié)束后，添加與培養(yǎng)液同量的二甲基亞砜進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，用離心分離機(jī)將固體成分和上清液分離。向2μl上清液中添加如實(shí)施例6所述的胰臟β細(xì)胞的膜級(jí)分0.15ml和含有10nmol/l的[3H]標(biāo)記化合物16的溶液，在室溫下溫育1小時(shí)。同時(shí)制作含有添加50％二甲基亞砜代替培養(yǎng)上清液的胰臟β細(xì)胞膜級(jí)分0.15ml和含有10nmol/l的[3H]標(biāo)記化合物16的溶液以及制作了再向其中添加10μomol/l非標(biāo)記化合物16的溶液，進(jìn)行同樣的溫育。
溫育結(jié)束后，以實(shí)施例6記載的方法回收、洗滌膜級(jí)分，測(cè)定膜中殘留的放射活性。以添加非標(biāo)記化合物16時(shí)得到的放射活性作為非特異性結(jié)合量，以不添加化合物16時(shí)的放射活性作為總結(jié)合量，以實(shí)施例6記載的方法計(jì)算各自的特異性結(jié)合量。采用計(jì)算出的結(jié)合量，由下式求出各自的培養(yǎng)上清液的結(jié)合阻礙率。
結(jié)合阻礙率(％)＝(50％二甲基亞砜存在下的特異性結(jié)合量-培養(yǎng)上清液存在下的特異性結(jié)合量)/50％二甲基亞砜存在下的特異性結(jié)合量×100實(shí)施例10 用化合物庫(kù)作為探索源的具有抗糖尿病作用的物質(zhì)的探索方法按實(shí)施例5記載的方法，探索以對(duì)胰臟β細(xì)胞和[3H]標(biāo)記化合物16的結(jié)合的阻礙作用為指標(biāo)的具有抗糖尿病作用的物質(zhì)。將被檢物質(zhì)溶解在二甲基亞砜中，添加至最終濃度為1μmol/l。以添加非標(biāo)記化合物16時(shí)得到的放射活性作為非特異性結(jié)合量，以不添加化合物16時(shí)的放射活性作為總結(jié)合量，按實(shí)施例6記載的方法計(jì)算各自的特異性結(jié)合量，用下式求出結(jié)合阻礙率。
結(jié)合阻礙率(％)＝(50％二甲基亞砜存在下的特異性結(jié)合量-培養(yǎng)上清液存在下的特異性結(jié)合量)/50％二甲基亞砜存在下的特異性結(jié)合量×100探索了7000種化合物的結(jié)果，顯示可以選擇在10μmol/l濃度下有84％的阻礙率的具有如下式(VII)所表示的結(jié)構(gòu)的化合物。
具有式(VII)所表示的結(jié)構(gòu)的化合物(用表4的化合物編號(hào)193表示的化合物。以下稱為化合物193)的胰島素分泌促進(jìn)作用可根據(jù)實(shí)施例8記載的方法進(jìn)行測(cè)定。其結(jié)果顯示，以化合物16引起的分泌促進(jìn)量為100％時(shí)，該化合物的胰島素分泌促進(jìn)量為195％(表4)。
此外，當(dāng)化合物193的類似物——下述表4的化合物編號(hào)194～199表示的化合物為10μmol/l的濃度時(shí)，化合物編號(hào)200表示的化合物為1μmol/l的濃度時(shí)，確認(rèn)有胰島素分泌促進(jìn)活性(表4)。
表4
綜上所述，本發(fā)明的探索方法顯示有用性。
上述化合物除了可以從ChemBrige公司購(gòu)入外，也可參照WO01/47921中記載的方法和公知的一般合成方法進(jìn)行合成。
實(shí)施例11 稠合嘌呤衍生物固定化顆粒的制備作為稠合嘌呤衍生物，選擇上述表1中化合物155表示的化合物用于實(shí)驗(yàn)。
離心分離(1000rpm，1分鐘，室溫)1ml的NHS活化瓊脂糖凝膠顆?；鞈乙?Amersham Pharmacia Bio-tech公司制)，向除去上清液的小球加入5ml的THF使顆粒分散后，離心分離顆粒除去上清液。將此操作反復(fù)進(jìn)行3次。
在置換溶劑為THF的500μl的NHS活化瓊脂糖凝膠顆粒的小球上加入化合物196的溶液，使NHS活化瓊脂糖凝膠顆粒分散。此時(shí)的溶劑為THF，體積為500μl，化合物155的濃度為6mmol/l。一邊不時(shí)攪拌一邊使其在室溫下反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離(1000rpm，1分鐘，室溫)顆粒，除去上清液。
為除去未反應(yīng)的化合物155，加入5ml的THF使顆粒分散后，離心分離顆粒(1000rpm，1分鐘，室溫)除去上清液，將此操作反復(fù)進(jìn)行3次。為使沒(méi)有反應(yīng)的顆粒狀反應(yīng)點(diǎn)失活，加入5ml含有200mmol/l單乙醇胺的THF溶液使顆粒分散，靜置10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(1000rpm，1分鐘，室溫)除去上清液。為除去未反應(yīng)的單乙醇胺，加入5ml的THF使顆粒分散后，離心分離(1000rpm，1分鐘，室溫)顆粒除去上清液。將此操作反復(fù)進(jìn)行3次。
將由此所得化合物155固定化顆粒分散到THF中至濃度為500μl顆粒/ml后，在遮光條件、4℃下保存。
實(shí)施例12 細(xì)胞提取液的調(diào)制小鼠胰臟β細(xì)胞MIN6的培養(yǎng)為在425ml的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(日水制藥社制)中加入FBS 75ml、7.5％碳酸氫鈉(NaHCO3)8.5ml、200mmol/l的L-谷氨酰胺5ml、青霉素(Penicillin)-鏈霉素(Streptomycin)(分別為10000單位/ml和10mg/ml的混合液)2.5ml的培養(yǎng)基中使用培養(yǎng)皿，在37℃的溫育中靜置培養(yǎng)。
MIN6匯合后，用37℃的PBS清洗細(xì)胞2次，用4℃的緩沖液A[20mmol/l HEPES，pH7.4，2mmol/l EDTA，1mmol/l PMSF，1μg/ml抑肽酶]剝離細(xì)胞。在4℃下用旋轉(zhuǎn)機(jī)平穩(wěn)攪拌30分鐘。然后通過(guò)離心分離(12000rpm，5分鐘，4℃)使不溶性級(jí)分沉淀，以上清液作為可溶級(jí)分。將小球在緩沖液B[20mmol/l HEPES，pH7.4，2mmol/l EDTA，150mmol/l NaCl，1％洋地黃皂苷，1mmol/l PMSF，1μg/ml抑肽酶]中混懸，在4℃下用旋轉(zhuǎn)機(jī)平穩(wěn)攪拌30分鐘。然后通過(guò)離心分離(12000rpm，5分鐘，4℃)使不溶性級(jí)分沉淀，以上清液作為可溶化膜級(jí)分。用該方法得到了蛋白質(zhì)濃度約3mg/ml的可溶級(jí)分和可溶化級(jí)分。將可溶級(jí)分和可溶化級(jí)分在-80℃下保存。
實(shí)施例13 稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的獲得將實(shí)施例12制備的MIN6的可溶化膜級(jí)分用緩沖液B稀釋10倍的溶液1ml加入500μmol/l的化合物編號(hào)16表示的化合物(以下稱為化合物16)，在4℃下平穩(wěn)攪拌2小時(shí)。作為對(duì)照將不加入化合物16的MIN6的可溶化膜級(jí)分用緩沖液C〔20mmol/l HEPES(pH7.4)、2mmol/l EDTA、150mmol/l NaCl、1％洋地黃皂苷、1mmol/l PMSF、1μg/ml抑肽酶〕稀釋10倍的溶液1ml在4℃下平穩(wěn)攪拌2小時(shí)。然后在加入化合物16的可溶化膜級(jí)分和不加入被檢物質(zhì)的可溶性膜級(jí)分溶液中加入固定了實(shí)施例8制作的化合物編號(hào)155表示的化合物的顆粒(以下稱化合物155固定化顆粒)，在4℃下平穩(wěn)攪拌30分鐘。然后通過(guò)離心分離(12000rpm，1分鐘，4℃)使顆粒沉淀除去上清液。然后加入750μl緩沖液C，攪拌3秒鐘，通過(guò)離心分離(12000rpm，1分鐘，4℃)使顆粒沉淀除去上清液。然后再加入750μl緩沖液D[20mmol/l HEPES(pH7.4)、2mmol/l EDTA]，攪拌3秒鐘，通過(guò)離心分離(12000rpm，1分鐘，4℃)使顆粒沉淀除去上清液。然后加入含β-巰基乙醇的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品緩沖液30μl，進(jìn)行與化合物155固定化顆粒結(jié)合的蛋白質(zhì)的洗脫，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過(guò)由加入化合物16的細(xì)胞提取液中的化合物155固定化顆粒來(lái)精制，發(fā)現(xiàn)了化合物16表示的化合物引起的對(duì)化合物155固定化顆粒的特異性結(jié)合受阻的p31蛋白質(zhì)。
使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳從凝膠中切出已分離的p31蛋白質(zhì)，在25mmol/l Tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)中，與0.3μg的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(和光純藥社制)一起在37℃下反應(yīng)13個(gè)小時(shí)。回收由賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶消化得到的含有肽片段的反應(yīng)上清液。用反相HPLC分離肽。柱子使用Magic C18(0.2mm I.D.×5cm、MichromBioResources公司制)，通過(guò)使乙腈濃度從5％直線上升到60％的梯度來(lái)洗脫肽。分離出的肽分取于試管中，用氣相蛋白序列分析儀Procise492cLC(Applied Biosystems公司制)確定氨基酸序列。序列號(hào)11表示確定的氨基酸序列。
將含有賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶消化后的p31蛋白質(zhì)的凝膠片再放在100mmol/l Tris-鹽酸緩沖液(pH8.8)中，與0.3μg的胰蛋白酶(序列級(jí)，Roche Diagnostics公司制)一起在37℃下反應(yīng)13個(gè)小時(shí)。胰蛋白酶消化后得到的肽片段與上述相同的方法用反相HPLC分離，確定其氨基酸序列。序列號(hào)12表示確定的氨基酸序列。
序列號(hào)11和12表示的氨基酸序列，對(duì)PIR蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)施同源性檢索的結(jié)果，確定由來(lái)自序列號(hào)2表示的小鼠NADPH依賴性視黃醇脫氫酶/還原酶的氨基酸序列的N末端起第199個(gè)氨基酸殘基到第209個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列與N末端起第34個(gè)氨基酸殘基到第40個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列一致。
實(shí)施例14 p31蛋白質(zhì)的調(diào)制[1]從小鼠胰臟β細(xì)胞株(MIN6)中制備p31 cDNA克隆化和His-p31蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒。
以對(duì)從小鼠胰臟β細(xì)胞株(MIN6)中提取出的總RNA為模板，將寡dT為引物合成單鏈cDNA。以該單鏈cDNA作為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reactionPCR)法調(diào)制編碼全長(zhǎng)p31蛋白質(zhì)的基因部分，通過(guò)重組由NOVAGEN公司購(gòu)買的大腸桿菌表達(dá)載體pET-14b，構(gòu)建在N末端添加了His標(biāo)記的His-p31蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒。以下詳細(xì)說(shuō)明。
用MIN6細(xì)胞，根據(jù)常規(guī)方法[Biochemistry，18，5294(1977)]從提取的總RNA1μg中，使用單鏈cDNA合成試劑盒SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(GIBCO BRL公司制)，以寡dT作為引物合成單鏈cDNA。將上述得到的單鏈cDNA的0.4％作為PCR的模板使用。
作為PCR用的引物組，使用GENSET公司合成的由序列號(hào)7和8表示的堿基序列構(gòu)成的合成DNA。
設(shè)計(jì)在由序列號(hào)7表示的堿基序列構(gòu)成的DNA中導(dǎo)入NdeI位點(diǎn)，在由序列號(hào)8表示的堿基序列構(gòu)成的合成DNA中導(dǎo)入BamHI位點(diǎn)。
PCR使用Pyrobest DNA聚合酶(寶酒造社制)進(jìn)行。反應(yīng)液參照該聚合酶的使用說(shuō)明書進(jìn)行調(diào)制，使用GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems)，在95℃下溫育5分鐘后，進(jìn)行94℃下30秒，65℃下1分鐘和72℃下2分鐘的反應(yīng)30次循環(huán)后，再在72℃、7分鐘溫育進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，使用DNA精制試劑盒Prep-A-GeneDNA Purification Systems(BIO-RAD公司制)精制DNA。
將上述DNA溶解在10μl的NEB2緩沖液(New England Biolab公司制)中，加入10個(gè)單位的NdeI和10個(gè)單位的PstI，在37℃下進(jìn)行2小時(shí)的消化反應(yīng)。將該反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，回收約0.8kb的DNA片段。
將pET-14b 1μg溶解在20μl的NEB2緩沖液中，加入20個(gè)單位的NdeI和20個(gè)單位的PstI，在37℃下進(jìn)行2小時(shí)的消化反應(yīng)。將該反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，回收約3.4kb的DNA片段。
將pET-14b 1μg溶解在20μl的NEB2緩沖液中，加入20個(gè)單位的PstI和20個(gè)單位的BamHI，在37℃下進(jìn)行2小時(shí)的消化反應(yīng)。將該反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，回收約1.3kb的DNA片段。
將上述所得的來(lái)自用PCR擴(kuò)增的DNA的NdeI-BamHI片段(0.8kb)0.1μg，來(lái)自pET-14b的NdeI-PstI片段(3.4kb)0.03μg和PstI-BamHI片段(1.3kb)0.05μg溶解在10μl的T4 DNA連接酶緩沖液中，加入400個(gè)單位的T4 DNA連接酶，在16℃下進(jìn)行16小時(shí)的結(jié)合反應(yīng)。
用該反應(yīng)液將大腸桿菌BL21株(Stratagene公司制)用Cohen等人的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化體。參照公知的方法分離該轉(zhuǎn)化體保有的質(zhì)粒，通過(guò)限制酶消化來(lái)確定其結(jié)構(gòu)。將該質(zhì)粒命名為pET-14b-p31。
將上述獲得的質(zhì)粒pET-14b-p31的堿基序列用AppliedBiosystems公司制的堿基序列確定試劑盒(BigDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0)來(lái)確定。
其結(jié)果表明，本實(shí)施例中被克隆的基因編碼序列號(hào)2表示的260氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，該氨基酸序列與GenBank Accession No.AB045132.1中記載的來(lái)自小鼠的蛋白質(zhì)的氨基酸序列一致。
用大腸桿菌對(duì)His-p31蛋白質(zhì)的表達(dá)上述[1]中獲得的質(zhì)粒pET-14b-p31在大腸桿菌BL21株中用Cohen等人的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化株BL21/pET-14b-p31。將BL21/pET-14b-p31在裝有5ml的含有氨芐青霉素的L-肉湯〔10g/l細(xì)菌胰蛋白胨(DIFCO公司制)、5g/l酵母提取物(DIFCO公司制)、5g/lNaCl、75μg/ml氨芐青霉素〕的15ml容積的試管中，在37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)(220rpm)。然后，在加入50ml含有氨芐青霉素的L-肉湯的300ml容積的帶擋板的三角燒瓶中添加2.5ml上述培養(yǎng)液，在37℃下振蕩培養(yǎng)(220rpm)至OD(590nm)達(dá)到1.0為止，在4℃下保存。然后，在加入500ml含有氨芐青霉素的L-肉湯的2個(gè)2升容積的三角燒瓶中分別添加20ml上述培養(yǎng)液，在37℃下通氣攪拌培養(yǎng)(220rpm)至OD(590nm)達(dá)到0.9的時(shí)刻，添加表達(dá)誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-□-D-硫代半乳糖苷)至濃度為0.2mmol/l，誘導(dǎo)His-p31蛋白質(zhì)的表達(dá)。表達(dá)誘導(dǎo)后4小時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，離心分離培養(yǎng)液，獲得約6.6g(濕重)的菌體。
小鼠His-p31的調(diào)制從實(shí)施例5得到的培養(yǎng)基中的小鼠His-p31精制全部都在0～4℃的條件下，按以下方法進(jìn)行。
將上述[2]得到的培養(yǎng)菌體6.6g(濕重)在20ml勻漿液(20mmol/l磷酸鈉緩沖液，500mmol/l NaCl，5mmol/l咪唑，10mmol/l二硫蘇糖醇，pH7.4)中懸浮后，用超聲波粉碎機(jī)(家田貿(mào)易社制，Vibra-Cell，振幅水平70)在5秒鐘，破碎大腸桿菌10次左右，將破碎液在9000rpm下離心分離15分鐘，用濾膜過(guò)濾上清液(Millipore公司制；Millex-GV；0.22μm)，在下述條件下用金屬螯合物親和層析法精制濾液。
金屬螯合物親和層析條件柱子以24ml/小時(shí)的流速在20分鐘流過(guò)200mmol/l硫酸鋅水溶液后，再以6ml/小時(shí)的流速2小時(shí)流過(guò)，使鋅配位的ChelatingSepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech公司制，10×100mm)洗脫液A液(20mmol/l磷酸鈉緩沖液，500mmol/l NaCl，5mmol/l咪唑，pH7.4)1000ml、B液(20mmol/l磷酸鈉緩沖液，500mmol/l NaCl，500mmol/l咪唑，pH7.4)1000ml。
流速6ml/小時(shí)洗脫從A液到B液的直線濃度梯度洗脫洗脫液分成每級(jí)分1.3ml，各級(jí)分用巰基乙醇還原下的SDS-聚丙烯酰胺電泳分析，收集含有分子量31kDa附近的小鼠His-p31譜帶的級(jí)分，作為鋅螯合層析小鼠His-p31級(jí)分。
脫鹽處理鋅螯合層析小鼠p31級(jí)分，脫鹽處理按如下條件進(jìn)行。
柱子PD-10(Amersham Pharmacia Biotech公司制)洗脫液400mmol/l磷酸鉀緩沖液，pH7.4洗脫液分成每級(jí)分0.5ml，各級(jí)分用巰基乙醇還原下的SDS-聚丙烯酰胺電泳分析，收集含有分子量31kDa附近的小鼠His-p31譜帶的級(jí)分，作為PD-10小鼠His-p31級(jí)分。獲得的His-p31的SDS-PAGE解析結(jié)果如圖6所示。
小鼠His-p31的結(jié)構(gòu)確認(rèn)用上述[3]得到的小鼠His-p31蛋白質(zhì)解析通過(guò)凝血酶消化除去N末端的組氨酸標(biāo)記物后的N末端氨基酸序列。即對(duì)約10μg的His-p31添加100mU的生物素修飾凝血酶(biotinylated human thrombin；Novagen公司制)，在反應(yīng)液(20mmol/l Tris-HCl緩沖液，pH8.4，1.5mol/l NaCl，2.5mmol/l CaCl2)中，20℃、反應(yīng)15小時(shí)。將反應(yīng)液在2-巰基乙醇還原下進(jìn)行SDS-PAGE后，參照J(rèn).Biol.Chem.，262，10035-10038(1987)中記載的方法，向PVDF膜(proBlott；Applied Biosystems公司制)進(jìn)行電轉(zhuǎn)印。將轉(zhuǎn)印的膜用考馬斯藍(lán)染色，切出分子量約31kDa的帶，通過(guò)氣相蛋白序列分析儀(PPSQ-10；島津制作所制)用廠家推薦的方法解析N末端氨基酸序列。所得氨基酸序列正如序列號(hào)9表示的那樣，與從基因序列推定出的序列號(hào)2記載的氨基酸序列的從N末端起的第1個(gè)殘基開(kāi)始的序列一致。確認(rèn)序列號(hào)9表示的氨基酸序列中N末端起的第1個(gè)殘基到第3個(gè)殘基與來(lái)自pET-14b的載體的氨基酸序列一致，第4個(gè)殘基以后的序列與來(lái)自小鼠p31的氨基酸序列一致。
實(shí)施例15 使用p31蛋白質(zhì)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)使用在實(shí)施例14精制而成的His-p31按如下方式進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
將傳感器芯片CM5(BIAcore公司制)裝在BIAcore2000(BIAcore公司制)上，使用HBS-EP緩沖液(100mmol/l HEPES，5mmol/l NaCl，500mmol/l EDTA，0.005％聚山梨糖醇酯20v/v，pH7.4，0.22μm濾膜過(guò)濾)，并參照操作手冊(cè)，將該傳感器芯片在10℃下平衡化。
混合配基固定化用EDC試劑(N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，BIAcore公司制)和NHS試劑(N-羥基琥珀酰亞胺；BIAcore公司制)各50μl，將70μl以10μl/分的流速流入到傳感器芯片上使芯片表面活化。在固定化用緩沖液(20mmol/l碳酸鈉緩沖液，pH8.5)中溶解上述表1中的化合物編號(hào)155表示的化合物至100μl/ml。以10μl/分的流速注入到傳感器芯片上，固定至約50RU。
然后以10μl/分的流速注入70μl的1mol/l的乙醇胺，使傳感器芯片上未反應(yīng)的羧基反應(yīng)后，用10μl的100mol/l鹽酸清洗2次。
將在HBS-EP緩沖液中溶解實(shí)施例12精制而成的小鼠His-p31至100nmol/l的溶液作為His-p31溶液，將向His-p31溶液中加入各被檢物質(zhì)溶液至被檢物質(zhì)濃度為500μmol/l的溶液作為His-p31/被檢物質(zhì)溶液，用于結(jié)合實(shí)驗(yàn)。此外，將上述表1中的化合物編號(hào)16、17、36、38、103或144表示的化合物分別溶解于二甲基亞砜(DMSO)中至50mmol/l濃度的溶液，和表1中的化合物編號(hào)94或183表示的化合物分別溶解于DMSO中至10mmol/l濃度的溶液作為被檢物質(zhì)溶液使用。
使被檢物質(zhì)以20μl/分的流速用300秒流入傳感器芯片，流入結(jié)束15秒后測(cè)定結(jié)合量(RU)。傳感器芯片表面各120秒分別流入2mmol/l-鹽酸胍(guanidine-HCl)和10mmol/l甘氨酸-鹽酸(Glycine-HCl)而再生。
以p31溶液流入前的結(jié)合量(RU)為100％，以流入代替被檢物質(zhì)添加了DMSO的His-p31溶液時(shí)的結(jié)合量(RU)為0％，由流入His-p31/被檢物質(zhì)溶液時(shí)的結(jié)合量(RU)來(lái)?yè)Q算因各被檢物質(zhì)引起的與固定化化合物155的結(jié)合阻礙率(％)。
各被檢物質(zhì)的His-p31和固定化合物155表示的化合物的結(jié)合阻礙率(％)與用試驗(yàn)例1記載的方法測(cè)定的各被檢物質(zhì)的胰島素分泌促進(jìn)活性的相關(guān)性如圖7所示?？芍粰z物質(zhì)的His-p31和固定化合物編號(hào)155表示的化合物間的結(jié)合阻礙率(％)與該物質(zhì)的胰島素分泌促進(jìn)活性的相關(guān)系數(shù)為0.78，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義相關(guān)。
此外，上述被檢物質(zhì)參照WO00/01388、WO01/47931中記載的方法合成。
實(shí)施例16 使用細(xì)胞提取液和固定了化合物編號(hào)155表示的化合物的顆粒的胰島素分泌促進(jìn)活性的探索將實(shí)施例12制備的MIN6的可溶化膜級(jí)分用緩沖液B稀釋10倍的溶液1ml加入500μmol/l的被檢物質(zhì)(化合物編號(hào)16或17表示的化合物)，在4℃下平穩(wěn)攪拌2小時(shí)。作為對(duì)照將不加入被檢物質(zhì)的MIN6的可溶化膜級(jí)分用緩沖液C〔20mmol/l HEPES(pH7.4)、2mmol/lEDTA、150mmol/l NaCl、1％洋地黃皂苷、1mmol/l PMSF、1μg/ml抑肽酶〕稀釋10倍的溶液1ml在4℃下平穩(wěn)攪拌2小時(shí)。然后在加入被檢物質(zhì)的可溶化膜級(jí)分和不加入被檢物質(zhì)的可溶化膜級(jí)分溶液中加入固定了實(shí)施例8制作的化合物編號(hào)155表示的化合物的顆粒(以下稱化合物155固定化顆粒)，在4℃下平穩(wěn)攪拌30分鐘。然后通過(guò)離心分離(12000rpm，1分鐘，4℃)使顆粒沉淀除去上清液。然后加入750μl緩沖液C，攪拌3秒鐘，通過(guò)離心分離(12000rpm，1分鐘，4℃)使顆粒沉淀除去上清液。然后再加入750μl緩沖液D[20mmol/l HEPES(pH7.4)、2mmol/l EDTA]，攪拌3秒鐘，通過(guò)離心分離(12000rpm，1分鐘，4℃)使顆粒沉淀除去上清液。然后加入含β-巰基乙醇的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品緩沖液30μl，進(jìn)行與化合物155固定化顆粒結(jié)合的蛋白質(zhì)的洗脫，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果如圖8所示。
由不加入被檢化合物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中能夠確認(rèn)有p31蛋白質(zhì)的譜帶而加入被檢物質(zhì)化合物16的實(shí)驗(yàn)中不能確認(rèn)有p31蛋白質(zhì)的譜帶表明，化合物16阻礙化合物155固定化顆粒和p31蛋白質(zhì)的結(jié)合。另一方面，在使用化合物17作為被檢物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，可確認(rèn)有p31蛋白質(zhì)的譜帶表明，化合物17不能阻礙化合物155固定化顆粒和p31蛋白質(zhì)的結(jié)合。
實(shí)施例17 使用His-p31蛋白質(zhì)的胰島素促泌劑的探索(1)使用96孔板的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)向96孔ELISA板的各孔中添加含有10μg實(shí)施例12調(diào)制的His-p31蛋白質(zhì)的PBS溶液100μl，在4℃放置過(guò)夜而吸附，向各孔中添加300μl的1％的BSA/PBS，在4℃放置1小時(shí)而封閉。
用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的化合物編號(hào)155表示的化合物(以下稱FITC標(biāo)記化合物155)可通過(guò)市售的NHS-熒光素和上述表1中的化合物155表示的化合物在DMSO、室溫下混合3小時(shí)調(diào)制而成。
可以通過(guò)在100μmol/l的被檢物質(zhì)存在下或不存在下、使5μmol/l的FITC標(biāo)記化合物155 100μl接觸上述His-p31蛋白質(zhì)、除去上清液后、用含0.05％Tween20的PBS清洗、用熒光板讀數(shù)計(jì)測(cè)定殘存的FITC標(biāo)記化合物155，選擇對(duì)稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合有阻礙作用的物質(zhì)。
該物質(zhì)的胰島素分泌促進(jìn)活性可通過(guò)上述實(shí)施例8的方法來(lái)確認(rèn)。
實(shí)施例18 使用His-p31蛋白質(zhì)的胰島素促泌劑的探索(2)使用螯合瓊脂糖凝膠珠的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。
使表達(dá)實(shí)施例14調(diào)制的His-p31蛋白質(zhì)的基因重組大腸桿菌的培養(yǎng)物的破碎物上清液400μl和Zn2+離子螯合瓊脂糖凝膠10μl混合，結(jié)合該蛋白質(zhì)后，用PBS清洗，做成親和性小珠。該親和性小珠在500μmol/l的被檢物質(zhì)存在下或不存在下、與含有1μmol/l的FITC標(biāo)記化合物155的溶液1ml混合，除去上清液。洗凈該親和性小珠后，用1％SDS水溶液100μl提取殘存的FITC標(biāo)記化合物155，通過(guò)用分光熒光光度計(jì)測(cè)定提取液的熒光強(qiáng)度，可以選擇對(duì)稠合嘌呤衍生物和稠合嘌呤衍生物結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合有阻礙的物質(zhì)。
該物質(zhì)的胰島素分泌促進(jìn)活性可通過(guò)上述實(shí)施例8的方法來(lái)確認(rèn)。
實(shí)施例19 使用His-p31蛋白質(zhì)的胰島素促泌劑的探索(3)酶活性阻礙實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例12調(diào)制的His-p31蛋白質(zhì)1μg/ml加入到含有250μmol/l對(duì)氯苯甲醛的10mmol/l Tris-HCl、100mmol/l NaCl、2mmol/l EDTA(pH7.4)溶液1ml中至NADPH的濃度為5μmol/l，在37℃下溫育，在被物質(zhì)存在下和不存在下，用在340nm的吸光度檢出伴隨對(duì)氯苯甲醛分解的NADPH的減少。
測(cè)定使用化合物編號(hào)16或17表示的物質(zhì)作為被檢物質(zhì)時(shí)的His-p31蛋白質(zhì)的酶活性阻礙的結(jié)果，化合物編號(hào)16表示的化合物比化合物編號(hào)17表示的化合物更強(qiáng)地阻礙該蛋白質(zhì)的活性。
實(shí)施例20 使用His-p31蛋白質(zhì)的胰島素促泌劑的探索(4)
酶活性阻礙實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例12中調(diào)制的His-p31蛋白質(zhì)1μg/ml加入到含有250μmol/l對(duì)氯苯甲醛的10mmol/l Tris-HCl、100mmol/l NaCl、2mmol/l EDTA(pH7.4)溶液150μl中至NADPH的濃度為5μmol/l，在37℃下溫育5分鐘。向該反應(yīng)溶液中加入由0.2mol/l氰化鉀(KCN)、0.06mol/l氫氧化鉀(KOH)、1mol/l Bathophenanthrolinedisulfonic acid組成的溶液150μl，在室溫下放置5分鐘。再加入氯仿800μl混合后，在4℃、150000rpm下離心分離5分鐘。將上清液用0.2mol/l醋酸銨(pH6.0)稀釋4倍后，向HPLC中注入250μl?？梢酝ㄟ^(guò)在被檢物質(zhì)存在下和不存在下，用熒光檢測(cè)儀(330/460nm)檢出伴隨由p31引起的底物分解的NADPH的減少〔AnalyticalBiochemistry，228，312(1995)〕，選擇因被檢物質(zhì)而阻礙His-p31的活性的物質(zhì)。
所選物質(zhì)的胰島素分泌促進(jìn)活性可通過(guò)上述實(shí)施例8的方法來(lái)確認(rèn)。
實(shí)施例21 使用His-p31蛋白質(zhì)的胰島素促泌劑的探索(5)酶活性阻礙實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例12調(diào)制的His-p31蛋白質(zhì)做成濃度為0.1μg/ml的溶液A〔1％牛血清白蛋白、20％甘油、含1％CHAPS的20mmol/lHEPES-NaOH、50mmol/l KCl、3mmol/l MgCl2(pH7.5)〕和溶液B〔40μmol/l全反式視黃醛、25μmol/l NADPH、0.1％牛血清白蛋白、2％甘油、含0.1％CHAPS的40mmol/l HEPES·NaOH、100mmol/l KCl、6mmol/lMgCl2(pH7.5)〕。可以通過(guò)混合0.2ml溶液A和0.2ml溶液B，在32℃下溫育10分鐘，在被物質(zhì)存在下和不存在下，在340nm的吸光度下檢出伴隨視黃醛分解的NADPH的減少[Biochimica et BiophysicaActa，1338，47(1997)]，選擇因被檢物質(zhì)而阻礙His-p31蛋白質(zhì)的NADPH氧化活性的物質(zhì)。
所選物質(zhì)的胰島素分泌促進(jìn)活性可通過(guò)上述實(shí)施例8的方法來(lái)確認(rèn)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種使用稠合嘌呤衍生物的、不引起低血糖等的并發(fā)癥的糖尿病治療藥和胰島素促泌劑的探索方法。
序列表<110>協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社<120>具有抗糖尿病作用的物質(zhì)的探索方法<130>11486WO1<140>
<141>
<150>JP 2002-143599<151>2002-5-17<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>260<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ala Ser Ser Gly Met Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val1 5 10 15Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg20 25 30Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45Gln Asn Val Asp Gln Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser50 55 60Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg65 70 75 80Leu Val Ala Thr Ala Val Lys Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Ser Ile Met Asp Val Thr100 105 110
Glu Glu Val Trp Asp Lys Thr Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Pro Ala115 120 125Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140Ser Val Val Ile Val Ser Ser Ile Ala Ala Phe Ser Pro Ser Pro Gly145 150 155 160Phe Ser Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys165 170 175Thr Leu Ala Ile Glu Leu Ala Pro Arg Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Arg Met Leu Trp Met Asp195 200 205Lys Glu Lys Glu Glu Ser Met Lys Glu Thr Leu Arg Ile Arg Arg Leu210 215 220Gly Glu Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr245 250 255Pro Ser Arg Leu260<210>2<211>260<212>PRT<213>Mus musculus<400>2Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser Asn Lys Val1 5 10 15Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg20 25 30
Arg Leu Ala Glu Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser50 55 60Val Thr Gly Ile Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Lys65 70 75 80Leu Ile Thr Thr Ala Leu Lys Arg His Gln Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Asn Leu Met Asp Val Thr100 105 110Glu Glu Val Trp Asp Lys Val Leu Ser Ile Asn Val Thr Ala Thr Ala115 120 125Met Met Ile Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140Ser Val Val Ile Val Gly Ser Val Ala Gly Phe Thr Arg Phe Pro Ser145 150 155 160Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys165 170 175Asn Phe Ala Ala Glu Leu Ala Pro Lys Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Arg Phe Ser Ser Val Leu Trp Glu Glu195 200 205Lys Ala Arg Glu Asp Phe Ile Lys Glu Ala Met Gln Ile Arg Arg Leu210 215 220Gly Lys Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240Asp Ala Ser Tyr Ile Asn Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr245 250 255Pro Ser Arg Leu260
<210>3<211>260<212>PRT<213>Oryctolagus cuniculus<400>3Met Ala Ser Ser Gly Val Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val1 5 10 15Ala Ile Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Arg20 25 30Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Ile Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Ala Leu Gln Ala Glu Gly Leu Ser50 55 60Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg65 70 75 80Leu Val Ala Thr Ala Leu Asn Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Lys Leu Met Asp Val Thr100 105 110Glu Glu Val Trp Asp Lys Ile Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Met Ala115 120 125Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140Ser Val Val Ile Val Ala Ser Ile Ala Ala Phe Asn Pro Phe Ser Gly145 150 155 160Leu Gly Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Val Gly Leu Thr Lys165 170 175Asn Leu Ala Leu Glu Leu Ala Ala Gln Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190
Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Lys Ala Leu Trp Glu Asp195 200 205Lys Ala Gln Glu Glu Asn Ile Ile Gln Lys Leu Arg Ile Arg Arg Leu210 215 220Gly Lys Pro Glu Glu Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Ala Gly Gly Ala245 250 255Pro Ser Arg Leu260<210>4<211>780<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4atg gcc agc tcc ggg atg acc cgc cgg gac ccg ctc gca aat aag gtg 48Met Ala Ser Ser Gly Met Thr Arg Arg Asp Pro Leu Ala Asn Lys Val1 5 10 15gcc ctg gta acg gcc tcc acc gac ggg atc ggc ttc gcc atc gcc cgg 96Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg20 25 30cgt ttg gcc cag gac ggg gcc cat gtg gtc gtc agc agc cgg aag cag 144Arg Leu Ala Gln Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45cag aat gtg gac cag gcg gtg gcc acg ctg cag ggg gag ggg ctg agc 192Gln Asn Val Asp Gln Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser50 55 60gtg acg ggc acc gtg tgc cat gtg ggg aag gcg gag gac cgg gag cgg 240Val Thr Gly Thr Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Arg65 70 75 80ctg gtg gcc acg gct gtg aag ctt cat gga ggt atc gat atc cta gtc 288Leu Val Ala Thr Ala Val Lys Leu His Gly Gly Ile Asp Ile Leu Val
85 90 95tcc aat gct gct gtc aac cct ttc ttt gga agc ata atg gat gtc act 336Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Ser Ile Met Asp Val Thr100 105 110gag gag gtg tgg gac aag act ctg gac att aat gtg aag gcc cca gcc 384Glu Glu Val Trp Asp Lys Thr Leu Asp Ile Asn Val Lys Ala Pro Ala115 120 125ctg atg aca aag gca gtg gtg cca gaa atg gag aaa cga gga ggc ggc 432Leu Met Thr Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140tca gtg gtg atc gtg tct tcc ata gca gcc ttc agt cca tct cct ggc 480Ser Val Val Ile Val Ser Ser Ile Ala Ala Phe Ser Pro Ser Pro Gly145 150 155 160ttc agt cct tac aat gtc agt aaa aca gcc ttg ctg ggc ctg acc aag 528Phe Ser Pro Tyr Asn Val Ser Lys Thr Ala Leu Leu Gly Leu Thr Lys165 170 175acc ctg gcc ata gag ctg gcc cca agg aac att agg gtg aac tgc cta 576Thr Leu Ala Ile Glu Leu Ala Pro Arg Asn Ile Arg Val Asn Cys Leu180 185 190gca cct gga ctt atc aag act agc ttc agc agg atg ctc tgg atg gac 624Ala Pro Gly Leu Ile Lys Thr Ser Phe Ser Arg Met Leu Trp Met Asp195 200 205aag gaa aaa gag gaa agc atg aaa gaa acc ctg cgg ata aga agg tta 672Lys Glu Lys Glu Glu Ser Met Lys Glu Thr Leu Arg Ile Arg Arg Leu210 215 220ggc gag cca gag gat tgt gct ggc atc gtg tct ttc ctg tgc tct gaa 720Gly Glu Pro Glu Asp Cys Ala Gly Ile Val Ser Phe Leu Cys Ser Glu225 230 235 240gat gcc agc tac atc act ggg gaa aca gtg gtg gtg ggt gga gga acc 768Asp Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Val Val Val Gly Gly Gly Thr245 250 255ccg tcc cgc ctcPro Ser Arg Leu
260<210>5<211>780<212>DNA<213>Mus musculus<400>5atg gcc agt tcc ggg ttg act cgt cga aac cct ctc tcc aat aag gtg 48Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser Asn Lys Val1 5 10 15gcc ctg gtc aca gcc tcc acc gac ggg atc ggc ttt gcc atc gcc cgg 96Ala Leu Val Thr Ala Ser Thr Asp Gly Ile Gly Phe Ala Ile Ala Arg20 25 30cgc ctg gct gaa gat ggg gcc cac gtg gtc gtc agc agc cgc aaa cag 144Arg Leu Ala Glu Asp Gly Ala His Val Val Val Ser Ser Arg Lys Gln35 40 45cag aat gtg gac cgt gca gtg gcc aca cta cag gga gag ggc ctg agt 192Gln Asn Val Asp Arg Ala Val Ala Thr Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser50 55 60gtg act ggc atc gtg tgc cac gtg ggg aag gca gag gat cga gaa aag 240Val Thr Gly Ile Val Cys His Val Gly Lys Ala Glu Asp Arg Glu Lys65 70 75 80ctg ata acc acg gct ctg aag cgt cac cag ggg att gat atc ctg gtc 288Leu Ile Thr Thr Ala Leu Lys Arg His Gln Gly Ile Asp Ile Leu Val85 90 95tcc aat gct gct gtc aac cct ttc ttt gga aat cta atg gat gtc aca 336Ser Asn Ala Ala Val Asn Pro Phe Phe Gly Asn Leu Met Asp Val Thr100 105 110gag gag gtg tgg gac aag gtt ttg agc att aat gtg aca gct aca gcc 384Glu Glu Val Trp Asp Lys Val Leu Ser Ile Asn Val Thr Ala Thr Ala115 120 125atg atg att aaa gcg gtg gtg cca gag atg gaa aag cga gga ggc ggc 432Met Met Ile Lys Ala Val Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Gly Gly Gly130 135 140
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<400>9Gly Ser His Met Ala Ser Ser Gly Leu Thr Arg Arg Asn Pro Leu Ser1 5 10 15Asn Lys Val Ala20
權(quán)利要求
1.具有抗糖尿病作用的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，選自下述通式(I)或通式(II)表示的化合物中的化合物(以下簡(jiǎn)稱稠合嘌呤衍生物)和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而阻礙稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物結(jié)合的物質(zhì)的步驟， 式(I)中，R1A表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基，R2A表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基，R3A表示氫原子、低級(jí)烷基或取代或非取代芳烷基，X1和X2分別獨(dú)立地表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基，n表示0～3的整數(shù)， 式(II)中，X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳香族雜環(huán)基)或N＝C-W[式中，W表示鹵原子、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、-NR4R5(式中，R4和R5相同或不同，表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代的芳烷基，或者R4和R5與相鄰的氮原子一起形成雜環(huán)基)、-OR6(式中，R6表示取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳基，或取代或非取代的芳烷基)、-SR6a(式中R6a與前述R6同義)、取代或非取代低級(jí)烷基或氰基]，R2表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代的芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與前述R4和R5同義)、-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示鹵原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與前述R4和R5同義)、或-CHO，R3表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或低級(jí)烷氧基烷基，n表示0～3的整數(shù)，V1表示氫原子、取代或非取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、或取代或非取代芳香族雜環(huán)基，V2表示取代低級(jí)烷基、或取代或非取代芳香族雜環(huán)基；V1表示氫原子、低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基、且(a)X...Y...Z表示R1aN-C＝O(式中，R1a表示在前述R1的定義中除取代低級(jí)烷基以外的基團(tuán))，R2表示取代低級(jí)烷基、取代或非取代芳烷基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與前述同義)、-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示鹵原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與前述R4和R5同義)、或-CHO，或者(b)X...Y...Z表示R1N-C＝O(式中，R1與前述同義)，R3表示低級(jí)烷氧基烷基，或者(c)X...Y...Z表示R1bN-C＝O(式中，R1b表示取代低級(jí)烷基)，或者(d)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W與前述同義)，R2表示取代或非取代低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、取代或非取代芳基、取代或非取代芳香族雜環(huán)基、取代或非取代脂環(huán)式雜環(huán)基、鹵原子、低級(jí)烷硫基、-NR7R8(式中，R7和R8分別與前述同義)、或-CO2H、低級(jí)烷氧羰基、-COHal(式中，Hal表示鹵原子)、-CONR9R10(式中，R9和R10分別與前述同義)、或-CHO，或者(e)X...Y...Z表示N＝C-W(式中，W與前述同義)，R3表示低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、低級(jí)烷氧基烷基時(shí)，V2也可以表示低級(jí)烷基，取代或非取代芳烷基、或取代或非取代芳基。
2.具有抗糖尿病作用的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物和與該稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而阻礙該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
3.與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物與胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而阻礙稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物結(jié)合的物質(zhì)的步驟；[5]利用[4]得到的物質(zhì)，選擇與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
4.與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)存在下，權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物和該稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)接觸時(shí)，該稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)的結(jié)合量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而阻礙稠合嘌呤衍生物和該蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的步驟。
5.使與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)活性變化的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)與權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相接觸時(shí)，該蛋白質(zhì)的活性的步驟；[2]測(cè)定與被檢物質(zhì)不接觸時(shí)該蛋白質(zhì)的活性的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而使該蛋白質(zhì)活性變化的物質(zhì)的步驟。
6.抑制與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)與權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相接觸時(shí)，該蛋白質(zhì)的活性的步驟；[2]測(cè)定與被檢物質(zhì)不接觸時(shí)該蛋白質(zhì)的活性的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而抑制該蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)的步驟。
7.使與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)功能變化的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)與權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體相接觸時(shí)，該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞應(yīng)答的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下的該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞應(yīng)答的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而使該轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞應(yīng)答發(fā)生變化的物質(zhì)的步驟。
8.使編碼與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量變化的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)與權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體相接觸時(shí)，編碼該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下編碼該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而使編碼該蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)量發(fā)生變化的物質(zhì)的步驟。
9.使與該稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的表達(dá)量變化的物質(zhì)的探索方法，包括以下步驟[1]測(cè)定被檢物質(zhì)和表達(dá)與權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體相接觸時(shí)，該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的表達(dá)量的步驟；[2]測(cè)定被檢物質(zhì)不存在下該轉(zhuǎn)化體的該蛋白質(zhì)的表達(dá)量的步驟；[3]比較被檢物質(zhì)存在下和不存在下該測(cè)定值的步驟；[4]選擇因被檢物質(zhì)而使該蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生變化的物質(zhì)的步驟。
10.如權(quán)利要求1～9的任意一項(xiàng)所述的探索方法，稠合嘌呤衍生物為下述式(III)表示的化合物。
11.如權(quán)利要求2和4～9的任意一項(xiàng)所述的探索方法，其特征在于，使用固定了權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物的載體。
12.如權(quán)利要求11所述的探索方法，載體為瓊脂糖凝膠顆粒。
13.如權(quán)利要求11或12所述的探索方法，稠合嘌呤衍生物為下述式(IV)表示的化合物。
14.固定了權(quán)利要求1所述稠合嘌呤衍生物的載體。
15.如權(quán)利要求14所述的載體，稠合嘌呤衍生物為權(quán)利要求13所述的式(IV)表示的稠合嘌呤衍生物。
16.如權(quán)利要求14或15所述的載體，載體為瓊脂糖凝膠顆粒。
17.如權(quán)利要求2和4～13的任意一項(xiàng)所述的探索方法，與權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)為選自下述[i]～[iii]中的任意一種蛋白質(zhì)[i]具有用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；[ii]在用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中，由1個(gè)以上的氨基酸被缺失、置換、插入或添加而成的氨基酸序列組成，且與權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)；[iii]由具有與用序列號(hào)1～3中任一項(xiàng)表示的氨基酸序列60％以上相同性的氨基酸序列組成，且與權(quán)利要求1所述的稠合嘌呤衍生物相結(jié)合的蛋白質(zhì)。
18.由權(quán)利要求1～13和17的任意一項(xiàng)所述的探索方法得到的物質(zhì)或該物質(zhì)的可藥用鹽。
19.含有以權(quán)利要求18所述的物質(zhì)或該物質(zhì)的可藥用鹽為有效成分的藥物。
20.含有以權(quán)利要求18所述的物質(zhì)或該物質(zhì)的可藥用鹽為有效成分的糖尿病治療藥。
21.含有以權(quán)利要求18所述的物質(zhì)或該物質(zhì)的可藥用鹽為有效成分的胰島素促泌劑。
22.含有用下述通式(V)表示的化合物或其可藥用鹽為有效成分的胰島素促泌劑， 式(V)中，R1B、R2B、R3B相同或不同，表示氨基、單或二取代氨基、或含有N的取代或非取代雜環(huán)基，該雜環(huán)基通過(guò)N原子與三嗪環(huán)結(jié)合。
23.促進(jìn)胰島素分泌的方法，包括以權(quán)利要求22所述的通式(V)表示的化合物或其可藥用鹽的有效量給藥的步驟。
24.權(quán)利要求22所述的通式(V)表示的化合物或其可藥用鹽在制造胰島素促泌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種使用稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物或與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的，阻礙稠合嘌呤衍生物和胰臟β細(xì)胞或該細(xì)胞的處理物的結(jié)合的，阻礙稠合嘌呤衍生物和與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)相結(jié)合的，阻礙與稠合嘌呤衍生物結(jié)合的蛋白質(zhì)的表達(dá)、酶活性的物質(zhì)的探索方法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1668759SQ0381664
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月17日
發(fā)明者石黑博樹(shù), 大島由子, 杉本整治, 松原正浩, 上野公久, 森圣壽, 中西聰, 矢野浩史 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社