專利名稱：抗Ku86自身抗體的免疫測定方法、其中使用的試劑盒、及使用其的原發(fā)性肝細胞癌的判斷方法
抗Ku86自身抗體的免疫測定方法、其中使用的試劑盒、及使用其的原發(fā)性肝細胞癌的判斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定抗Ku86自身抗體的免疫測定方法及免疫測定用試劑盒?？?Ku86自身抗體特別是在原發(fā)性肝細胞癌患者的血中特異性地出現(xiàn)，從而，本發(fā)明不單單僅是提供測定自身抗體的方法，也可在原發(fā)性肝細胞癌的判斷中利用。
背景技術(shù)：
Ku86是與雙鏈DNA切斷相關(guān)的蛋白質(zhì)，與Ku70 —起，形成被稱為Ku的異源二聚體，該Ku異源二聚體與DNA依賴性蛋白激酶等共同可修復雙鏈DNA切斷(非專利文獻I)。另一方面，由向瓊脂糖2維電泳適用2D-DIGE法(二維熒光示差凝膠電泳， two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis)的改良瓊月旨糖2維電泳法(非專利文獻2)，通過蛋白質(zhì)組解析進行原發(fā)性肝細胞癌的癌部及周邊的非癌部組織的表達蛋白的量的比較，得知被稱為Ku86的蛋白質(zhì)在癌部多表達(非專利文獻3)。現(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻非專利文獻I: Li et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 9, No. 2,832-837, 2002非專利文獻2:TakeshiTomonaga et al. ,Clin. Cancer Res. 2004 ;10:2007_2014非專利文獻3:Masanori Seimiya et al. , Hepatology 2008 ；48:519-30

發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過測定在疑似患癌的患者或癌患者來源的組織待測樣品中存在的Ku86的表達水平，可進行它們的組織的癌部與非癌部的判別。本發(fā)明人再對血液待測樣品中的Ku86的存在進彳丁持續(xù)研究時，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，有在血液待測樣品中存在抗Ku86自身抗體的情況，在原發(fā)性肝細胞癌患者的情況中，其自身抗體的量特異性地多。從而，本發(fā)明的目的是提供，可應(yīng)用于原發(fā)性肝細胞癌判斷的，抗Ku86自身抗體的測定方法。解決課題的技術(shù)方案本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使待測樣品中的抗Ku86自身抗體與作為試劑的Ku86抗原反應(yīng)，并用標記抗人免疫球蛋白抗體測定生成的自身抗體和Ku86抗原的免疫復合物，可測定其自身抗體，由此可使癌判斷成為可能，從而完成本發(fā)明。從而，本發(fā)明涉及抗Ku86自身抗體的免疫測定方法，其特征在于，通過使待測樣品中的抗Ku86自身抗體與作為試劑的Ku86抗原反應(yīng)，并測定生成的抗Ku86自身抗體和 Ku86抗原的免疫復合物來測定其自身抗體。再者，本發(fā)明涉及抗Ku86自身抗體免疫測定用試劑盒，其特征在于，作為試劑成分含至少Ku86抗原。再者，本發(fā)明涉及原發(fā)性肝細胞癌判斷方法，其通過測定抗Ku86自身抗體，判斷是原發(fā)性肝細胞癌。再者，本發(fā)明涉及原發(fā)性肝細胞癌判斷用標記物，其含抗Ku86自身抗體。發(fā)明效果在本發(fā)明中，可簡單地測定待測樣品中，特別是，血液來源待測樣品中存在的抗 Ku86自身抗體，對于原發(fā)性肝細胞癌患者的判斷有效。

圖I是使用致敏Ku86抗原的ELISA板而測定健康人待測樣品、C型肝炎患者血清待測樣品、C型肝硬變患者血清待測樣品、初發(fā)原發(fā)性肝細胞癌(以下，也稱之為初發(fā) HCC)患者血清待測樣品及再發(fā)原發(fā)性肝細胞癌(以下，也稱之為再發(fā)HCC)患者血清待測樣品中抗Ku86自身抗體的結(jié)果。再有，圖中，橫軸示疾病名，縱軸示對波長450nm光的吸光度。另外，星號示在進行與健康人血清待測樣品組、C型肝炎患者待測樣品組或C型肝硬變患者血清待測樣品組的比較的全部的情況中，存在通過Wilcoxon的2標本檢驗的顯著差異 (P < O. 0001)的血清待測樣品組。圖2是使用致敏Ku86抗原的ELISA板而測定健康人血清待測樣品、初發(fā)HCC 患者血清待測樣品、大腸癌患者血清待測樣品、胃癌患者血清待測樣品、胰腺癌患者血清待測樣品、乳腺癌患者血清待測樣品、肺癌患者血清待測樣品及食道癌患者血清待測樣品中 Ku86和其自身抗體的復合物的結(jié)果。再有，圖中，橫軸示疾病名，縱軸示對波長450nm光的吸光度。另外，星號示在進行與健康人血清待測樣品組、大腸癌患者血清待測樣品組、胃癌患者血清待測樣品組、胰腺癌患者血清待測樣品組、乳腺癌患者血清待測樣品組、肺癌患者血清待測樣品組或食道癌患者血清待測樣品組的比較的全部的情況中，存在通過Wilcoxon 的2標本檢驗的顯著差異(P < O. 0001)的血清待測樣品組。實施方式本發(fā)明的抗Ku86自身抗體的免疫測定方法的特征在于，通過使待測樣品中的抗 Ku86自身抗體與作為試劑的Ku86抗原反應(yīng)，并測定生成的抗Ku86自身抗體和Ku86抗原的免疫復合物來測定抗Ku86自身抗體。在本發(fā)明中，作為待測樣品，以活體來源的樣品為適宜，特別是，以血液來源待測樣品為適宜，作 為血液來源待測樣品，可例示全血、血漿、血清。本發(fā)明的免疫測定方法的測定對象是抗Ku86自身抗體。如上所述，Ku86是與雙鏈DNA切斷相關(guān)的蛋白質(zhì)，其正式名是ATP-依賴性DNA解鏈酶2亞基2 (ATP-dependent DNA helicase 2subunit 2)，作為別名也稱之為XRCC5。另外，Ku86是在美國的國立生物工程學信息中心(NCBI)的登錄號(accession No)是gi_10863945的，由732個的氨基酸構(gòu)成的82kDa的蛋白質(zhì)。若實施本發(fā)明的免疫測定方法，則使用作為試劑的Ku86抗原。作為作為試劑的 Ku86抗原，只要是可與抗Ku86自身抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的抗原，則不特別限定，可例示 Ku86全長蛋白質(zhì)、作為Ku86全長蛋白質(zhì)的變體的,有可和與該蛋白質(zhì)同樣的抗Ku86自身抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的功能，并且與該氨基酸序列有90%以上的相同性的蛋白質(zhì)或有在 Ku86全長蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、取代或附加I個至數(shù)個氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的變體、作為Ku86的片段肽的可與Ku86的自身抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的肽。Ku86全長蛋白質(zhì)可從Abnova公司得到,但由于全氨基酸序列是如上所述已知,Ku86全長蛋白質(zhì)或其變體也可根據(jù)基因重組技術(shù)合成。在本發(fā)明中，在使用Ku86的片段肽之時，可將Ku86 全長蛋白質(zhì)通過酶分解等切成各種的肽片段而制成，使用市售的自動肽合成裝置也可容易地制成。另外，也可將目標的Ku86的片段肽通過基因重組技術(shù)制成。在本發(fā)明中，可使如此得到的Ku86全長蛋白質(zhì)的變體或片段肽與抗Ku86自身抗體進行反應(yīng)而選擇發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的當作作為試劑的Ku86抗原而使用。在本發(fā)明中，除了上述的各肽片段的全體之外，也可使用其一部分，也可使用它們的混合物，這些也包括在作為試劑的Ku86抗原中。在本發(fā)明中，免疫測定抗Ku86自身抗體時，例如，將作為試劑的Ku86抗原固相化到微板或其他載體，向得到的水不溶化載體適用預計含有該自身抗體的待測樣品而使與作為試劑的Ku86抗原進行抗原抗體反應(yīng)而結(jié)合，接下來，適用用酶等標記的抗人免疫球蛋白抗體而反應(yīng)結(jié)合到該自身抗體。水不溶化載體的制備可使用將蛋白質(zhì)結(jié)合到固相面的已知的方法容易地進行。例如，作為固相化載體，通常用到珠、微板、管等。作為向這些固相面結(jié)合作為試劑的Ku86抗原的方法，可適宜利用物理吸附、化學結(jié)合等已知的固定化技術(shù)。 使如此固相化的Ku86抗原和含有該自身抗體的待測樣品接觸，則僅抗Ku86自身抗體與作為試劑的Ku86抗原特異性地結(jié)合。從而，當加標記的抗人免疫球蛋白抗體時，由于抗人免疫球蛋白抗體與抗Ku86自身抗體結(jié)合，所以可利用此標記進行測定。作為標記，可適宜使用酶、放射性同位素、FITC、若丹明、亮氨醇之類的熒光物質(zhì)、 化學發(fā)光物質(zhì)等常用的標記。使用這些各種標記，可由酶聯(lián)免疫測定方法、放射免疫測定方法、熒光免疫測定方法、化學發(fā)光免疫測定方法等的方法，測定抗Ku86自身抗體。作為酶聯(lián)免疫測定方法中使用的標記酶，可適宜使用辣根過氧化物酶、牛小腸堿性磷酸酶、半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等的酶聯(lián)免疫分析法(EIA)中常用的酶， 可適宜使用適合于這些的酶的在EIA中常用的發(fā)色底物。作為發(fā)色底物，例如在HRP的情況中，使用 3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMBZ)、TMBZ · HC1、TMBZ · PS、ABTS、ο-苯二胺、 P-羥苯基醋酸等，在堿性磷酸酶的情況中，使用P-硝基苯基磷酸酯、4-甲基傘形花酰磷酸酯等，在β -半乳糖苷酶的情況中，使用ο-硝基苯基-β -D-批喃半乳糖、4-甲基傘形花酰 β-D-吡喃半乳糖等。在放射免疫測定方法、熒光免疫測定方法、化學發(fā)光免疫測定方法等中，也可采用通常使用的公知的標記。在本發(fā)明的免疫測定方法中，除了上述的方法之外，通過蛋白印跡法、免疫組織染色法、乳膠免疫比濁法及免疫沉降法等的免疫測定法、液相層析法，也可測定抗Ku86自身抗體。本發(fā)明的免疫測定方法作為試劑成分含至少Ku86抗原，可由抗Ku86自身抗體免疫測定用試劑盒實施。Ku86抗原，可例如，以結(jié)合于微板等的水不溶性載體的形態(tài)作為試劑盒的試劑成分。作為試劑盒的其他試劑成分，可舉出抗人免疫球蛋白抗體，此抗人免疫球蛋白抗體，根據(jù)采用的酶聯(lián)免疫測定方法、放射免疫測定方法、熒光免疫測定方法、化學發(fā)光免疫測定方法等的測定方法，使用經(jīng)酶、放射性同位元素、熒光物質(zhì)、化學發(fā)光物質(zhì)等的標記物標記的。作為其他試劑成分，也可適宜加表面活性劑、緩沖劑。
在本發(fā)明中，通過測定抗Ku86自身抗體，可進行原發(fā)性肝細胞癌的判斷。通過本發(fā)明的測定方法測定抗Ku86自身抗體對于患者的癌疾病的判別有效。本發(fā)明的測定方法的利用對于例如，健康人，和初發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者或再發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者的判別有效。另外，通過利用本發(fā)明的測定方法，使大腸癌患者、胃癌患者、胰腺癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者或食道癌患者等的癌患者，和初發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者或再發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者的判別成可能。再者，通過利用本發(fā)明的測定方法，使C型肝炎患者或C型肝硬變等的肝臟疾病患者，和初發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者或再發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者等的原發(fā)性肝細胞患者的判別成可能。從以上的說明可知，抗Ku86自身抗體是成為原發(fā)性肝細胞癌判斷用標記物的物質(zhì)，可作為原發(fā)性肝細胞癌的判斷用標記物使用。另外，抗Ku86自身抗體可作為使用全血、 血漿、血清等的血液來源待測樣品判斷原發(fā)性肝細胞癌的標記物而適宜。
實施例以下，通過實施例再詳細地說明本發(fā)明，本發(fā)明不受這些實施例的任何限制。實施例I:抗Ku86自身抗體的測定對從健康人、C型肝炎患者、C型肝硬變患者、初發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者、再發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者 、大腸癌患者、胃癌患者、胰腺癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者及食道癌患者采集的血清待測樣品，用接下來具體說明的酶聯(lián)免疫測定法(ELISA法)測定抗Ku86自身抗體。I.方法(I) Ku86 的 ELISA 板的制成作為水不溶性載體使用ELISA板(Nunc公司制，Maxisorp),向其作為Ku86將 XRCC5全長體(重組體蛋白質(zhì)GST標簽附帶Abnova公司制5 μ g/mL, 100 μ L/孔)于4°C靜置I晚而致敏，其后，用含O. 05%吐溫20的PBS (200 μ L/孔)進行3次清洗。接下來，用含 I. 5%BSA、10%蔗糖的PBS (200 μ L/孔)包被I晚而制成Ku86的ELISA板。(2)抗Ku86自身抗體的測定將各樣品血清用PBS稀釋100倍，將其加到各100 μ L/孔Ku86的ELISA板，于37°C 靜置I小時，其后，將該板用含O. 05%吐溫20的PBS (200 μ L/孔)清洗3次。向該板也加各100 μ L/孔HRP標記免疫球蛋白(將HRP標記的抗-人IgG (Zymed公司制)用含O. 05% 吐溫20的PBS稀釋4000倍的)，于37°C靜置30分鐘。接下來，將該板用含O. 05%吐溫20 的PBS (200 μ L/孔)清洗3次之后，加各100 μ L/孔ΤΜΒΖ，于室溫靜置10分鐘之后，作為反應(yīng)停止劑加100 μ L/孔的IN硫酸。吸光度是使用酶標儀(BioRad公司制)，在波長450nm 處進行測定。再有，待測樣品使用健康人48例、C型肝炎患者16例、C型肝硬變患者21例、初發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者待測樣品35癥例、再發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者52例、大腸癌患者待測樣品16例、胃癌患者16例、胰腺癌患者16例、乳腺癌患者20例、肺癌患者10例、食道癌患者 18例。2.結(jié)果將使用Ku86的ELISA板測定抗Ku86自身抗體的結(jié)果示于圖I。顯著差異檢驗使用KaleidaGraph4. O,用Wilcoxon的2標本檢驗進行統(tǒng)計處理。如圖I所示，與健康人組、C型肝炎組及C型肝硬變組比較，初發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者待測樣品組及再發(fā)原發(fā)性肝細胞癌患者待測樣品組的抗Ku86自身抗體量確認明顯的顯著差異。從而示，血中的抗Ku86自身抗體的免疫測定在肝臟疾病之中，對于原發(fā)性肝細胞癌的判別有效。如圖2所示，與健康人組或各種的癌患者待測樣品組、S卩，大腸癌患者待測樣品組、胃癌患者待測樣品組、胰腺癌患者待測樣品組、乳腺癌患者待測樣品組、肺癌患者待測樣品組及食道癌患者待測樣品組比較，原發(fā)性肝細胞患者待測樣品組的抗Ku86自身抗體量確認顯著差異。從而示，血中的抗Ku86自身抗體的免疫測定對于健康人和原發(fā)性肝細胞癌患者的判別有效。再者示，血中的抗Ku86自身抗體的免疫測定對于大腸癌患者、胃癌患者、胰腺癌患者、乳腺癌患者、肺癌患者或食道癌患者等的癌患者和原發(fā)性肝細胞癌患者的判別也有效。工業(yè)實用性如以上詳細地說明，通過使血液來源待測樣品等的待測樣品中的抗Ku86自身抗體與作為試劑的Ku86抗原進行反應(yīng)，并測定生成的自身抗體和Ku86抗原的免疫復合物，可測定其自身抗體，由此，可判斷原發(fā)性肝細胞癌。
權(quán)利要求
1.抗Ku86自身抗體的免疫測定方法，其特征在于，通過使待測樣品中的抗Ku86自身抗體與作為試劑的Ku86抗原反應(yīng)，并測定生成的抗Ku86自身抗體和Ku86抗原的免疫復合物來測定其自身抗體。
2.權(quán)利要求I所述的免疫測定方法，其中所述待測樣品是血液來源待測樣品。
3.權(quán)利要求I或2所述的免疫測定方法，其中所述免疫測定方法是酶聯(lián)免疫測定方法、熒光免疫測定方法、化學發(fā)光免疫測定方法、或者放射免疫測定方法。
4.權(quán)利要求I 3之任一項所述的免疫測定方法，其用于癌判斷。
5.權(quán)利要求4所述的免疫測定方法，其中所述癌是原發(fā)性肝細胞癌。
6.抗Ku86自身抗體免疫測定用試劑盒，其特征在于，作為試劑成分含至少Ku86抗原。
7.權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述Ku86抗原結(jié)合于水不溶性載體。
8.權(quán)利要求7所述的試劑盒，其還含抗人免疫球蛋白抗體。
9.權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中所述抗人免疫球蛋白抗體經(jīng)標記物標記。
10.原發(fā)性肝細胞癌判斷方法，其通過測定抗Ku86自身抗體，判斷是原發(fā)性肝細胞癌。
11.權(quán)利要求10所述的原發(fā)性肝細胞癌判斷方法，其測定血液來源待測樣品中的自身抗體。
12.原發(fā)性肝細胞癌判斷用標記物，其含抗Ku86自身抗體。
13.權(quán)利要求12所述的原發(fā)性肝細胞癌判斷用標記物，其用于使用血液來源待測樣品來判斷。
全文摘要
通過使待測樣品中的抗Ku86自身抗體與作為試劑的Ku86抗原反應(yīng)，并用標記抗人免疫球蛋白抗體測定生成的自身抗體和Ku86抗原的免疫復合物，可測定其自身抗體，由此可判斷原發(fā)性肝細胞癌。
文檔編號G01N33/534GK102713624SQ20118000701
公開日2012年10月3日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者小島良, 曾川一幸, 清宮正德, 野村文夫, 野田健太 申請人:日東紡績株式會社