本發(fā)明涉及一種在線監(jiān)測(cè)用葡萄糖氧化酶絲網(wǎng)印刷電極及其制備方法，屬于生物傳感器及電分析化學(xué)測(cè)試技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生物傳感器是一種以化學(xué)或物理傳感器為基底換能器件，通過特定的生物活性器件的修飾形成的可用于對(duì)特定物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的傳感元件，在工業(yè)、醫(yī)療、環(huán)境、軍事等重要領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。由酶修飾獲得的電流型生物傳感器適用范圍廣、原材料品種繁多、生產(chǎn)制造簡(jiǎn)易、傳感性能可靠、使用便捷簡(jiǎn)單、響應(yīng)快速省時(shí)，是生物傳感器領(lǐng)域中的重要組成部分。

工業(yè)化生產(chǎn)過程中，往往需要對(duì)發(fā)酵過程中的反應(yīng)底物的濃度變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，這要求為發(fā)酵領(lǐng)域提供一種廉價(jià)、使用方便、分析結(jié)果可靠的在線檢測(cè)方法及設(shè)備。葡萄糖是一種極為常見的發(fā)酵原料，對(duì)其濃度進(jìn)行在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。

發(fā)酵過程中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)面臨諸多較為棘手的問題，如：便捷自動(dòng)化的在線取樣、有效避免取樣及分析過程中可能造成的生物污染、較長(zhǎng)期保證傳感器的穩(wěn)定性能等。迄今，美國專利商標(biāo)局公布的專利中，有關(guān)生物傳感器的專利近12,000項(xiàng)，其中約6,000項(xiàng)與葡萄糖的分析測(cè)試有關(guān)；歐洲專利局公布近10,000項(xiàng)，其中逾700項(xiàng)與葡萄糖分析檢測(cè)直接相關(guān)；中國專利局公布約600項(xiàng)生物傳感領(lǐng)域的專利，其中不足20項(xiàng)與葡萄糖的分析檢測(cè)直接相關(guān)。上述專利中，尚未見到面向工業(yè)發(fā)酵過程中葡萄糖在線分析檢測(cè)的報(bào)道。

面向市場(chǎng)的葡萄糖生物傳感器，正面臨或難以多次、重復(fù)進(jìn)行分析測(cè)試，或難以批量、工業(yè)化生產(chǎn)等問題。同時(shí)，發(fā)酵液的成分通常較為復(fù)雜，電流型酶生物傳感器往往難以避免其中非目標(biāo)檢測(cè)組分的干擾。這些都是阻礙葡萄糖生物傳感器進(jìn)入工業(yè)發(fā)酵過程在線分析的主要困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種適于工業(yè)化生產(chǎn)及工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用的酶?jìng)鞲衅麟姌O。該電極以固定化的葡萄糖氧化酶作為其生物活性元件，以普魯士藍(lán)修飾的絲網(wǎng)印刷電極片為電化學(xué)換能元件構(gòu)成。同時(shí)提供該酶?jìng)鞲衅麟姌O的電化學(xué)基底電極、固定化酶及完整酶電極的制作方法及使用方法。通過與在線取樣系統(tǒng)的聯(lián)用，本發(fā)明適于發(fā)酵過程中的葡萄糖在線分析測(cè)試要求。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

1）普魯士藍(lán)摻雜的介體型過氧化氫絲網(wǎng)印刷電極制作：

配制含等摩爾濃度k3fe(cn)6和kcl的水溶液，以鹽酸調(diào)節(jié)其ph在1.0-2.5范圍內(nèi)，在快速攪拌條件下向其中逐滴加入1-1.33倍體積含等摩爾濃度的fecl3水溶液，充分反應(yīng)后以4000rpm離心分離獲得深藍(lán)色物質(zhì)即普魯士藍(lán)；置于烘箱內(nèi)于95℃烘干至恒重，再于同一烘箱內(nèi)于100℃-150℃下烘制0.5-2h，得到活化的普魯士藍(lán)，干燥器內(nèi)冷卻后以研缽研細(xì)成顆粒待用；稱取普魯士藍(lán)顆粒0.05g，配和入1mln,n-二甲基甲酰胺以研缽研細(xì)，隨后加入3g導(dǎo)電碳漿和2ml導(dǎo)電碳漿專用溶劑精細(xì)研磨20min使物料充分混勻，制成普魯士藍(lán)摻雜的碳基導(dǎo)電油墨；

取厚度為0.5mm的聚氯乙烯基片，以1mol/lnaoh溶液浸泡處理4h后洗凈晾干；制作普魯士藍(lán)摻雜絲網(wǎng)印刷電極：

（1）首先，在洗凈的聚氯乙烯基片上以導(dǎo)電碳漿印制導(dǎo)線及兩個(gè)電極，印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)；

（2）兩個(gè)電極中取其中一個(gè)作為對(duì)電極，另一個(gè)電極上印制普魯士藍(lán)摻雜的碳基導(dǎo)電油墨成工作電極，印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)并使基底電極得到活化；

（3）最后以環(huán)氧樹脂印制環(huán)氧樹脂絕緣層，覆蓋其導(dǎo)電部分，僅暴露出其工作面積、對(duì)電極及同檢測(cè)器連接的導(dǎo)電部；印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)；

2）酶固定化載體（pei-cho）制備

以含有0.1mol/l冰乙酸的水溶液在90℃條件下溶解固體聚乙烯亞胺獲得質(zhì)量濃度為1.0-2.0wt%的聚乙烯亞胺水溶液，冷卻后過濾得純凈的聚乙烯亞胺溶膠；

取1.0-2.0wt%聚乙烯亞胺溶膠，在磁力攪拌條件下逐滴滴加入含量為20-500倍聚乙烯亞胺干重的戊二醛水溶液中進(jìn)行充分反應(yīng)，所用戊二醛為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%-50%的水溶液，反應(yīng)時(shí)間為12-16h得到pei-cho合成母液；

為去除pei-cho合成母液內(nèi)的戊二醛以獲得純凈的pei-cho，使用截留分子量為8-50kda的透析袋進(jìn)行2-3d的透析，其間每隔4-6h更換一次透析液，所用透析液為0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液；或以乙醚或三氯甲烷為萃取劑對(duì)合成母液進(jìn)行反復(fù)透析后，與萃取產(chǎn)物等體積的0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液混合；或以截留分子量（mwco）為3-50kda的超濾膜進(jìn)行超濾；

3）固定化葡萄糖氧化酶（pei-co-gox）的制備及酶電極的制作

（1）取2.5-3份體積的純化pei-cho以0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液稀釋成pei-cho含量為0.1-0.5wt%的稀溶液；

（2）以0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液配制含300-340u/ml的gox酶稀釋液，取0.8-1份與步驟（1）所述的溶液均勻混合并靜置0-30min，于4℃、2000-6000rpm條件下離心5-10min，收集其沉淀部分待用；

（3）將沉淀部分以5-6份體積0.01-0.1mol/lna2ac-hac的緩沖液重新分散，再將分散液同1.7-3.4份體積0.01-0.1mol/lna2ac-hac緩沖液配置的含1-3wt%的羧基化聚乙烯亞胺（c-chit）、羧甲基纖維素鈉（cmc）、牛血清蛋白（bsa）或其混合物均勻混合，靜置0-30min后所得懸濁液即經(jīng)固定化修飾后的酶制劑；

（4）將25-50μl該懸濁液滴加于介體摻雜的絲網(wǎng)印刷電極片工作面積上成固定化酶層，于室溫條件下靜置3-4小時(shí)；以切割成合適尺寸的纖維素濾紙或玻璃纖維素濾紙為保護(hù)膜緊密覆蓋電極片的工作面積，以雙面膠密封后成為成品酶電極（見圖2）；

4）安培型測(cè)試

將酶電極片的兩電極接口部分同檢測(cè)器電路相連接構(gòu)成完整檢測(cè)器，檢測(cè)時(shí)以ph6.0-7.0的磷酸鹽緩沖液浸沒電極片工作面積，在恒速磁力攪拌的條件下向電極體系施加一定的恒定電壓，記錄其電流-時(shí)間響應(yīng)曲線；當(dāng)電流響應(yīng)穩(wěn)定后，記錄對(duì)含純品葡萄糖量確定的標(biāo)定液的電流響應(yīng)值作為滿值，檢測(cè)器系統(tǒng)自動(dòng)生成回歸方程用于定量檢測(cè)，隨后可開始對(duì)發(fā)酵液樣本進(jìn)行在線檢測(cè)；按照本發(fā)明方法所制備的酶電極在不同的葡萄糖濃度下測(cè)定的傳感結(jié)果(見圖3)，響應(yīng)時(shí)間12-20s，在葡萄糖濃度為0.05-1mmol/l范圍內(nèi)獲得電流與葡萄糖濃度的線性關(guān)系。利用儀器自動(dòng)標(biāo)定產(chǎn)生的回歸方程可定量分析試樣中的葡萄糖濃度。

絲網(wǎng)印刷電極具有制作簡(jiǎn)便、成本低廉、成品間的重現(xiàn)性理想、電極體積小等優(yōu)勢(shì)，已在多種電化學(xué)檢測(cè)器件的工業(yè)化生產(chǎn)中占用重要地位。普魯士藍(lán)是一種過氧化氫的理想電化學(xué)催化劑，不僅能夠在極低的電位條件下對(duì)過氧化氫產(chǎn)生高效電催化，同時(shí)其電催化作用以電化學(xué)還原反應(yīng)的形式體現(xiàn)，不同于常規(guī)測(cè)試方法中所依賴?yán)玫碾娀瘜W(xué)氧化反應(yīng)。大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，應(yīng)用普魯士藍(lán)修飾的電化學(xué)傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)過氧化氫的高效、專一性電分析檢測(cè)。

化學(xué)沉積法同電化學(xué)沉積法制備的普魯士藍(lán)相比具有相似的過氧化氫電化學(xué)活性，但操作更為簡(jiǎn)單，所需的合成設(shè)備簡(jiǎn)易而廉價(jià)，合成時(shí)間短，可按照生產(chǎn)需要進(jìn)行批量合成的明顯優(yōu)勢(shì)，特別適合應(yīng)用于批量生產(chǎn)的電化學(xué)修飾電極設(shè)計(jì)、制造中。將絲網(wǎng)印刷技術(shù)與普魯士藍(lán)結(jié)合，適合可工業(yè)化生產(chǎn)的過氧化氫電極的開發(fā)。目前國內(nèi)外均已出現(xiàn)普魯士藍(lán)修飾的絲網(wǎng)印刷電極產(chǎn)品。

通過對(duì)葡萄糖氧化酶對(duì)其底物葡萄糖的酶促反應(yīng)產(chǎn)物過氧化氫的定量分析，可以間接實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的定量分析。相比于第一代溶氧測(cè)量型傳感器具有明顯優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明利用普魯士藍(lán)作為電子媒介體制備修飾基底電極，制作簡(jiǎn)單、成本低廉，利用過氧化氫的電化學(xué)還原過程進(jìn)行定量分析有效避免了分析試樣中易氧化成分帶來的干擾。以本發(fā)明提供的方法制備的固定化酶活力保留率高，壽命較長(zhǎng)，用于制作酶電極片修飾操作簡(jiǎn)單，對(duì)分析物的傳質(zhì)阻力小。借助絲網(wǎng)印刷工藝，電極片的生產(chǎn)簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)且信號(hào)重現(xiàn)性良好，適于投入工業(yè)化生產(chǎn)，用于發(fā)酵工業(yè)中的在線分析。

附圖說明

圖1為本發(fā)明介體摻雜絲網(wǎng)印刷電極片的制作過程示意圖；

圖2為本發(fā)明基于介體摻雜絲網(wǎng)印刷電極片的固定化酶修飾過程示意圖；

圖3為本發(fā)明完整酶電極的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為固定化載體pei-coh及固定化酶pei-co-gox的紅外表征結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中酶電極對(duì)0.05-1mmol/l的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的電流-時(shí)間響應(yīng)關(guān)系圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中酶電極對(duì)以1mmol/l葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液定標(biāo)的電流-時(shí)間響應(yīng)、對(duì)發(fā)酵液（檸檬酸發(fā)酵液，發(fā)酵時(shí)間57h）實(shí)際樣本的響應(yīng)及其對(duì)5次0.1mmol/l葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)響應(yīng)。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述：

實(shí)施例1

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)

1）普魯士藍(lán)摻雜的介體型過氧化氫絲網(wǎng)印刷電極制作：

配制含等摩爾濃度k3fe(cn)6和kcl的水溶液，以鹽酸調(diào)節(jié)其ph在1.0-2.5范圍內(nèi)，在快速攪拌條件下向其中逐滴加入1-1.33倍體積含等摩爾濃度的fecl3水溶液，充分反應(yīng)后以4000rpm離心分離獲得深藍(lán)色物質(zhì)即普魯士藍(lán)；置于烘箱內(nèi)于95℃烘干至恒重，再于同一烘箱內(nèi)于100℃-150℃下烘制0.5-2h，得到活化的普魯士藍(lán)，干燥器內(nèi)冷卻后以研缽研細(xì)成顆粒待用；稱取普魯士藍(lán)顆粒0.05g，配和入1mln,n-二甲基甲酰胺以研缽研細(xì)，隨后加入3g導(dǎo)電碳漿和2ml導(dǎo)電碳漿專用溶劑精細(xì)研磨20min使物料充分混勻，制成普魯士藍(lán)摻雜的碳基導(dǎo)電油墨；

取厚度為0.5mm的聚氯乙烯基片4，以1mol/lnaoh溶液浸泡處理4h后洗凈晾干；制作普魯士藍(lán)摻雜絲網(wǎng)印刷電極：

（1）首先，在洗凈的聚氯乙烯基片上以導(dǎo)電碳漿印制導(dǎo)線6及兩個(gè)電極，印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)；

（2）在兩個(gè)電極中取其中一個(gè)作為對(duì)電極2，另一個(gè)電極上印制普魯士藍(lán)摻雜的碳基導(dǎo)電油墨成工作電極1，印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)并使基底電極得到活化；

（3）最后以環(huán)氧樹脂印制環(huán)氧樹脂絕緣層3，覆蓋其導(dǎo)電部分，僅暴露出其工作面積1、對(duì)電極2及同檢測(cè)器連接的導(dǎo)電部5；印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)；見圖1；

2）酶固定化載體（pei-cho）制備

以含有0.1mol/l冰乙酸的水溶液在90℃條件下溶解固體聚乙烯亞胺獲得質(zhì)量濃度為1.0-2.0wt%的聚乙烯亞胺水溶液，冷卻后過濾得純凈的聚乙烯亞胺溶膠；

取1.0-2.0wt%聚乙烯亞胺溶膠，在磁力攪拌條件下逐滴滴加入含量為20-500倍聚乙烯亞胺干重的戊二醛水溶液中進(jìn)行充分反應(yīng)，所用戊二醛為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%-50%的水溶液，反應(yīng)時(shí)間為12-16h得到pei-cho合成母液；

為去除pei-cho合成母液內(nèi)的戊二醛以獲得純凈的pei-cho，使用截留分子量為8-50kda的透析袋進(jìn)行2-3d的透析，其間每隔4-6h更換一次透析液，所用透析液為0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液；或以乙醚或三氯甲烷為萃取劑對(duì)合成母液進(jìn)行反復(fù)透析后，與萃取產(chǎn)物等體積的0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液混合；或以截留分子量（mwco）為3-50kda的超濾膜進(jìn)行超濾；

3）固定化葡萄糖氧化酶（pei-co-gox）的制備及酶電極的制作

（1）取2.5-3份體積的純化pei-cho以0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液稀釋成pei-cho含量為0.1-0.5wt%的稀溶液；

（2）以0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液配制含300-340u/ml的gox酶稀釋液，取0.8-1份與步驟（1）所述的溶液均勻混合并靜置0-30min，于4℃、2000-6000rpm條件下離心5-10min，收集其沉淀部分待用；

（3）將沉淀部分以5-6份體積0.01-0.1mol/lna2ac-hac的緩沖液重新分散，再將分散液同1.7-3.4份體積0.01-0.1mol/lna2ac-hac緩沖液配置的含1-3wt%的羧基化聚乙烯亞胺（c-chit）、羧甲基纖維素鈉（cmc）、牛血清蛋白（bsa）或其混合物均勻混合，靜置0-30min后所得懸濁液即經(jīng)固定化修飾后的酶制劑；其紅外表征圖如圖4：（a）gox純品；（b）pei純品；（c）pei-gdi純品；（d）pei-gdi-gox，所有樣品皆為經(jīng)過脫水處理：并制作brk壓片后進(jìn)行表征。1107cm^-1：c-n伸縮振動(dòng)；1637cm^-1：西弗堿（c=n）伸縮振動(dòng)；1717cm^-1：游離醛基c=o；2869cm^-1及2939cm^-1：甲基及飽和c-h伸縮振動(dòng)；3424cm^-1：n-h或nh2伸縮振動(dòng)；可以看出，pei經(jīng)戊二醛處理后形成了西弗堿結(jié)構(gòu)并使分子體系攜帶有游離醛基，說明分子改造過程已經(jīng)使pei-gdi形成；pei-gdi同酶分子結(jié)合后，分子體系的西弗堿結(jié)構(gòu)含量有所增加而游離醛基的特征峰基本消失，表明pei-gdi結(jié)合酶分子并同其建立共價(jià)聯(lián)接的能力；

（4）將25-50μl該懸濁液滴加于介體摻雜的絲網(wǎng)印刷電極片工作面積上成固定化酶層7，于室溫條件下靜置3-4小時(shí)；以切割成合適尺寸的纖維素濾紙或玻璃纖維素濾紙為保護(hù)膜8緊密覆蓋電極片的工作面積，以雙面膠密封后成為成品酶電極（見圖2、圖3）；

4）安培型測(cè)試

將新制的酶電極片與一支飽和ag/agcl電極組成三電極系統(tǒng)。測(cè)量時(shí)于容量為5ml的反應(yīng)池內(nèi)以濃度為0.1mol/l的ph6.0磷酸鹽緩沖液浸沒電極體系，在恒速磁力攪拌下向電極施加一定的恒定電壓。待電流響應(yīng)穩(wěn)定后向反應(yīng)池內(nèi)加入已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄其對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的電流-時(shí)間響應(yīng)曲線（見圖5）。利用由該響應(yīng)曲線繪制的電流-濃度關(guān)系曲線及其回歸方程可完成發(fā)酵液實(shí)際樣品的定量分析。

實(shí)施例2

1）普魯士藍(lán)摻雜的介體型過氧化氫絲網(wǎng)印刷電極制作：

配制含等摩爾濃度k3fe(cn)6和kcl的水溶液，以鹽酸調(diào)節(jié)其ph在1.0-2.5范圍內(nèi)，在快速攪拌條件下向其中逐滴加入1-1.33倍體積含等摩爾濃度的fecl3水溶液，充分反應(yīng)后以4000rpm離心分離獲得深藍(lán)色物質(zhì)即普魯士藍(lán)；置于烘箱內(nèi)于95℃烘干至恒重，再于同一烘箱內(nèi)于100℃-150℃下烘制0.5-2h，得到活化的普魯士藍(lán)，干燥器內(nèi)冷卻后以研缽研細(xì)成顆粒待用；稱取普魯士藍(lán)顆粒0.05g，配和入1mln,n-二甲基甲酰胺以研缽研細(xì)，隨后加入3g導(dǎo)電碳漿和2ml導(dǎo)電碳漿專用溶劑精細(xì)研磨20min使物料充分混勻，制成普魯士藍(lán)摻雜的碳基導(dǎo)電油墨；

取厚度為0.5mm的聚氯乙烯基片4，以1mol/lnaoh溶液浸泡處理4h后洗凈晾干；制作普魯士藍(lán)摻雜絲網(wǎng)印刷電極：

（1）首先，在洗凈的聚氯乙烯基片上以導(dǎo)電碳漿印制導(dǎo)線6及兩個(gè)電極，印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)；

（2）在兩個(gè)電極中取其中一個(gè)作為對(duì)電極2，另一個(gè)電極上印制普魯士藍(lán)摻雜的碳基導(dǎo)電油墨成工作電極1，印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)并使基底電極得到活化；

（3）最后以環(huán)氧樹脂印制環(huán)氧樹脂絕緣層3，覆蓋其導(dǎo)電部分，僅暴露出其工作面積1、對(duì)電極2及同檢測(cè)器連接的導(dǎo)電部5；印刷完成后，置于90℃的烘箱內(nèi)使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)；見圖1；

2）酶固定化載體（pei-cho）制備

以含有0.1mol/l冰乙酸的水溶液在90℃條件下溶解固體聚乙烯亞胺獲得質(zhì)量濃度為1.0-2.0wt%的聚乙烯亞胺水溶液，冷卻后過濾得純凈的聚乙烯亞胺溶膠；

取1.0-2.0wt%聚乙烯亞胺溶膠，在磁力攪拌條件下逐滴滴加入含量為20-500倍聚乙烯亞胺干重的戊二醛水溶液中進(jìn)行充分反應(yīng)，所用戊二醛為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%-50%的水溶液，反應(yīng)時(shí)間為12-16h得到pei-cho合成母液；

為去除pei-cho合成母液內(nèi)的戊二醛以獲得純凈的pei-cho，使用截留分子量為8-50kda的透析袋進(jìn)行2-3d的透析，其間每隔4-6h更換一次透析液，所用透析液為0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液；或以乙醚或三氯甲烷為萃取劑對(duì)合成母液進(jìn)行反復(fù)透析后，與萃取產(chǎn)物等體積的0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液混合；或以截留分子量（mwco）為3-50kda的超濾膜進(jìn)行超濾；

3）固定化葡萄糖氧化酶（pei-co-gox）的制備及酶電極的制作

（1）取2.5-3份體積的純化pei-cho以0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液稀釋成pei-cho含量為0.1-0.5wt%的稀溶液；

（2）以0.01-0.1mol/l的na2ac-hac緩沖液配制含300-340u/ml的gox酶稀釋液，取0.8-1份與步驟（1）所述的溶液均勻混合并靜置0-30min，于4℃、2000-6000rpm條件下離心5-10min，收集其沉淀部分待用；

（3）將沉淀部分以5-6份體積0.01-0.1mol/lna2ac-hac的緩沖液重新分散，再將分散液同1.7-3.4份體積0.01-0.1mol/lna2ac-hac緩沖液配置的含1-3wt%的羧基化聚乙烯亞胺（c-chit）、羧甲基纖維素鈉（cmc）、牛血清蛋白（bsa）或其混合物均勻混合，靜置0-30min后所得懸濁液即經(jīng)固定化修飾后的酶制劑；

（4）將25-50μl該懸濁液滴加于介體摻雜的絲網(wǎng)印刷電極片工作面積上成固定化酶層7，于室溫條件下靜置3-4小時(shí)；以切割成合適尺寸的纖維素濾紙或玻璃纖維素濾紙為保護(hù)膜8緊密覆蓋電極片的工作面積，以雙面膠密封后成為成品酶電極（見圖2、圖3）；

4）安培型測(cè)試

酶電極的安培型測(cè)試：將新制的酶電極片按照?qǐng)D6所示連接方式組成完整葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)。測(cè)量時(shí)于容量為5ml的反應(yīng)池內(nèi)以濃度為0.1mol/l的ph6.0磷酸鹽緩沖液浸沒電極體系，在恒速磁力攪拌下向電極施加一定的恒定電壓，待電極在空白緩沖溶液中的電流響應(yīng)穩(wěn)定后，向反應(yīng)池中加入100mmol/l的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl，記錄其加入18s后的相應(yīng)電流值作為滿度值。更換反應(yīng)池內(nèi)的緩沖溶液，待電極的電流響應(yīng)再次穩(wěn)定后，向反應(yīng)池內(nèi)加入50μl發(fā)酵液樣本原液，以標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算其葡萄糖濃度。隨后逐次向反應(yīng)池內(nèi)加入50μl的100mmol/l葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液共5批，并由此計(jì)算其回收率（見圖6、表1）。

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