本發(fā)明涉及一種proANP快速檢測試紙卡及相關(guān)應(yīng)用，屬于臨床檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：心力衰竭是各種心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病導(dǎo)致心室充盈和(或)射血能力受損而引起的一組綜合征，它是老年人住院或者死亡的最常見原因之一。隨著人口老齡化及心肌梗死生存率的上升，心力衰竭作為心血管疾病中唯一一個發(fā)病率和流行性仍在持續(xù)上升的疾病，其防治已成為近年來臨床心臟病學(xué)研究的熱點。心鈉素前體(proANP)由心肌細胞合成，儲存在分泌顆粒中，激素釋放進入血液循環(huán)的主要刺激來自心肌細胞的伸展。心鈉素前體釋放時分解為等分子的具有生物活性的proANP(99-126)和N末端proANP(1-98)，后者較前者穩(wěn)定，對心鈉素的波動分泌比較不敏感，可以較好地反映心鈉素的慢性分泌水平。在心衰患者血液中心鈉素和腦鈉素均升高，其血漿濃度與心衰的嚴重程度成正比。數(shù)據(jù)表明，proANP可能是早期心臟功能失調(diào)的一個明顯的生物標(biāo)志物。目前，針對proANP的檢測方法主要為酶聯(lián)免疫法(ELISA)和放射免疫分析法；并且主要依賴于進口，但是ELISA法定量準確性差、操作時間長、自動化程度低，多用于定性檢測；放射免疫分析法靈敏度較高，操作簡單，測量準確，缺點是所需時間較長，存在放射性污染和輻射危險；膠體金免疫層析方法雖然具有樣本用量少，簡便快速，成本低的優(yōu)勢，但是靈敏度較低，一般只能定性，不能定量，特別是重復(fù)性差這一缺點限制了其在臨床上的應(yīng)用，尤其不適用于需通過準確定量來幫助對疾病進行診斷的體液標(biāo)志蛋白的定量檢測。熒光免疫層析是建立在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術(shù)和免疫熒光微球標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上的以熒光微球為標(biāo)記物,利用特異的抗原抗體反應(yīng)來放大反應(yīng)，通過熒光定量分析儀判定結(jié)果的新技術(shù)。該技術(shù)具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點，在臨床醫(yī)學(xué)檢測、激素檢測、食品安全檢測、藥物殘留和毒品快速檢測諸多診斷領(lǐng)域迅速發(fā)展。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種心鈉素前體(proANP)定量熒光免疫層析檢測試紙卡；所述試紙卡是在PVC板上順次相互搭接經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成試紙卡。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述稀土熒光微球摻雜有銪元素；所述稀土熒光微球的直徑為50-100nm。在本發(fā)明進一步地實施方案中，吸附有稀土熒光微球標(biāo)記抗體的制備方法如下：1、稀土熒光微球的活化；2、稀土熒光微球標(biāo)記的proANP抗體的制備：將proANP單克隆抗體用與上述活化的稀土熒光微球混合，反應(yīng)過夜；然后加入硼氫化鈉反應(yīng)；再加入等體積的封閉液，封閉過夜；離心洗滌3遍，重懸于的100mMTris-HCl緩沖液中(含0.5％BSA和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆?。在一個具體實施方案中，所述封閉液組成為含1.0％BSA和0.1％木質(zhì)素磺酸鈉的50mMTris-HCl緩沖液，pH6.5。在本發(fā)明另一個實施方案中，所述吸附熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊通過以下方法制備：將玻璃纖維膜浸泡于含2.5％木質(zhì)素磺酸鈉和2.5％BSA的100mMTris-HCl緩沖液中，pH7.0；浸泡，然后取出烘箱烘干，將玻璃纖維膜置于噴臺上，用微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的proANP單克隆抗體溶液噴到玻璃纖維膜，即得。在本發(fā)明又一個實施方案中，所述包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備方法如下：用包被稀釋液將proANP單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體制成溶液，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，然后置于烘箱中烘干。在一個具體實施方案中，所述包被稀釋液為含0.5％木質(zhì)素磺酸鈉的100mMTris-HCl緩沖液，pH7.0。在本發(fā)明又一個實施方案中，所述樣品墊的制備方法如下：將玻璃纖維膜浸泡于0.25MTris緩沖液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。在本發(fā)明中，所述試紙卡的組裝過程如下：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。所述試劑盒，檢測方法為：1)將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；2)精確吸取100μl血清樣本，樣本為全血時吸取150μl樣本，加入到樣本孔中，15-30分鐘內(nèi)用熒光免疫層析分析儀定量判定結(jié)果；3)設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入倉內(nèi)進行檢測，儀器將顯示出樣品濃度的定量測定結(jié)果。在熒光免疫層析試紙卡的制備過程中，一般在封閉和涂布抗體或熒光微球標(biāo)記抗體過程中，會加入表面活性劑來輔助封閉和維持抗體穩(wěn)定性的作用。但是本領(lǐng)域常用的TritonX-100、吐溫20和PVP等，但是對于熒光標(biāo)記抗體來說，傳統(tǒng)表面活性劑的穩(wěn)定性作用不佳，并且熒光微球中銪元素的發(fā)光強度隨著保存時間延長而明顯減弱，而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)封閉液及涂布液中添加木脂素磺酸鈉作為表面活性劑時，不僅抗體穩(wěn)定性效果極佳，并且熒光微球發(fā)光強度隨著時間延長沒有出現(xiàn)減弱現(xiàn)象。具體實施方式還可進一步通過實施例來理解本發(fā)明，其中所述實施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實施例不限制本發(fā)明?，F(xiàn)在已知的或進一步開發(fā)的本發(fā)明的變化被認為落入本文中描述的和以下要求保護的本發(fā)明范圍之內(nèi)。在本發(fā)明中，在無特殊說明的前提下，“％”代表重量百分比。實施例1proANP檢測試紙卡制備包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備：用包被稀釋液將proANP單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到5mg/ml，膜液量為2μl/cm，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質(zhì)控線間隔為5mm，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。包被稀釋液為含0.5％木質(zhì)素磺酸鈉的100mMTris-HCl緩沖液，pH7.0。吸附熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊制備：1、稀土熒光微球的醛基化：取15mg稀土熒光微球，用50mM，pH9.0的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為10分鐘，最后重懸于200μl的上述碳酸鹽緩沖液中。加入400μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時。采用同樣的離心法洗滌和重懸到200μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆谩?、稀土熒光微球標(biāo)記的proANP抗體的制備：將5mg的proANP單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過夜。然后，加入硼氫化鈉至終濃度15mM，4℃反應(yīng)6小時；再加入等體積的封閉液(50mM的Tris-HCl緩沖液，pH6.5，含1.0％BSA和0.1％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃封閉過夜；然后用50mMpH6.5的Tris-HCl緩沖液，采用離心法洗滌3遍，重懸于200μl的100mMTris-HCl緩沖液中(含0.5％BSA和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?、將玻璃纖維膜浸泡于100mMTris-HCl緩沖液中(含2.5％木質(zhì)素磺酸鈉，2.5％BSA，pH7.0)，4℃浸泡4小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用。將玻璃纖維膜在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-JetQuanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的proANP單克隆抗體溶液噴到玻璃纖維膜，37℃烘干4小時，備用。在檢測線中涂布的proANP單克隆抗體和結(jié)合墊中的熒光微球標(biāo)記用的proANP單克隆抗體為配對抗體，均為N末端proANP(NT-proANP)單克隆抗體，購自Genetex公司(USA)。試紙卡的組裝：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。實施例2試紙卡線性范圍、精密度和靈敏度測試取含量為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和20nmol/L的proANP標(biāo)準品溶液，用試紙卡進行測定。檢測方法：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡(實施例1制備)，平放；精確吸取100μl標(biāo)準品樣本，加入到試紙卡的樣本孔中，20分鐘后用熒光免疫層析分析儀進行檢測。線性：以熒光強度值和對應(yīng)的標(biāo)準品濃度建立標(biāo)準曲線，具體為Y(熒光強度)＝116.27X+3.4，R2值>0.999，說明本發(fā)明試紙卡在0.01-2020nmol/L范圍內(nèi)線性良好。靈敏度：采用PBS緩沖液作為空白對照，以空白對照2倍熒光強度作為最低檢測濃度(即靈敏度)，結(jié)果表明：0.01nmol/L標(biāo)準品平行測定5次的平均熒光強度為4.7RLU；而空白對照的平均熒光強度為1.4RLU。說明試紙卡的靈敏度可達0.01nmol/L。精密度：取已知高濃度和低濃度proANP含量的全血樣本，樣本proANP含量分別為0.68nmol/L和8.43nmol/L；采用實施例1制備試紙卡重復(fù)測定10次，計算CV。結(jié)果表明proANP含量為0.68nmol/L的低濃度樣本的CV為2.06％；高濃度樣本的CV為1.41％。實施例3穩(wěn)定性測試將實施例1制備的試紙卡在37℃環(huán)境下放置3個月，然后按照實施例2的方法測定試劑盒的標(biāo)準曲線及R2值，并采用1nmol/L的proANP標(biāo)準品對試劑盒進行精密度考察(平行測定10次，計算CV％)，具體結(jié)果如下：對比例1試紙卡制備同實施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中不添加木質(zhì)素磺酸鈉。對比例2試紙卡制備同實施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中將木質(zhì)素磺酸鈉替換為等量的SDS。對比例3試紙卡制備同實施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中將木質(zhì)素磺酸鈉替換為等量的吐溫20。對比例4試紙卡制備同實施例1，區(qū)別在于，在結(jié)合墊制備步驟3中將木質(zhì)素磺酸鈉含量為3.5％。實施例4臨床測試從醫(yī)院收集心衰患者及健康人的血液樣本，采用實施例1試紙卡對樣本進行測定，并且采用相同樣本通過放射免疫方法進行測定，結(jié)果見下表：樣本編號實施例1放免法11.34nmol/L1.36nmol/L20.89nmol/L0.87nmol/L31.59nmol/L1.63nmol/L45.63nmol/L5.67nmol/L57.27nmol/L7.29nmol/L65.92nmol/L5.99nmol/L本
發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。當(dāng)前第1頁1 2 3