專利名稱：一種流感病毒快速檢測試紙的制作方法
技術領域：
一種流感病毒快速檢測試紙技術領域本發(fā)明涉及一種可移動的、方便實用的流感病毒快速檢測試紙，屬于免疫層析快速檢測 領域。
背景技術：
.流感病毒作為常見呼吸道病毒的一種，抗原性復雜，根據其核心蛋白抗原性不同分為甲、 乙、丙三型，根據其表面抗原血凝素(H)和神經氨酸酶(N)的不同，同型病毒又分若干亞 型，各型之間無交叉免疫。由于各型病毒之間無交叉免疫，可多次感染，反復發(fā)病。流行性 感冒是世界上最猖獗的傳染病，曾多次席巻全球，給人類帶來巨大災難。僅僅在1957年的一 次流感大傳播中，全世界共有15億人發(fā)病，數以萬計的老人和小孩被折磨致死。目前，檢測流感病毒，目前國內外多釆用病毒分離、間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、 多重逆轉錄聚合酶鏈反應、PCR及核酸雜交等多種檢測手段。病毒分離法耗時太長且成本較 高；間接免疫熒光法需要昂貴的熒光顯微鏡且標本不易保存；PCR方法不能區(qū)別有感染毒力 的病毒和死病毒；酶聯(lián)免疫吸附法制成試劑盒需冷藏，運輸不便，同時上述方法均需專業(yè)人 員操作。正是因為現(xiàn)有檢測方法的落后，因此開發(fā)出使用方便，檢測靈敏，價格低廉的檢測產品 是當務之急。顏色顆粒免疫層析分析為流感病毒的檢測提供了一個新的檢測途徑。免疫微粒技術是利 用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作為載體，包被上具有特異性親和力的各種免疫 活性物質(抗原或抗體)，使其致敏為免疫微粒，用于免疫學及其他生物學檢測與分離的一項 技術。作為載體的微粒通常是以某種高分子有機單體為原料，經過乳液聚合、懸浮聚合及輻 照聚合等高分子聚合方法制備而成。由于制備材料及工藝不同，微粒的種類繁多，現(xiàn)已制成 惰性微粒如聚苯乙烯膠乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及標記微粒(用同位 素、熒光素或酶標記)等四大類微粒，數量多達幾十種。將制備好的微粒與抗原(或抗體)經物 理吸附、化學偶聯(lián)及生物素親合素橋聯(lián)法等致敏方法形成免疫微粒。廣泛應用于各種可溶性 大分子物質的檢測、分離與純化、細胞標記與識別等。近年來，微粒技術在核酸分子雜交、 DNA與RNA的分離及PCR等研究領域亦顯示出廣闊的應用前景。乳膠微粒作為免疫微粒的一種，采用合成高分子乳膠微球，即羧化的聚苯乙烯乳膠作為 載體，將抗體或抗原通過物理吸附固載于微球表面而形成免疫乳膠診斷試劑，通過膠乳凝集 實驗可檢測對應的抗原或抗體。制備成的乳膠診斷試劑，用于診斷多種疾病，具有簡便、快 速、靈敏、價廉及操作容易等優(yōu)點。膠體金免疫層析技術是20世紀90年代以來在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體金 顯色技術基礎上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術，是根據免疫反應原理，利用大孔徑微孔 濾膜為載體，以膠體金作為固相標記物來檢測樣本中待測物質的一種快速免疫分析技術。
本發(fā)明在顏色顆粒免疫層析技術原理基礎上，改進檢測方法，建立了采用膠體金法及乳 膠法檢測流感病毒的方法。檢測方法的改進，使檢測更方便，結果更準確，具有快速、靈敏、 操作簡便、成本低、無需專業(yè)人員操作等特點，真正達到復雜原理與簡易操作的有機統(tǒng)一。發(fā)明內容本發(fā)明針對上述存在的一些問題，提供了一種流感病毒快速檢測試紙。 為解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種流感病毒快速檢測試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、流感病毒單克隆抗體儲 藏墊、樣品吸液層組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設置有一條試驗線和一 條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩 端分別與吸水板和流感病毒單克隆抗體儲藏墊相互交疊連接，在流感病毒單克隆抗體儲藏墊 上壓有樣品吸液層，利用顏色顆粒免疫層析法來檢測流感病毒。顏色顆?？梢允且环N金屬溶膠顆粒，可包括膠體金顆粒、銀顆粒、鐵顆粒、磁性顆粒等; 一種標記顆粒，可包括染料顆粒、乳膠顆粒、熒光顆粒等。其中，膠體金顆粒的顆粒直徑大 小為納米級，乳膠顆粒直徑大小0.01 10ym;金屬溶膠顆粒的吸附機理是利用它在堿性條 件下帶負電荷的性質，與蛋白質分子的正電荷基團，靠靜電吸引而結合；乳膠顆粒是利用化 學結合的方式與蛋白質分子結合，形成免疫診斷試劑。樣品吸液層由三層材料疊加組成，依次為10 25g/i^無紡布層、玻璃纖維層、10 25g/m2 無紡布層，上述物質均需經過表面活性劑緩沖液浸泡處理，干燥后備用，上述裝置除有毛細 管作用原理外，還有虹吸作用原理，大大加快吸水移動速度。用流感疫苗(活性成分為甲/新喀里多尼亞/20/99(HINl)-類似株；甲/新喀里多尼亞/20/99 重配毒株IVR-116;甲/威斯康星/67/2005 (H3N2)-類似株；甲/廣島/52/2005重配毒株 IVR-142;乙/馬來西亞/2506/2004-類似株；乙/馬來西亞/2506/2004)免疫小鼠，細胞株注射鼠 腹腔，提取腹水進行純化，在篩選出的雜交瘤細胞株中，獲得兩株高純度、配對的流感單克 隆抗體細胞株Flu4G3F12和Flu23C7H8， 一株用于試驗線包被， 一株可用于顏色顆粒標記。把試紙樣品吸液層放入待測樣本中(液面不得超過MAX線)，由于毛細管作用樣品將沿 著試紙條向吸水板移動，當移動至單克隆抗體儲藏墊時，樣品中流感病毒抗原與流感病毒單 克隆抗體標記探針發(fā)生特異結合，當移動至試驗線時，樣品中流感病毒抗原又與試驗線中的 流感病毒單克隆抗體相結合，因此其顏色顆粒滯留于試驗線上，試驗線處顯示紅色為陽性； 相反如果待測樣本中沒有流感病毒，流感病毒單克隆抗體標記探針就不會與試驗線上的流感 病毒單克隆抗體發(fā)生特異結合，沒有顏色顆粒滯留，即僅有一條紅色控制線為陰性，這就是 采用的本試紙雙抗夾心法原理。根據此原理，兩條線為陽性， 一條線為陰性得出判斷。硝酸纖維素膜上設置的控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，當樣品通過顏色顆粒標 記的流感病毒單克隆抗體移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，無論樣品中有無流感病毒，都 會與已設定好的羊抗鼠多克隆抗體結合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產生則 代表操作有誤，檢測時樣品液面超過MAX線或試紙已經過期。由于采用上述技術方案，本發(fā)明所提供的流感病毒快速檢測試紙具有這樣的有益效果， 即方便快速、可移動、便于流感病毒的現(xiàn)場篩査工作，且特異性強，靈敏度高，無須專門技
術人員操作，而且結果易讀。


圖1為本發(fā)明的外觀圖。 圖2為本發(fā)明的分解圖。 圖3為本發(fā)明的陰性結果圖。 圖4為本發(fā)明的陽性結果圖。圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、控制線，4、試驗線，5、單克隆抗體儲藏墊，6、 樣品吸液層，7、底板，8、 MAX線。
具體實施方式

以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進一步解釋一種流感病毒快速檢測試紙，包括底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、流感病 毒單克隆抗體儲藏墊(5)、樣品吸液層(6);底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設 置有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為 樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和流感病毒單克隆抗體儲藏墊相互交疊連接， 在流感病毒單克隆抗體儲藏墊上壓有樣品吸液層，利用顏色顆粒免疫層析法來檢測流感病毒。實施例1:一種流感病毒膠體金檢測試紙，包括底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、流感 病毒單克隆抗體金標墊(5)、樣品吸液層(6);底板屮部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上 設置有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭 為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和流感病毒單克隆抗體金標墊相互交疊連接， 在流感病毒單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層，利用膠體金免疫層析法來檢測流感病毒。試紙制法1. 流感單克隆抗體的制備用流感疫苗(活性成分為甲/新喀里多尼亞/20/99(HINi;i-類似株； 甲/新喀里多尼亞/20/99重配毒株IVR-116;甲/威斯康星/67/2005 (H3N2)-類似株；甲/廣島 /52/2005重配毒株IVR-142;乙/馬來西亞/2506/2004-類似株；乙/馬來西亞/2506/2004)免疫 小鼠，細胞株注射鼠腹腔，提取腹水進行純化，在篩選出的雜交瘤細胞株中，獲得兩株高純 度、配對的流感單克隆抗體細胞株Flu4G3F12和Flu23C7H8， 一株用于試驗線包被， 一株可 用于膠體金標記。2. 膠體金的制備及與流感單克隆抗體Flu4G3F12的結合(1) 取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到9(TC，加入適量檸檬酸三納繼續(xù)加熱攪拌 至沸騰3 10分鐘，優(yōu)選5分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?2) 把流感病毒單克隆抗體Flu4G3F12標記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。3. 膜的制備機器制膜，利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。 檢測線流感單克隆抗體Flu23C7H8
控制線羊抗鼠多克隆抗體4. 試紙條按公知技術組合。5. 使用方法及結果判斷使用時，把試紙樣品吸液層放入待測樣本中(液面不得超過MAX 線)，5分鐘時觀察結果。若檢測流感病毒濃度高于檢出量，觀察窗處出現(xiàn)兩條紅線為陽性； 低于界限值，出現(xiàn)一條紅線為陰性；控制線無色帶產生代表操作有誤，檢測時樣品液面超過 MAX線或試紙已經過期。實施例2:一種流感病毒乳膠檢測試紙，包括底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、流感病 毒單克隆抗體儲藏墊(5)、樣品吸液層(6);底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設 置有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為 樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和流感病毒單克隆抗體儲藏墊相互交疊連接， 在流感病毒單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層，利用膠體金免疫層析法來檢測流感病毒。試紙制法1. 流感單克隆抗體的制備用流感疫苗(活性成分為甲/新喀里多尼亞/20/99(HINl)-類似株； 甲/新喀里多尼亞/20/99重配毒株IVR-116;甲/威斯康星/67/2005 (H3N2)-類似株；甲/廣島 /52/2005重配毒株IVR-142;乙/馬來西亞/2506/2004-類似株；乙/馬來西亞/2506/2004)免疫 小鼠，細胞株注射鼠腹腔，提取腹水進行純化，在篩選出的雜交瘤細胞株中，獲得兩株高純 度、配對的流感單克隆抗體細胞株Flu4G3F12和Flu23C7H8， 一株用于試驗線包被， 一株可 用乳膠微粒標記。2. 乳膠微粒的制備1) 取10%乳膠溶液100ul，加入硼砂緩沖液900ul，高速離心10min;2) 棄上清，加入硼砂緩沖液洗滌，再次高速離心10min;3) 棄上清，加入硼砂緩沖液懸浮沉淀，加入抗體，體積定容至lml;4) 向"3"所得溶液中加入10ulEDC (15mg/ml)，孵育4h,高速離心10min;5) 棄上清，用封閉液(5% BSA)懸浮沉淀，封閉過夜；次日，劃線。3. 乳膠微粒與流感單克隆抗體Flu4G3F12結合把流感病毒單克隆抗體Flu4G3F12標記的 乳膠微粒，吸附纖維材料上，干燥后備用。4. 膜的制備機器制膜，利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。檢測線流感單克隆抗體Flu23C7H8控制線羊抗鼠多克隆抗體 .5. 試紙條按公知技術組合。6. 使用方法及結果判斷使用時，把試紙樣品吸液層放入待測樣本中(液面不得超過MAX線)，5分鐘時觀察結果。若檢測流感病毒濃度高于檢出量，觀察窗處出現(xiàn)兩條紅線為陽性；低于界限值，出現(xiàn)一條紅線為陰性；控制線無色帶產生代表操作有誤，檢測時樣品液面超過 MAX線或試紙已經過期。
權利要求1.一種流感病毒快速檢測試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、流感病毒單克隆抗體儲藏墊(5)、樣品吸液層(6)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設置有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和流感病毒單克隆抗體儲藏墊相互交疊連接，在流感病毒單克隆抗體儲藏墊上壓有樣品吸液層，利用顏色顆粒免疫層析法來檢測流感病毒。
2. 根據權利要求1所述的一種流感病毒快速檢測試紙，其特征在于顏色顆?？梢允且环N金 屬溶膠顆粒，可包括膠體金顆粒、銀顆粒、鐵顆粒、磁性顆粒； 一種標記顆粒，可包括 染料顆粒、乳膠顆粒、熒光顆粒。
3. 根據權力要求1所述的一種流感病毒快速檢測試紙，其特征在于膠體金顆粒的顆粒直徑 大小為納米級，乳膠顆粒直徑大小0.01 10iim;金屬溶膠顆粒的吸附機理是利用它在堿 性條件下帶負電荷的性質，與蛋白質分子的正電荷基團，靠靜電吸引而結合；乳膠顆粒 是利用化學結合的方式與蛋白質分子結合，形成免疫診斷試劑。
4. 根據權利要求1所述的一種流感病毒膠體金快速檢測試紙，其特征在于所述的樣品吸液 層是由三層材料疊加組成，第一層為無紡布層，規(guī)格為10 25g/m2;第二層為玻璃纖維 層；第三層為無紡布層，其規(guī)格為10 25g/m2。
專利摘要本實用新型涉及一種流感病毒快速檢測試紙，屬于免疫層析快速檢測領域。本試紙由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、流感病毒單克隆抗體儲藏墊、樣品吸液層組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設置有一條試驗線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和流感病毒單克隆抗體儲藏墊相互交疊連接，在流感病毒單克隆抗體儲藏墊上壓有樣品吸液層，利用顏色顆粒免疫層析法來檢測流感病毒。使用上述試紙條，通過試驗線顯色，可方便快速的檢測流感病毒，同時具有操作簡便、特異性強、靈敏度高，且結果易讀、成本低、無需專業(yè)人員操作等特點，真正達到復雜原理與簡易操作的有機統(tǒng)一。
文檔編號G01N33/577GK201053965SQ200720149480
公開日2008年4月30日 申請日期2007年6月6日 優(yōu)先權日2007年6月6日
發(fā)明者萬積成 申請人:萬積成