一種定量檢測胃蛋白酶原i的時間分辨免疫層析試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及臨床免疫學檢測領域，具體涉及一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條。本發(fā)明提供的試紙條，包括塑料卡殼、底板及附著于底板上依次相互交錯的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙。所述的結合墊上包被有稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I；所述的包被膜上包被有檢測帶和質控帶，檢測帶固定有識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II，質控帶固定有兔抗鼠IgG抗體。本發(fā)明還公開了該試紙條的制備方法。本發(fā)明通過將雙抗體夾心測抗原和時間分辨免疫層析技術引入胃蛋白酶原I的檢測中，結合熒光檢測儀，實現(xiàn)了胃蛋白酶原I的單人份定量檢測，且靈敏度高，批內、批間差小，為臨床使用提供了極大便利。
【專利說明】—種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條及其制備方法
[0001]

【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及臨床免疫學檢測領域，具體涉及一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條及其制備方法。

【背景技術】
[0003]胃蛋白酶原(Pesinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的無活性前體，分為胃蛋白酶原I(簡稱PGI)和胃蛋白酶原II (簡稱PGII)。血清PG水平反映了不同部位胃粘膜的形態(tài)和功能，PGI主要由胃底腺的主細胞和頸黏液細胞分泌，血清PGI含量與胃潰瘍、十二指腸潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌等上消化道疾病有密切關系。PGI/PGII的比率對于判斷胃黏膜狀態(tài)和功能也有較高的臨床價值。測定PGI含量檢測出十二指腸潰瘍、萎縮性胃炎，胃炎，胃癌等其他消化道疾病，供臨床檢測和體檢篩查需要。PGI檢測作為非侵入性方法，降低患者痛苦，簡便、經濟、具有普查價值。
[0004]對于胃蛋白酶原I的檢測，目前臨床常用的方法包括:乳膠增強免疫比濁法，酶聯(lián)免疫法(elisa)，化學發(fā)光法，時間分辨免疫法，但是這些方法都有各自的特點及不足。乳膠增強免疫比濁法，操作簡單，可以全自動化，但是，其靈敏度不高，無法實現(xiàn)精確定量；ELISA法和時間分辨免疫法定量準確，但手工操作，過程復雜，且不適合單人份和較小批量檢測用。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條及其制備方法。采用該免疫層析試紙條，不僅能夠提供較高的靈敏度和特異性，操作簡單，滿足臨床檢驗的需要，而且降低了成本，滿足國內市場的需求。
[0006]為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了如下的技術方案:
[0007]本發(fā)明一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，該試紙條包括塑料卡殼、底板以及附著于底板上依次相互交錯排列的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，所述結合墊上包被有稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I ;所述包被膜上包被有檢測帶和質控帶，所述檢測帶固定有識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II，所述質控帶固定有兔抗鼠IgG抗體。
[0008]其中，所述的結合墊優(yōu)選為聚酯膜，其能夠載有足量的稀土離子微球，且遇樣品后又能迅速釋放微球。
[0009]其中，所述的包被膜優(yōu)選為硝酸纖維素膜。
[0010]其中，所述包被膜上包被的檢測帶和質控帶相互平行，所述檢測帶靠近所述結合墊，所述質控帶靠近所述吸水紙。
[0011]其中，所述的稀土離子微球選用本領域公知的用于標記抗體的任何鑭系元素微球，微球表面帶有活性基團，可以連接蛋白、糖類等生物物質，內含熒光素。優(yōu)選的稀土離子微球的直徑為100nm-300nm。
[0012]其中，所述試紙條裝于所述塑料卡殼內。
[0013]本發(fā)明還提供了一種制備上述試紙條的方法，其包括如下步驟:
[0014](I)在包被膜的不同位置分別固定識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體，形成檢測帶和質控帶；
[0015](2)制備稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I墊，并噴涂在結合墊上；
[0016](3)在底板上依次相互交錯的黏貼上樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，然后切割成寬度為0.5cm大小,裝入塑料卡殼。
[0017]其中，所述包被膜的制備方法是:使用含有1%_10%蔗糖的0.01-0.02mol/L的PH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，分別將識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到lmg/ml-1.5mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以lul/cm的量將二者以0.5cm-l.0cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，35_38°C烘干1_1.5h，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0018]其中，所述熒光標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I的制備方法包快以下步驟:
[0019](I)將胃蛋白酶原I單克隆抗體I用0.05mol/L的PH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液在4°C溫度下透析過夜,之后調整濃度為lmg/ml-1.5mg/ml ；
[0020](2)使用0.05mol/L的PH為7.2-7.6的MES活化緩沖液洗滌微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，終濃度為20mmol/L，室溫反應10-20分鐘，充分洗滌微球，用0.05mol/L的PH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液復溶后加入透析過的胃蛋白酶原I單克隆抗體I，使胃蛋白酶原I單克隆抗體I與微球的質量比為1:50-4:50，室溫反應2小時，力口入含有1%_10%BSA的0.01-0.05mol/L的PH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，室溫反應30分鐘，洗滌微球，用含有 0.05%-l%BSA, 0.05%-0.l%Tween-20, 0.01-0.05mol/L 的 PH 為 7.2-7.6 的磷酸鹽緩沖保存液復溶至原體積，使用定量噴膜儀以3ul/cm-5ul/cm噴涂于聚酯膜上，避光，在35-38°C烘干I小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0021]本發(fā)明在使用時，在樣品墊上加入樣品液，在毛細作用下，樣品液向吸水紙一段泳動，當待測標本中含有胃蛋白酶原I時，胃蛋白酶原I與稀土離子微球上的抗體形成抗原-抗體復合物，隨著層析作用，復合物向前移動，到達識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II檢測線T處，形成抗體-抗原-抗體夾心復合物，聚集在檢測線T處。未結合單克隆抗體II的稀土離子微球繼續(xù)前行，到達質控線C時，兔抗鼠IgG抗體與稀土離子微球上的鼠源性單抗結合，在C線處出現(xiàn)稀土離子微球的聚集。整個反應在15分鐘內完成，并進行上機讀卡。T線和C線都會產生相應的熒光信號，熒光檢測儀會根據(jù)定標卡上的信息將實際檢測值帶入預設的標準曲線中算出定量的結果。
[0022]本發(fā)明所達到的有益效果是:
[0023](I)通過對試紙條的改進，將時間分辨免疫層析技術引入胃蛋白酶原I的檢測中，結合時間分辨熒光檢測儀，實現(xiàn)了胃蛋白酶原I的單人份定量檢測，且靈敏度高，批內、批間差小，為臨床使用提供了極大便利。
[0024](2)本發(fā)明操作簡便，適合大規(guī)模生產，對于胃蛋白酶原I的定量檢測有著積極的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0026]圖1為實施例1和實施例2的標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0027]以下結合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0028]實施例1
[0029]本發(fā)明一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，該試紙條包括塑料卡殼、底板以及附著于底板上依次相互交錯排列的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，所述結合墊上包被有稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I ;所述包被膜上包被有檢測帶和質控帶，所述檢測帶固定有識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II，所述質控帶固定有兔抗鼠IgG抗體。
[0030]所述的結合墊為聚酯膜，其能夠載有足量的稀土離子微球，且遇樣品后又能迅速釋放微球。
[0031]所述的包被膜為硝酸纖維素膜；所述包被膜上包被的檢測帶和質控帶相互平行，所述檢測帶靠近所述結合墊，所述質控帶靠近所述吸水紙。
[0032]所述的稀土離子微球選用本領域公知的用于標記抗體的任何鑭系元素微球，微球表面帶有活性基團，可以連接蛋白、糖類等生物物質，內含熒光素。所述稀土離子微球的直徑為10nm其中，所述試紙條裝于所述塑料卡殼內。
[0033]本實施例的試紙條制備方法包括以下步驟:
[0034](I)在包被膜的不同位置分別固定識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體，形成檢測帶和質控帶；
[0035](2)制備稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I墊，并噴涂在結合墊上；
[0036](3)在底板上依次相互交錯的黏貼上樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，然后切割成寬度為0.5cm大小,裝入塑料卡殼。
[0037](4)所述試紙條的組裝需在操作過程必須在濕度小于35%，溫度為20_25°C的房間內進行。
[0038]其中，所述包被膜的制備方法是:使用含有1%蔗糖的0.01mol/L的PH為7.2的磷酸鹽緩沖液，分別將識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到lmg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以lul/cm的量將二者以0.5cmm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，35°C烘干lh，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0039]其中，所述熒光標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I的制備方法包快以下步驟:
[0040](I)將胃蛋白酶原I單克隆抗體I用0.05mol/L的PH為7.2的磷酸鹽緩沖液在4°C溫度下透析過夜，之后調整濃度為lmg/ml ；
[0041](2)使用0.05mol/L的PH為7.2的MES活化緩沖液洗滌微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，終濃度為20mmol/L，室溫反應10分鐘，充分洗滌微球，用0.05mol/L的PH為7.2的磷酸鹽緩沖液復溶后加入透析過的胃蛋白酶原I單克隆抗體I，使胃蛋白酶原I單克隆抗體I與微球的質量比為1:50，室溫反應2小時，加入含有1%BSA的0.0lmol/L的PH為7.2的磷酸鹽緩沖液，室溫反應30分鐘，洗滌微球，用含有0.05%BSA,0.05%Tween-20, 0.0lmol/L的PH為7.2的磷酸鹽緩沖保存液復溶至原體積，使用定量噴膜儀以3ul/cm噴涂于聚酯膜上，避光，在35°C烘干I小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0042]試紙條的定量檢測
[0043]A繪制標準曲線(圖1)
[0044]在制備好的胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條的加樣區(qū)加入不同濃度的胃蛋白酶原I標準品(取6個不同的濃度，分別為0ug/L、5ug/L、10ug/L、20ug/L、30ug/L、50ug/L,每個濃度做5個平行樣)。膜層析反應15分鐘后，儀器讀取質控線C、檢測線T信號，以檢測的樣品熒光值信號為縱坐標，胃蛋白酶原I標準品濃度為橫坐標，建立方程并擬合成標準曲線。
[0045]由圖1標準曲線可以看出，該標準曲線的R2為0.999，線性較好，可以通過該標準曲線對樣品中所含胃蛋白酶原I濃度進行定量分析。
[0046]B樣品檢測
[0047]在胃蛋白酶原I的熒光免疫層析試紙條的加樣區(qū)加入待測樣品，膜層析反應15分鐘。開啟熒光檢測設備，并將檢測條及校準卡插入熒光檢測設備的插卡口，運行儀器，儀器通過相應的分析軟件自動計算出待測樣本中的胃蛋白酶原I濃度。
[0048]實施例2
[0049]本發(fā)明一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，該試紙條包括塑料卡殼、底板以及附著于底板上依次相互交錯排列的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，所述結合墊上包被有稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I;所述包被膜上包被有檢測帶和質控帶，所述檢測帶固定有識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II，所述質控帶固定有兔抗鼠IgG抗體。
[0050]所述的結合墊為聚酯膜，其能夠載有足量的稀土離子微球，且遇樣品后又能迅速釋放微球。
[0051]所述的包被膜為硝酸纖維素膜；所述包被膜上包被的檢測帶和質控帶相互平行，所述檢測帶靠近所述結合墊，所述質控帶靠近所述吸水紙。
[0052]所述的稀土離子微球選用本領域公知的用于標記抗體的任何鑭系元素微球，微球表面帶有活性基團，可以連接蛋白、糖類等生物物質，內含熒光素。所述稀土離子微球的直徑為10nm其中，所述試紙條裝于所述塑料卡殼內。
[0053]本實施例的試紙條制備方法包括以下步驟:
[0054](I)在包被膜的不同位置分別固定識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體，形成檢測帶和質控帶；
[0055](2)制備稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I墊，并噴涂在結合墊上；
[0056](3)在底板上依次相互交錯的黏貼上樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，然后切割成寬度為0.5cm大小,裝入塑料卡殼。
[0057](4)所述試紙條的組裝需在操作過程必須在濕度小于35%，溫度20_25°C的房間內進行。
[0058]其中，所述包被膜的制備方法是:使用含有10%蔗糖的0.02mol/L的PH為7.6的磷酸鹽緩沖液，分別將識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到1.5mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以lul/cm的量將二者以1.0cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，38°C烘干1.5h，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0059]其中，所述熒光標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I的制備方法包快以下步驟:
[0060](I)將胃蛋白酶原I單克隆抗體I用0.05mol/L的PH為7.6的磷酸鹽緩沖液在4°C溫度下透析過夜，之后調整濃度為1.5mg/ml ；
[0061](2)使用0.05mol/L的PH為7.6的MES活化緩沖液洗滌微球，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，終濃度為20mmol/L，室溫反應20分鐘，充分洗滌微球，用0.05mol/L的PH為7.6的磷酸鹽緩沖液復溶后加入透析過的胃蛋白酶原I單克隆抗體I，使胃蛋白酶原I單克隆抗體I與微球的質量比為4:50，室溫反應2小時，加入含有10%BSA的0.05mol/L的PH為7.6的磷酸鹽緩沖液，室溫反應30分鐘，洗滌微球，用含有1%BSA，0.l%Tween-20, 0.05mol/L的PH為7.6的磷酸鹽緩沖保存液復溶至原體積，使用定量噴膜儀以5ul/cm噴涂于聚酯膜上，避光，在38°C烘干I小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0062]試紙條的定量檢測
[0063]A繪制標準曲線(圖1)
[0064]在制備好的胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條的加樣區(qū)加入不同濃度的胃蛋白酶原I標準品(取6個不同的濃度，分別為0ug/L、5ug/L、10ug/L、20ug/L、30ug/L、50ug/L,每個濃度做5個平行樣)。膜層析反應15分鐘后，儀器讀取質控線C、檢測線T信號，以檢測的樣品熒光值信號為縱坐標，胃蛋白酶原I標準品濃度為橫坐標，建立方程并擬合成標準曲線。
[0065]由圖1標準曲線可以看出，該標準曲線的R2為0.999，線性較好，可以通過該標線對樣品中所含胃蛋白酶原I濃度進行定量分析。
[0066]B樣品檢測
[0067]在胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條的加樣區(qū)加入待測樣品，膜層析反應15分鐘。開啟熒光檢測設備，并將檢測條及校準卡插入熒光檢測設備的插卡口，運行儀器，儀器通過相應的分析軟件自動計算出待測樣本中的胃蛋白酶原I濃度。。
[0068]最后應說明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，其特征在于:該試紙條包括塑料卡殼、底板以及附著于底板上依次相互交錯排列的樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，所述結合墊上包被有稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I ；所述包被膜上包被有檢測帶和質控帶，所述檢測帶固定有識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II，所述質控帶固定有兔抗鼠I姊抗體。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，其特征在于:所述的結合墊為聚酯膜，其能夠載有足量的稀土離子微球，且遇樣品后又能迅速釋放微球。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，其特征在于:所述的包被膜為硝酸纖維素膜。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，其特征在于:所述包被膜上包被的檢測帶和質控帶相互平行，所述檢測帶靠近所述結合墊，所述質控帶靠近所述吸水紙。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，其特征在于:所述的稀土離子微球為球內灌注有時間分辨的鑭系元素絡合物，且其直徑范圍為 100鹽-30011111。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條，其特征在于:所述試紙條裝于所述塑料卡殼內。
7.一種制備權利要求1-6任一項所述定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條的方法，其特征在于:所述制備方法包括如下步驟: (1)在包被膜的不同位置分別固定識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II和兔抗鼠抗體，形成檢測帶和質控帶； (2)制備稀土離子微球標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I墊，并噴涂在結合墊上； (3)在底板上依次相互交錯的黏貼上樣品墊、結合墊、包被膜和吸水紙，然后切割成寬度為0.50111大小，裝入塑料卡殼。
8.根據(jù)權利要求7所述的一種制備定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條的方法，其特征在于:所述包被膜的制備方法是:使用含有1%-10%蔗糖的0.01-0.02^01/1的四為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，分別將識別不同抗原表位的胃蛋白酶原I單克隆抗體II和兔抗鼠I姊抗體稀釋到1呢?1-1? 5呢加1的濃度，使用定量噴膜儀以1111/(3111的量將二者以0.5^-1.0挪的間隔噴于硝酸纖維素膜上，35-381烘干1-1.5匕加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> 9.根據(jù)權利要求7所述的一種制備定量檢測胃蛋白酶原I的時間分辨免疫層析試紙條的方法，其特征在于:所述熒光標記的胃蛋白酶原I單克隆抗體I的制備方法包括以下步驟: (1)將胃蛋白酶原I單克隆抗體I用0.05001/1的為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液在 溫度下透析過夜，之后調整濃度為11118/1111-1.51118/1111 ； (2)使用0.0511101/1的為7.2-7.6的123活化緩沖液洗滌微球，加入碳二亞胺(￡00和.羥基琥珀酰亞胺(順3),終濃度為2011111101/1，室溫反應10-20分鐘，充分洗滌微球，用.0.05001/1的為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液復溶后加入透析過的胃蛋白酶原I單克隆抗體I，使胃蛋白酶原I單克隆抗體I與微球的質量比為1:50-4: 50，室溫反應2小時，加入含有1%-10%83八的0.01-0.0511101/1的？??！為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液，室溫反應30分鐘，洗滌微球，用含有 0.05%-1%83八，0.05^-0.1%1'界6611-20，0.01-0.0511101/1 的？??！為 7.2-7.6 的磷酸鹽緩沖保存液復溶至原體積，使用定量噴膜儀以噴涂于聚酯膜上，避光，在35-381烘干1小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】G01N33/533GK104422772SQ201310408079
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權日:2013年9月10日
【發(fā)明者】黃飚, 周衍, 鄒霈, 呂坤祥, 張玨, 張藝, 周彬 申請人:江蘇省原子醫(yī)學研究所