專利名稱：中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂質(zhì)運載蛋白含量檢測試劑盒，尤其涉及一種人體內(nèi)中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)含量的檢測試劑盒及其制備方法，本發(fā)明進一步涉及該檢測試劑盒在檢測人體內(nèi)NGAL含量的使用方法，屬于人體內(nèi)NGAL含量的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)運載蛋白家族中的一個新成員一中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocal in, NGAL),與急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)及各種原因引起的慢性腎臟病(chronic kidneydisease, CKD)密切相關(guān)，是預測AKI的一個新型標記物，同時也是監(jiān)測CKD進展和腎功能損害的生物學指標。NGAL是脂質(zhì)運載蛋白家族的成員之一，于1993年由Kjeldsen等在人類中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)和分離出來，它的大鼠、小鼠種間同源基因分別為α 2微球相關(guān)蛋白和24ρ3蛋白。在生物體內(nèi)NGAL有分子量為25kDa、自身聚合46kDa同源二聚體或與MMP-9聚合形成135kDa異源二聚體三種存在方式。NGAL具有由8條β折疊相互作用而形成的β自折疊桶結(jié)構(gòu)，其底部內(nèi)側(cè)的疏水核可以結(jié)合并轉(zhuǎn)運親脂性配體，這一結(jié)構(gòu)特點決定了 NGAL的生物活性。在β -折疊桶封閉端的β 4- β 5間有游離的巰基(Cys87)，這為NGAL結(jié)合MMP-9前體奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前認為NGAL蛋白能運輸介導炎癥反應的一些親脂性分子，如血小板活化因子(PAF)、白三烯B4(LTB4)和脂多糖(LPS)等；調(diào)節(jié)MMP-9活性，并可能參與清除炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫反應，抑制細胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移等過程。NGAL還通過與含鐵的鐵載體結(jié)合，形成NGAL-鐵載體-鐵復合物，參與腎臟的發(fā)生、發(fā)展及修復過程。在正常的生理狀態(tài)下，除了中性粒`細胞以外，NGAL在人類很多組織如支氣管、胃、小腸、胰腺、腎臟等的上皮細胞中有低水平表達。而在病理狀態(tài)下，這些組織的上皮細胞則有大量NGAL表達，特別是在損傷的近端腎小管上皮細胞中。在尋找AKI早期診斷標記物的研究中，人們發(fā)現(xiàn)NGAL是一個很好的預測及診斷指標。有學者在急性缺血再灌注和順鉬誘導的AKI小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)在損傷發(fā)生數(shù)小時之內(nèi)即可檢測到NGAL的表達明顯增高。美國Cincinnati兒童中心的研究發(fā)現(xiàn),在接受心臟分流術(shù)的71例兒童患者中，其中20例術(shù)后發(fā)生急性腎功能衰竭的患兒術(shù)后2h尿NGAL水平即明顯升高，而其血肌酐的升高則發(fā)生在術(shù)后l-3d，提示尿NGAL是缺血性腎損傷的一個早期、敏感指標。后來不少類似的研究均得到同樣的結(jié)論，即AKI時血、尿NGAL水平均升高，尿NGAL水平升高更為顯著。并且NGAL升高較早期腎臟損傷的其他指標如腎臟損傷分子(kidney injury molecularl, KIM-1) > Cyr61 (cystein richprotein61)、β 2-微球蛋白等出現(xiàn)得要早。同時，NGAL水平與腎臟損傷程度呈正相關(guān)，血和尿NGAL可作為診斷AKI早期、敏感、特異性的早期生物學標記物，并在一定程度上可以反映AKI嚴重程度及判斷預后。目前NGAL的檢測方法有酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、Western-blotting、化學發(fā)光法以及膠乳免疫比濁法。酶聯(lián)免疫法自動化程度不高，且受人為因素影響較大；放射免疫法存在著環(huán)境污染問題lestern-blotting操作復雜，測定精密度低；而化學發(fā)光法靈敏度雖高，但測定線性范圍較小且檢測成本較高，需要特定化學發(fā)光檢測儀，這些原因?qū)е缕鋺梅秶^?。荒z乳免疫比濁法也是測定人血漿或尿液中NGAL濃度的常用方法，它與上述其他幾種方法相比較，存在操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬、無污染、應用范圍廣等顯著的特點。因此，膠乳免疫比濁法有著極大的研究價值，但是目前市場上的膠乳免疫比濁法檢測試劑盒存在著檢測不到NGAL/MMP-9復合物、抗干擾能力差、特異性低、試劑穩(wěn)定性不好或檢測線性范圍窄等問題，有待改進。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒;本發(fā)明的目的之二是提供一種制備所述中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒的方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑I和試劑II組成；所述試劑I的組分包括生物緩沖劑、表面活性劑、促凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、阻斷劑、螯合劑和水；所述試劑II的組分包括包被中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、防腐劑、助懸劑、封閉劑、穩(wěn)定劑和水；其中，所述的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)抗體既能和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗原結(jié)合又能和MMP-9/NGAL復合物相結(jié)合。優(yōu)選的，本發(fā)明中所述的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)抗體通過親和層析方法篩選得到；優(yōu)選的，所述的篩選方法包括 (I) MMP-9親和層析柱的制備將MMP-9蛋白與壓積CNBr_Sepharose4B混合,依次經(jīng)過交聯(lián)、清洗、封閉殘留的活化基團、再次清洗、裝柱、平衡，得到MMP-9親和層析柱；(2)MMP-9/NGAL復合物親和層析柱的制備將蛋白NGAL溶液過MMP-9親和層析柱；然后用磷酸緩沖液洗脫多余的NGAL蛋白；(3)親和層析將NGAL抗體溶液通過所制備的親和層析柱，去除非特異性吸附后進行解吸，分段收集解吸液，充分透析掉解吸液中的TB，真空冷凍干燥，即得。其中，步驟(I)中CNBr_Sepharose4B與5_7mg蛋白MMP-9按照每毫升壓積CNBr-Sepharose4B與5_7mg蛋白MMP-9的比例進行混合；步驟(I)中所述的封閉方式加等質(zhì)量的O. lmol/L乙醇胺-HC14°C搖動I小時。優(yōu)選的，步驟(2)中將蛋白NGAL配制成2mg/mL的溶液，用NGAL蛋白溶液以ImL/min的流速過MMP-9親和層析柱；然后用O. lmol/L pH8. O磷酸緩沖液以lmL/min的流速洗脫多余的NGAL蛋白；優(yōu)選的，步驟(3)中將NGAL抗體濃度調(diào)整至600ug/mL，以6mL/小時流速通過所制備的親和層析柱、再依次用lmol/L NaCl-TB,O. 5% NP_40_TB、TB和雙蒸水清洗以去除非特異性吸附；然后用3mol/L KSCN6mL/小時進行解吸；紫外檢測分段收集解吸液。本發(fā)明所述包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備方法包括
(I)制備羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液稱取粒徑為105_145nm的聚苯乙烯膠乳顆粒干燥物，加入磷酸鹽緩沖液分散，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺和硫代NHS，室溫下攪拌反應；離心棄上清，再用磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳，得到羧化改性聚苯乙烯膠乳；⑵NGAL抗體溶液的制備將篩選得到的既能和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗原結(jié)合又能和MMP-9/NGAL復合物相結(jié)合的NGAL單克隆抗體或多克隆抗體用去離子水溶解，得到NGAL抗體溶液；(3)包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備步驟⑵所制備的抗體溶液用磷酸緩沖液稀釋后加入羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液，在室溫下攪拌反應，終止反應后，離心棄上清，洗滌沉淀，即得。本發(fā)明中所述的的膠乳顆粒為粒徑為105_145nm的中等粒徑的膠乳顆粒，采用該粒徑范圍內(nèi)的膠乳顆粒既可以解決小粒徑膠乳檢測靈敏度不夠的問題，還可以解決大粒徑膠乳檢測線性范圍小的問題，同時還可以避免大粒徑膠乳在長時間存放過程中下沉導致的產(chǎn)品穩(wěn)定性不好的問題。而且采用一種粒徑的膠乳顆粒制備檢測試劑盒減少了試劑盒生產(chǎn)過程中的工序，即節(jié)省了成本又避免了過多工序?qū)Ξa(chǎn)品品質(zhì)的影響。為了達到更好的檢測效果，每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑5-100g，表面活性劑O. 5-20mL，促凝劑2-50g，防腐劑O. 02_lmL，穩(wěn)定劑l_60g，阻斷劑1-lOmL，螯合劑O. 05-5g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為包被NGAL抗體的膠乳顆粒O.1-1Og,生物緩沖劑l-100g，螯合劑O.1-1Og,表面活性劑O. 05-3mL,防腐劑O. 02-lmL,助懸劑5_50mL，封閉劑5_50g，穩(wěn)定劑50-150g，余量為水。進一步優(yōu)選的，每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑7_20g，表面活性劑Ι-lOmL，促凝劑10-30g,防腐劑O. 1-0. 5mL，穩(wěn)定劑5_15g，阻斷劑3_6mL，螯合劑O. Ι-lg，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為包被NGAL抗體的膠乳顆粒O. 5_5g，生物緩沖劑5-30g，螯合劑O. 5-4g，表面活性劑O. 5-2mL,防腐劑O. 1-0. 5mL，助懸劑10_40mL，封閉劑7_15g，穩(wěn)定劑80-120g，余量為水。最優(yōu)選的，每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑12g，表面活性劑4mL，促凝劑15g，防腐劑O. 25mL，穩(wěn)定劑10g，阻斷劑5mL，螯合劑O. 4g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為包被NGAL抗體的膠乳顆粒1.1g,生物緩沖劑llg，螯合劑2g，表面活性劑1. 5mL，防腐劑O. 25mL，助懸劑20mL，封閉劑10g，穩(wěn)定劑IOOg,余量為水。試劑I或試劑II中所述的生物緩沖劑是能夠用于維持一定PH值的各種生物緩沖齊U，例如可以是三羥甲基氨基甲烷(TriS)、三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸(HEPES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1，4- 二羥基丙磺酸(POPSO)、3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)等各種常用生物緩沖液，為了達到更好的檢測效果，試劑I中所述的生物緩沖劑優(yōu)選為三羥甲基氨基甲烷(Tris)，試劑II中所述的生物緩沖劑優(yōu)選為3-(N-嗎啉)丙磺酸。試劑I或試劑II中所述的表面活性劑主要起到促進試劑體系中各組分以及檢測樣本中各物質(zhì)的均勻分散及提高檢測的精密度，達到減少樣本濁度對測定結(jié)果的影響的目的；因此，現(xiàn)有的具有增溶性質(zhì)的表面活性劑都可作為試劑I或試劑II中所述的表面活性齊U，例如，吐溫20、吐溫40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等。本發(fā)明的試劑I和試劑II中的表面活性劑優(yōu)選為曲拉通X-100。試劑I或試劑II中所述的防腐劑主要是為了防止細菌滋生導致的產(chǎn)品變質(zhì)，所以任何一種能起到防止細菌滋生作用的防腐劑均能適用于本發(fā)明；本發(fā)明試劑I和試劑II中的防腐劑優(yōu)選為Procl in-300，該產(chǎn)品毒性小，使用劑量小，殺菌譜廣。試劑I或試劑II中所述的穩(wěn)定劑，主要作用是保護抗體的活性及防止膠乳顆粒的凝集、下沉，同時還可以增加試劑盒中各組分的穩(wěn)定性，延長產(chǎn)品的貨架期及開瓶后使用時間。常用的穩(wěn)定劑為糖類、醇類、蛋白類以及一些氨基酸等，本發(fā)明中的試劑I和試劑II中的穩(wěn)定劑優(yōu)選為蔗糖。試劑I中的促凝劑可以促進抗原抗體反應，有利于膠乳顆粒交聯(lián)物的形成和增大，提高檢測靈敏度和線性范圍。本發(fā)明檢測試劑盒中的促凝劑優(yōu)選為PEG-6000或PEG-8000。試劑I中的阻斷劑可以有效避免非特異性反應對檢測結(jié)果的干擾。檢測試劑盒中常見的干擾因素有以下兩類異嗜性抗體干擾、類風濕因子干擾。本發(fā)明優(yōu)選的阻斷劑為類風濕因子阻斷劑。部分類風濕關(guān)節(jié)炎、各種膠原結(jié)締組織病、肝病以及多種慢性疾病病人體內(nèi)會出現(xiàn)的一類自身抗體，可與自身IgG分子的Fe段抗原決定簇起反應，該類抗體被稱為類風濕因子。試劑I及試劑II中的螯合劑能夠絡(luò)合檢測樣本中的金屬離子，以減少金屬離子造成的干擾；因此，能夠絡(luò)合金屬離子的 各種螯合劑均能夠適用，例如乙二胺四乙酸二鈉，氨基三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸及其鹽等，本發(fā)明試劑II優(yōu)選乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)為螯合劑。試劑II中的助懸劑可以幫助膠乳顆粒維持一個很好的分散狀態(tài)，防止膠乳顆粒下沉影響檢測試劑盒的品質(zhì)及開瓶穩(wěn)定性，常用的助懸劑有乙二醇、丙三醇、乳糖和麥芽糖等，本發(fā)明試劑II優(yōu)選乙二醇作為助懸劑。試劑II中的封閉劑的作用是為了與膠乳顆粒中游離的-COOH位點結(jié)合，避免游離的羧基位點對檢測結(jié)果造成不良影響，本發(fā)明試劑II中優(yōu)選BSA蛋白作為封閉劑。本發(fā)明檢測試劑盒中所用到的每種組分均能通過商業(yè)途徑從生物試劑公司或醫(yī)藥公司購買得到。本發(fā)明的另外一個目的是提供一種制備所述檢測NGAL試劑盒的方法，包括(I)制備試劑1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；(2)制備試劑I1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；(3)將試劑I和試劑II單獨分裝，密封，即得。本發(fā)明的又一目的是提供所述NGAL檢測試劑盒檢測樣品中NGAL含量的檢測方法，該方法為兩點終點法，包括以下步驟向2. 5μ L待檢測樣本(校準管以校準品做樣品，空白以蒸餾水為樣品)中加入120 μ L的試劑I充分混勻，于37°C恒溫5分鐘，再向混合體系中加入30 μ L試劑II，混勻，37°C恒溫I分鐘后，空白管調(diào)零，波長570nm，測定各管吸光度Al，4分鐘后測定各管吸光度A2。計算ΛΑ = Α2-Α1。根據(jù)多點校準品濃度和對應吸光度變化值△ A，采用多點非線性校準模式確定工作曲線，樣本吸光度變化在工作曲線上相對應的濃度值即為測定濃度。本發(fā)明檢測試劑盒在現(xiàn)有的NGAL膠乳檢測試劑盒的基礎(chǔ)上對現(xiàn)有技術(shù)和配方進行了改進，克服了現(xiàn)有膠乳檢測試劑盒抗干擾性差，消除了 NGAL/MMP-9復合物對檢測結(jié)果的影響；此外，本發(fā)明檢測試劑盒采用中等粒徑的膠乳顆粒為載體制備得到包被中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)抗體的膠乳顆粒，不僅提高了檢測靈敏度，也有效解決了檢測線性范圍窄以及產(chǎn)品穩(wěn)定性不夠的問題。本發(fā)明檢測試劑盒可以克服干擾因子的影響，可以檢測到NGAL與MMP-9的復合物，避免NGAL檢測結(jié)果偏低導致醫(yī)生的誤判；同時本發(fā)明檢測試劑盒還具有開瓶穩(wěn)定性好、檢測線性范圍廣、生產(chǎn)成本較低等有點。


圖1是本發(fā)明檢測試劑盒的標準工作曲線。
圖2是本發(fā)明檢測試劑盒的37°C熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果。，
圖3是對比NGAL膠乳免疫比濁 法檢測試劑盒37°C熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。預備實施例1NGAL抗體的篩選1、MMP-9親和層析柱的制備將蛋白MMP-9 (購自R&D公司)與與壓積CNBr_Sepharose4B(Pharmacia產(chǎn)品)按5_7mg/mL比例混合，4°C搖動20小時，使其交聯(lián)。然后用O. lmol/L pH8. O碳酸鹽緩沖液清洗3次，再加等量O. lmol/L乙醇胺-HCl 4°C搖動I小時，以封閉殘留的活化集團。最后用O. 01mol/L Tris-HCl (TB)清洗、裝柱、平衡，柱子的容積選用10mL。2、MMP-9/NGAL復合物親和層析柱的制備將蛋白NGAL(購自R&D公司)配制成2mg/mL的溶液，用NGAL蛋白溶液以lmL/min的流速過MMP-9親和層析柱，蛋白溶液的用量為60mL ;然后用0. lmol/L pH8. O磷酸緩沖液以lmL/min的流速洗脫多余的NGAL蛋白，洗脫液的用量為100mL。3、親和層析NGAL抗體(購自武漢華美生物工程有限公司)，將NGAL抗體濃度調(diào)整至600ug/mL，以6mL/小時流速通過步驟2制備的親和層析柱、依次用lmol/L NaCl-TB,0. 5%NP-40-TB、TB和雙蒸水清洗，以去除非特異性吸附。然后用3mol/L KSCN6mL/小時進行解吸。紫外檢測分段收集解吸液。用透析袋充分透析掉TB，后真空冷凍干燥溶液，既得經(jīng)篩選的NGAL抗體。預備實施例2包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備過程如下①羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液的制備稱取1. Og粒徑為105nm的聚苯乙烯膠乳顆粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室溫下攪拌反應0. 5小時，離心棄上清，再用IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳既得羧化改性聚苯乙烯膠乳；
②NGAL抗體溶液的制備將250 μ g預備實施例1所篩選得到的NGAL抗體用O. 5mL去離子水溶解，得到NGAL抗體溶液；③包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備取100 μ L②步所制得的NGAL抗體溶液，用5mL0. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入5mL步驟①制得膠乳溶液，在室溫下攪拌反應2小時，加入O. 2mL0.1M甘氨酸緩沖液和2mL10%BSA溶液，攪拌30分鐘，終止反應，離心棄上清，用O. 12M磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次，得到包被NGAL抗體的膠乳顆粒。預備實施例3包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備過程如下①羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液的制備稱取1. Og粒徑為130nm的聚苯乙烯膠乳顆粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室溫下攪拌反應O. 5小時，離心棄上清，再用IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳既得羧化改性聚苯乙烯膠乳；②NGAL抗體溶液的制備將250 μ g預備實施例1所篩選得到的NGAL抗體用O. 5mL去離子水溶解，得到NGAL抗體溶液；③包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備取100 μ L②步所制得的NGAL抗體溶液，用5mL0. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入5mL步驟①制得膠乳溶液，在室溫下攪拌反應2小時，加入O. 2mL0.1M甘氨酸緩沖液和2mL10%BSA溶液，攪拌30分鐘，終止反應，離心棄上清，用O. 12M磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次，得到包被NGAL抗體的膠乳顆粒。預備實施例4包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備過程如下

①羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液的制備稱取1. Og粒徑為145nm的聚苯乙烯膠乳顆粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl_乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室溫下攪拌反應O. 5小時，離心棄上清，再用IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳既得羧化改性聚苯乙烯膠乳；②NGAL抗體溶液的制備將250 μ g預備實施例1所篩選得到的NGAL抗體用O. 5mL去離子水溶解，得到NGAL抗體溶液；③包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備取100 μ L②步所制得的NGAL抗體溶液，用5mL0. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入5mL步驟①制得膠乳溶液，在室溫下攪拌反應2小時，加入O. 2mL0.1M甘氨酸緩沖液和2mL10%BSA溶液，攪拌30分鐘，終止反應，離心棄上清，用O. 12M磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次，得到包被NGAL抗體的膠乳顆粒。實施例1 NGAL膠乳檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分三羥甲基氬基甲烷(Tris)ISg
曲拉通 X-1OO0.5mL
PEG-600015g
Prociln-3000.25mL
蔗糖10S
阻斷齊y4mL
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)OAg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
包被NGAL抗體的膠乳顆粒(預備實施倒2制備)I Jg
3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )10,5g
乙二胺四乙酸二鈉《EDTA-2Na)2g
曲拉通X-100〗.5mL
Proclin-3000 25mL
乙二醇20纖L
牛血清白蛋白(BSA )IOg
蔗糖I OOg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例2 NGAL膠乳檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分三羥甲基氨基甲烷(Tris)IOg
曲拉通X-100ImL
PEG-6000!2g
Proclin-300OJmL
藤糖30g
阻斷齊[I3mL
乙二駿 _乙酸二鈉(EDTA-2Na)0,8g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
包被NGAL抗體的膠乳顆粒《預備實施例3所制備)2g
3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )I Sg
乙二胺_乙酸二鈉(EDTA-2Na)3g
_拉通 X-1002mL
Proclin-3000.3 in L
jt...........3 0 ιτι L
牛Il清白蛋白(BSA )ISg
蔗糖SOg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例3 NGAL膠乳檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分三羥甲基氨基甲烷(Tris)3§g
曲拉通 x-1001.SmL
IM30g Proclin-3000.3mL
庶糖20g
阻斷翻5mL
乙二胺圓乙薩二鋪(EDTA-2Na)2g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備 按所述用量取各組分
包被NGAL抗體的膠乳顆粒(預ft賣靈倒4所制罃} 2.2g 3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )20g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)Sg
曲拉通X-100I JmL
Proclin-3000,5mL
Cj'~β1-ymL·
牛血清白蛋白(BSA )30g
藤糖120g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例4 NGAL膠乳檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分三羥甲基氨基甲烷(Tris)20g
曲拉通X-1002mL
PEG-600040g
Proclin-3000 9mL
簾糖40g
阻斷齊I)7m L
乙二駿 _乙酸二鈉(EDTA-2Na)0,5g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
ft被NGAL抗體的膠乳顆粒(麗備實施倒3所制餐)4g
3-(N-嗎啉)丙磺_ ( MOPS )40g
乙二驗圏乙酸二 _(EDTA-2Na)6g
_fiil X-100LfimL
Prodin-3000.7mL
乙二醇40mL
牛Jl清白蛋白(BSA )40g
蔗糖IlOg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例5 NGAL膠乳檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分三羥甲基氨基甲烷(Tris)40g
_ 拉邇 x-100IJmL
P EG-600035 g
Procli 11 3 000.7mL
蒙糖35g
阻斷劑9mL
乙二胺四乙酸二鈉{EDTA-2Na)0.6g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
包被 N (i Λ I」 抗顆粒(預備實施例4所■備)3g
3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )30g
乙二胺圏乙酸二補(EDTA-2Na)3g
`曲拉通x-1002mL
Proclin-300OAmL
**7 ***** Sm^ / \ t V I⑴1.
牛It澝白蛋白(BSA )15g
蔗糖IOOg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例6 NGAL膠乳檢測試劑盒的制備1、試劑I的制備:按所述用量取各組分三羥甲基氛基甲烷(Tris)ISg
_拉通 x-100OJmL
PEG-600018g
Proclin-3000.15mL
詹 β26g
阻斷劑SmL 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)Ig將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
包被NGAL抗體的膠乳顆?！额A備實施例2所制備、2g
3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS )14g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)4g
曲拉通X-100IJmL
Proclin-3000.4mL
乙二 _20mL
牛血清白蛋白(BSA )20g
*糖90g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。對比實施例1 NGAL膠乳檢測試劑盒的制備一、包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備①羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液的制備稱取1. Og粒徑為IOOnm的聚苯乙烯膠乳顆粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室溫下攪拌反應O. 5小時，離心棄上清，再用IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳既得羧化改性聚苯乙烯膠乳；②NGAL抗體溶液的制備將250 μ g NGAL抗體用O. 5mL去離子水溶解，得到NGAL抗體溶液；③包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備取100 μ L②步所制得的NGAL抗體溶液，用5mL0. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入5mL步驟①制得膠乳溶液，在室溫下攪拌反應2小時，加入O. 2mL0.1M甘氨酸緩沖液和2mL10%BSA溶液，攪拌30分鐘，終止反應，離心棄上清，用O. 12M磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次，得到包被NGAL抗體的膠乳顆粒。二、試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
三 ,基鏟基甲焼(Tris)ISg
_據(jù)邇 Χ·_O.SmL
PEG-6000I Sg
Proclin-300OJSmL
蔗糖IOg
阻斷劑4mL
乙二胺四乙 酸二 _(EDTA-2Na)0,4g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
ft植NGAL抗體_歷乳顆粒I Jg
3-(Ν- 啉)H礒睡(MOPS )10—5g
乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)2g
_拉通 X-丨001.5mL
Procl in-3000.25mL
乙二酵20mL
牛血澝白蛋白(BSA )IOg
簾糖I OOg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。對比實施例2 NGAL膠乳檢測試劑盒的制備一、包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備①羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液的制備稱取1. Og粒徑為50nm的聚苯乙烯膠乳顆粒干燥物，加入IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 5)分散，加入40mgl_乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，再加入20mg的硫代NHS，在室溫下攪拌反應O. 5小時，離心棄上清，再用IOOmLO. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳既得羧化改性聚苯乙烯膠乳；
②NGAL抗體溶液的制備將250 μ g NGAL抗體用O. 5mL去離子水溶解，得到NGAL抗體溶液；③包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備取100 μ L②步所制得的NGAL抗體溶液，用5mL0. 12M磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入5mL步驟①制得膠乳溶液，在室溫下攪拌反應2小時，加入O. 2mL0.1M甘氨酸緩沖液和2mL10%BSA溶液，攪拌30分鐘，終止反應，離心棄上清，用O. 12M磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀2次，得到包被NGAL抗體的膠乳顆粒。二、試劑盒的制備1、試劑I的制備按所述用量取各組分
權(quán)利要求
1.一種中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑I和試劑II組成；所述試劑I的組分包括生物緩沖劑、表面活性劑、促凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、阻斷齊U、螯合劑和水；所述試劑II的組分包括包被中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、防腐劑、助懸劑、封閉劑、穩(wěn)定劑和水；其特征在于所述的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體既能和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗原結(jié)合又能和MMP-9/NGAL復合物相結(jié)合。
2.按照權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體通過親和層析方法篩選得到；優(yōu)選的，其篩選方法包括 (1)制備MMP-9親和層析柱將MMP-9蛋白與壓積CNBr-S印harose4B混合，依次經(jīng)過交聯(lián)、清洗、封閉、再次清洗、裝柱、平衡，得到MMP-9親和層析柱； (2)制備MMP-9/NGAL復合物親和層析柱將蛋白NGAL溶液過MMP-9親和層析柱；再洗脫多余的NGAL蛋白； (3)親和層析將NGAL抗體溶液通過步驟(I)所制備的親和層析柱，去除非特異性吸附后進行解吸，分段收集解吸液，透析，冷凍干燥，即得。
3.按照權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備方法包括 (1)制備羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液取粒徑為105-145nm的聚苯乙烯膠乳顆粒干燥物，用緩沖液分散，加入1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺和硫代NHS，室溫下攪拌反應；離心棄上清，再用緩沖液稀釋分散沉淀膠乳，得到羧化改性聚苯乙烯膠乳； (2)NGAL抗體溶液的制備將篩選得到的既能和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗原結(jié)合又能和MMP-9/NGAL復合物相結(jié)合的NGAL單克隆抗體或多克隆抗體用去離子水溶解，得到NGAL抗體溶液； (3)包被NGAL抗體的膠乳顆粒的制備將步驟(2)所制備的抗體溶液用緩沖液稀釋后，加入羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液，在室溫下攪拌反應，終止反應后，離心棄上清，洗滌沉淀，即得。
4.按照權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的表面活性劑為曲拉通X-1OO ;所述的防腐劑為Proclin-300 ;所述的穩(wěn)定劑為蔗糖；所述的促凝劑為PEG-6000或PEG-8000 ;所述的阻斷劑為類風濕因子阻斷劑；所述的螯合劑為乙二胺四乙酸二鈉；所述的助懸劑為乙二醇；所述的封閉劑為牛血清白蛋白。
5.按照權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于試劑I中所述的生物緩沖劑為三羥甲基氨基甲烷，試劑II中所述的生物緩沖劑為3-(N-嗎啉)丙磺酸。
6.按照權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑5-100g，表面活性劑O. 5-20mL，促凝劑2_50g，防腐劑O. 02_lmL，穩(wěn)定劑l_60g，阻斷劑Ι-lOmL，螯合劑O. 05-5g，余量為水； 每I升試劑II中各組分的用量為包被NGAL抗體的膠乳顆粒O. Ι-lOg，生物緩沖劑1-1OOg,螯合劑O. Ι-lOg,表面活性劑O. 05-3mL,防腐劑O. 02-lmL，助懸劑5_50mL，封閉劑5_50g，穩(wěn)定劑50-150g，余量為水。
7.按照權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑7-20g，表面活性劑Ι-lOmL，促凝劑10_30g，防腐劑O. 1-0. 5mL,穩(wěn)定劑5_15g，阻斷劑3-6mL，螯合劑0. 1-lg，余量為水； 每1升試劑II中各組分的用量為包被NGAL抗體的膠乳顆粒0. 5-5g，生物緩沖劑5-30g,螯合劑0. 5-4g，表面活性劑0. 5-2mL,防腐劑0. 1-0. 5mL，助懸劑10_40mL，封閉劑7_15g，穩(wěn)定劑 80-120g。
8.按照權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:每1升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑12g，表面活性劑4mL，促凝劑15g，防腐劑0. 25mL,穩(wěn)定劑10g，阻斷劑5mL，螯合劑0.4g，余量為水； 每1升試劑II中各組分的用量為包被NGAL抗體的膠乳顆粒1. 7g，生物緩沖劑llg，螯合劑2g，表面活性劑1. 5mL,防腐劑0. 25mL，助懸劑20mL，封閉劑10g，穩(wěn)定劑100g。
9.按照權(quán)利要求1-8任何一項的檢測試劑盒，其特征在于試劑I的pH值的范圍為7.0-8. 0，試劑II的pH值的范圍為6. 5-7. 5。
10.一種制備權(quán)利要求1-8任何一項所述檢測試劑盒的方法，包括(1)制備試劑I:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；(2)制備試劑II:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；(3)將試劑I和試劑II單獨分裝，密封，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測試劑盒及其制備方法；所述檢測試劑盒由彼此獨立的試劑I和試劑Ⅱ組成；試劑I的組分包括生物緩沖劑、表面活性劑、促凝劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、阻斷劑、螯合劑和水；試劑Ⅱ的組分包括包被中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、防腐劑、助懸劑、封閉劑、穩(wěn)定劑和水；本發(fā)明試劑盒的中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體既能和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗原結(jié)合又能和MMP-9/NGAL復合物相結(jié)合，有效避免了NGAL/MMP-9復合物對檢測結(jié)果的影響，具有特異性強，靈敏度高，線性范圍廣，穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK103048464SQ20121039494
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者華權(quán)高, 沈鶴霄, 黃愛, 許可, 馬峰, 閆彩霞, 常向博, 舒芹 申請人:武漢生之源生物科技有限公司