專(zhuān)利名稱(chēng)：苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒(酶定量法)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床化學(xué)診斷試劑應(yīng)用設(shè)備技術(shù)領(lǐng)域，屬于一種基于利用高比活性和 高得率的L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)的新技術(shù)而進(jìn)行開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的用于新生兒苯丙酮尿癥 檢測(cè)項(xiàng)目的篩查試劑盒。
背景技術(shù)：
目前，公知的現(xiàn)在國(guó)內(nèi)用于檢測(cè)新生兒血中苯丙氨酸濃度最廣泛的實(shí)驗(yàn)方法是細(xì) 菌抑制法和熒光法、酶法。細(xì)菌抑制法存在的不足，該方法是一種半定量方法，主觀性強(qiáng)，靈敏度低，實(shí)驗(yàn)時(shí) 間較長(zhǎng)等，另外，人工處理檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，手工登記檢驗(yàn)記錄，不利于數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)和備查，給新生 兒疾病中心規(guī)范化管理帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。而熒光法試劑易受自然物質(zhì)中存在的熒光干擾并且 需額外添置昂貴試驗(yàn)檢測(cè)設(shè)備的缺點(diǎn)。介于上述兩種方法的不足，我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次成功開(kāi)發(fā)出用于新生兒苯丙酮尿癥篩 查的酶法定量檢測(cè)試劑盒，成功的克服了細(xì)菌抑制法、熒光法在篩查工作中的諸多缺點(diǎn)，以 利于使用單位更好的、更準(zhǔn)確開(kāi)展新生兒篩查工作。

發(fā)明內(nèi)容
1、將球形芽孢桿菌的pdh基因克隆到大腸桿菌pET系統(tǒng)并進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)活性藍(lán) 4純化獲得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)，基于該酶開(kāi)發(fā)的新生兒苯丙 酮尿癥篩查試劑的技術(shù)指標(biāo)達(dá)到國(guó)外先進(jìn)水平，其(與美國(guó)Bio-Rad公司試劑方法學(xué)比較 r > 0. 9)。2、篩選出的底物顯色系統(tǒng)，生成的產(chǎn)物可以在波長(zhǎng)450nm下進(jìn)行讀數(shù)，適用于所 有醫(yī)院常規(guī)使用的酶標(biāo)儀，而無(wú)須更換濾光片，改變了國(guó)外進(jìn)口試劑必須使用570nm的濾 光片的局限。此項(xiàng)技術(shù)處于國(guó)外先進(jìn)水平。3、利用冷凍真空干燥技術(shù)，將L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)和輔酶(NAD+)由液態(tài) 轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，從而大大提高了試劑盒的有效期及穩(wěn)定性。本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)果準(zhǔn)確可靠、無(wú)創(chuàng)傷性、安全、靈敏度高、無(wú)需添置大 型檢測(cè)設(shè)備，使用成本低的新生兒篩查試劑盒。該試劑盒實(shí)驗(yàn)機(jī)理是采用三氯醋酸(TCA) 從濾紙干血片中萃取苯丙氨酸。苯丙氨酸被苯丙氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化成苯丙酮酸。這個(gè)反應(yīng)伴 隨著反應(yīng)混合物中存在的輔酶NAD+減少，生成NADH，這個(gè)氧化還原反應(yīng)中把添加的黃色四 唑鹽轉(zhuǎn)化成黃色物質(zhì)Formazane。Formazane的量與樣本中苯丙氨酸的量成正比。使用酶 標(biāo)儀檢測(cè)其光密度值，即可換算成其對(duì)應(yīng)的苯丙氨酸濃度值，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)使用450nm。另外 該試劑盒的成本只是進(jìn)口試劑盒的四分之三。能夠促進(jìn)我國(guó)新生兒苯丙酮尿癥篩查項(xiàng)目的 大規(guī)模開(kāi)展。讓每個(gè)新生兒都能接受檢查。減少?lài)?guó)家和社會(huì)的壓力，為提高全民人口素質(zhì) 做出我們的貢獻(xiàn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案為一種用于檢測(cè)新生兒血中苯丙氨酸濃度的酶定量法檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒由酶稀釋液(Triton X-100緩沖液)、底物 (四唑鹽)、中和液(碳酸鹽緩沖液)、三氯醋酸溶液、酶、輔酶、96孔微孔板、標(biāo)準(zhǔn)血片、質(zhì)控 血片、蓋膜組成。所述酶稀釋液包括=Triton X-100、三乙醇胺、碳酸鈉、無(wú)水碳酸氫鈉，其配制方 法UTriton X-100溶液用加樣器吸取Triton X-IOO若干加入少量0. IM碳酸緩沖
液溶解，用0. IM碳酸緩沖液定溶。2 8°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、三乙醇胺溶液用加樣器取三乙醇胺液若干加0. IM碳酸緩沖液。定溶。3、按規(guī)程向試劑瓶中加三乙醇胺溶液，再向瓶?jī)?nèi)等量加入TritonX-IOO溶液，混 勻，將配制好的酶稀釋液瓶蓋擰死，放入2 8°C冰箱保存?zhèn)溆?，可保?8個(gè)月。所述底物液其配制方法為1、取四唑鹽純品。按規(guī)程向瓶?jī)?nèi)加入雙蒸水若干，充分溶解待用；2、取出配制好的溶液若干再按規(guī)程加入雙蒸水若干，混勻，分裝，擰緊瓶蓋后放入 2 8°C冰箱備用，可保存18個(gè)月。溶解后剩余的四唑鹽溶液放入-20°C保存。i·劑的配,刪去麵脅干，應(yīng)■口口口胡
龍底i刪·丨屮,禾口鮮Ph·+禾咖謝Φ越 一·酬秘450nm T傭·，刪銷(xiāo)荊·碰，蔽鮮碰H M^T _卜 舶側(cè)570nm白句艦P議限。此_救卜千_示驗(yàn)終。所述的中和液其配制方法1、用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取碳酸鈉若干，無(wú)水碳酸氫鈉若干；加少量雙蒸水溶解后定 溶，ρΗΙΟ. 6。獲得0. IM碳酸緩沖液；2、用量筒量取0. IM碳酸緩沖液若干毫升，用0. IM氫氧化鈉將pH調(diào)至11.7，按照 規(guī)定進(jìn)行中和液分裝，擰緊瓶蓋放入2 8°C，可保存18個(gè)月。所述的三氯醋酸溶液配制方法用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取三氯醋酸若干，一定量雙蒸水溶解后，定溶于1000ml。按照規(guī) 定量進(jìn)行三氯醋酸溶液的分裝，擰緊瓶蓋放入2 8°C冰箱，可保存18個(gè)月。所述酶(苯丙氨酸脫氫酶)配制方法1)將球形芽孢桿菌的pdh基因克隆到大腸桿菌pET系統(tǒng)并進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)活性藍(lán) 4純化獲得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)液體。2)取50ml燒杯一只，將瓶?jī)?nèi)的苯丙氨酸脫氫酶液全部轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)。向原瓶?jī)?nèi) 加入25mMPB若干，將瓶子輕輕旋轉(zhuǎn)后將瓶?jī)?nèi)液體盡量吸出，轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，重復(fù)以上程序3 次，最后將瓶?jī)?nèi)液體吸干凈。3)向燒杯內(nèi)再加入25mM PB若干，輕輕搖勻，避免泡沫。4)取清洗干凈的2ml玻璃瓶，用移液器向每只瓶?jī)?nèi)加苯丙氨酸脫氫酶溶液0.5ml， 放入冷凍干燥機(jī)預(yù)凍(-40 -45°C ) 2小時(shí)后冷凍干燥24小時(shí)。干燥后放_(tái)20°C儲(chǔ)存可保 存18個(gè)月。該試劑的配制方法與國(guó)外試劑不同點(diǎn)在于將球形芽孢桿菌的Pdh基因克隆到大 腸桿菌PET系統(tǒng)并進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)活性藍(lán)4純化獲得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脫氫 酶(PheDH),利用冷凍真空干燥技術(shù),將L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)液體轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，從而±対是訂游丨丨偏捕其刪急對(duì)牛。M曰i碰丨丨_碰丨耐日月糊Y R限千運(yùn)細(xì)噺 牛兒篩杳試劑盒中，鑒于其基因表汰的高特異件、高靈敏度、高活件，還可以將其使用到與 少相關(guān)的其它產(chǎn)品內(nèi)。某干該酶開(kāi)發(fā)的試劑的摶術(shù)指標(biāo)目前汰到國(guó)外先講水平。所述輔酶凍干粉，包括輔酶NAD+和心肌黃酶，其配制方法輔酶NAD+的稀釋方法1)輔酶NAD+純品若干。向瓶?jī)?nèi)加入25mM PB 1ml，濃度為10g/ml，待充分溶解。2)取200ml燒杯一只，先將瓶?jī)?nèi)的輔酶NAD+盡量吸出到燒杯內(nèi)。向原瓶?jī)?nèi)加25mM PBlml，將瓶子輕輕旋轉(zhuǎn)后將瓶?jī)?nèi)液體盡量吸出到燒杯內(nèi)，重復(fù)以上程序3次，最后將瓶?jī)?nèi) 液體吸干凈。3)向燒杯內(nèi)再加入25mM PB若干，搖勻，避免泡沫。放入2 8°C冰箱備用。心肌黃酶的稀釋1)心肌黃酶純品若干。向瓶?jī)?nèi)加入25mM PB 1ml，濃度為100IU/ml，待充分溶解。2)取出溶解液若干轉(zhuǎn)移到200ml燒杯中，再加入25mM PB若干，混勻，放入2 8°C 冰箱備用。輔酶凍干粉配制取清洗干凈的2ml玻璃瓶若干，用移液器先向每只瓶?jī)?nèi)加輔酶NAD+溶液250ul，再 向瓶?jī)?nèi)加入心肌黃酶250ul，將全部分裝好的玻璃瓶放入冷凍干燥機(jī)預(yù)凍(-40 -45°C )2 小時(shí)后冷凍干燥24小時(shí)。干燥后放_(tái)20°C可保存18個(gè)月。式齊I丨的配,泡丨方法與國(guó)夕卜i式齊I丨不同點(diǎn)在于禾U用7令凍真空干'燥技術(shù)，將輔 (Nad+) mt^m^-km^,從而大大提高了i式齊ι丨盒的有效其月及穩(wěn)定個(gè)牛。所述的標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控血片制備方法1、將全血用4 8層紗布過(guò)濾，然后離心3000轉(zhuǎn)20分鐘，棄取血漿；2、再用生理鹽水洗3次，3000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄取上清，最后一次離心4000轉(zhuǎn)30 分鐘；3、將血球倒入量筒內(nèi)量一下體積，記下毫升數(shù)；4、用一定濃度的牛血清白蛋白與血球混合調(diào)好比例，混勻，測(cè)血球壓積，(血球壓 積55-65%為宜)可進(jìn)行下一步工作；5、分別不同濃度的將配制好TSH標(biāo)準(zhǔn)液與血球混勻，在分析天平上稱(chēng)取血球重量 并平均分配到標(biāo)記好的試管中，待滴定；6、60g/LBSA 配制檸檬酸鈉若干濃鹽酸若干牛血清白蛋白若干生理鹽水定容若干7、血片滴定1)將配制混勻好的血滴制在903#濾紙上(每個(gè)血斑50ul左右為宜)2)室溫晾干48小時(shí)3)將晾干的血片收在鋁箔袋內(nèi)，放干燥劑，-18 -20°C保存苯丙氨酸測(cè)定
1.檢測(cè)前所有的試劑、樣本和微孔板條達(dá)到室溫(18 25°C )；2.配制酶和輔酶儲(chǔ)存液分別向酶和輔酶凍干粉瓶?jī)?nèi)加雙蒸水0.5ml，輕搖，避免產(chǎn)生泡沫，稀釋后可在 2 8°C儲(chǔ)存2天。3.配制酶和輔酶應(yīng)用液另取2只干凈的燒杯，分別加入酶和輔酶儲(chǔ)存液0. 5ml，再各加入酶稀釋液5ml，在 18 25°C可保持穩(wěn)定8小時(shí)。在2 8°C不能延長(zhǎng)穩(wěn)定性。4.用打孔器打下直徑3mm標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、樣本血斑放入96微孔板相應(yīng)微孔中；5.每孔加150 μ 1三氯醋酸溶液，室溫振蕩(300 500U/分)60分鐘；6.力Π 50 μ 1的中和液到另一塊新的微孔板孔中；7.吸取130 μ 1的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、樣本萃取液到另一微孔板相應(yīng)的微孔中，輕微 振蕩；8.力卩50 μ 1的酶應(yīng)用液到每個(gè)孔中；9.力卩50 μ 1的輔酶應(yīng)用液到每個(gè)孔中；10.在室溫(18 25°C )下振蕩溫育60分鐘(300轉(zhuǎn)/分)；11.每孔加ΙΟΟμΙ底物，混勻，在3 5分鐘內(nèi)讀取OD值，酶標(biāo)儀使用波長(zhǎng) 450nm(參考波長(zhǎng) 640nm)。12.結(jié)果計(jì)算a)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值和與其相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。OD值 為縱軸或Y軸，濃度為橫軸或χ軸。b)定質(zhì)控品和每個(gè)樣品的苯丙氨酸濃度值首先在Y軸上查找OD值，橫向延伸至 標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)曲線上的點(diǎn)拉垂直線與X軸相交，得出苯丙氨酸濃度值，判斷結(jié)果。c)計(jì)算公式Y(jié) = aX+bd)單位轉(zhuǎn)換:lmg/dl = 60. 6 μ mol/L產(chǎn)品性能指標(biāo)1.劑量-反應(yīng)曲線的線性范圍1. 1 17. 3mg/dl2.批內(nèi)精密度不大于10%3.批間精密度不大于15%4.準(zhǔn)確性回收率為85% 119%5.靈敏度最低可檢出限小于1.55mg/dl6.特異性與酪氨酸、組氨酸和甘氨酸無(wú)交叉反應(yīng)注意事項(xiàng)1、不同批號(hào)的試劑不能混用；2、本產(chǎn)品為一次性使用產(chǎn)品；3、超出有效期的試劑不可再用；4、所有的試劑和樣本在使用前要達(dá)到室溫(18 26°C )；5、當(dāng)從標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品上打孔時(shí)，注意從低濃度到高濃度。6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束所有物品，采用高溫、過(guò)氧乙酸或84液等浸泡處理(生物制品應(yīng)視為 有潛在危害性)。
7、試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控品的濃度如有改變，將隨試劑盒送通知單同時(shí)電話告知。8、試劑盒于2 8 °C、避光、干燥貯存，不得凍存。說(shuō)明書(shū)


1、圖1 整體試劑盒外觀圖；2、圖2:試劑盒俯視圖；3、圖3-圖8 試劑溶液承載瓶；4、圖9-圖10 檢測(cè)用微孔板；5、圖11:標(biāo)準(zhǔn)血片。
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權(quán)利要求
一種用于檢測(cè)新生兒血中苯丙氨酸濃度的酶定量法篩查試劑盒，其特征在于所述試劑盒由酶稀釋液(Triton X 100緩沖液)、底物(四唑鹽)、中和液(碳酸鹽緩沖液)、酶、輔酶、96孔微孔板、標(biāo)準(zhǔn)血片、質(zhì)控血片、蓋膜組成。
2.如權(quán)利要求1所述的苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述酶稀 釋液包括=Triton X-100、三乙醇胺、碳酸鈉、無(wú)水碳酸氫鈉配制方法(1)TritonX-100溶液用加樣器吸取Triton X_100若干加入少量0. IM碳酸緩沖液 溶解，用0. IM碳酸緩沖液定溶。2 8°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2)三乙醇胺溶液用加樣器取三乙醇胺液若干加0.IM碳酸緩沖液。定溶。(3)按規(guī)程向試劑瓶中加三乙醇胺溶液，再向瓶?jī)?nèi)等量加入TritonX-100溶液，混勻， 將配制好的酶稀釋液瓶蓋擰死，放入2 8°C冰箱保存?zhèn)溆?，可保?8個(gè)月。
3.如權(quán)利要求2所述苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述底物配 制方法(1)取四唑鹽純品。按規(guī)程向瓶?jī)?nèi)加入雙蒸水若干，充分溶解待用；(2)取出配制好的溶液若干再按規(guī)程加入雙蒸水若干，混勻，分裝，擰緊瓶蓋后放入 2 8°C冰箱備用，可保存18個(gè)月。溶解后剩余的四唑鹽溶液放入-20°C保存。謝式_概丨碰讓誠(chéng)〒，應(yīng)屯口口口胡雙·傭·丨丨體 底i利ffl·丨屮,禾口鮮Ph· +禾咖謝Φ越內(nèi)勿 胃編賬450nmT傭·，刪刊斤棚_示仏蔽_捕她械 試劑必須使用570nm的濾光片的局限。此項(xiàng)技術(shù)處于國(guó)際領(lǐng)先水平。
4.如權(quán)利要求3所述苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述中和液， 配制方法為(1)、用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取碳酸鈉若干，無(wú)水碳酸氫鈉若干；加少量雙蒸水溶解后定溶， PH 10. 6。獲得0. IM碳酸緩沖液；(2)、用量筒量取0.IM碳酸緩沖液若干毫升，用0. IM氫氧化鈉將pH調(diào)至11.7，按照規(guī) 定進(jìn)行中和液分裝，擰緊瓶蓋放入2 8°C，可保存18個(gè)月。
5.如權(quán)利要求4所述苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述三氯醋 酸溶液，其配制方法為用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取三氯醋酸若干，一定量雙蒸水溶解后，定容于1000ml。按照規(guī)定量 進(jìn)行三氯醋酸溶液的分裝，擰緊瓶蓋放入2 8°C冰箱可保存18個(gè)月。
6.如權(quán)利要求5所述苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述酶(苯 丙氨酸脫氫酶)的配制方法為(1)將球形芽孢桿菌的Pdh基因克隆到大腸桿菌pET系統(tǒng)并進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)活性藍(lán)4純 化獲得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)液體。(2)取50ml燒杯一只，將瓶?jī)?nèi)的苯丙氨酸脫氫酶液全部轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)。向原瓶?jī)?nèi)加入 25mM PB若干，將瓶子輕輕旋轉(zhuǎn)后將瓶?jī)?nèi)液體盡量吸出，轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，重復(fù)以上程序3次， 最后將瓶?jī)?nèi)液體吸干凈。(3)向燒杯內(nèi)再加入25mMPB若干，輕輕搖勻，避免泡沫。(4)取清洗干凈的2ml玻璃瓶，用移液器向每只瓶?jī)?nèi)加苯丙氨酸脫氫酶溶液0.5ml，放 入冷凍干燥機(jī)預(yù)凍(-40 -45°C ) 2小時(shí)后冷凍干燥24小時(shí)。干燥后放_(tái)20°C儲(chǔ)存可保存18個(gè)月。謝式_·吿丨碰麵脅〒滅干麵Ddh··至籠_DET碰 并講行表汰，誦i寸活t牛#4鈍化獲得高比活t牛禾Π高得率的L-苯丙Mif脫梟』_ (PheDH)^lIffl 7令凍直苧干'燥摶術(shù)，將L-苯丙Mif脫梟』_ (PheDH)液體轉(zhuǎn)奪為固體，從而大大提高了i式布丨 偏捕其刪急對(duì)牛?！鲈籭碰丨丨_碰丨耐日月糊Y R限千運(yùn)用至耐唸 Φ，軒縣__■亂鮮·、碰性，還適減■至丨丨故 口口口力。軒獻(xiàn)_夕卜餅級(jí)
7.如權(quán)利要求6所述苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述輔酶凍 干粉，包括輔酶NAD+和心肌黃酶的制備方法為輔酶NAD+的稀釋方法1)輔酶NAD+純品若干。向瓶?jī)?nèi)加入25mMPB 1ml，濃度為10g/ml，待充分溶解。2)取200ml燒杯一只，先將瓶?jī)?nèi)的輔酶NAD+盡量吸出到燒杯內(nèi)。向原瓶?jī)?nèi)加25mM PBlml，將瓶子輕輕旋轉(zhuǎn)后將瓶?jī)?nèi)液體盡量吸出到燒杯內(nèi)，重復(fù)以上程序3次，最后將瓶?jī)?nèi) 液體吸干凈。3)向燒杯內(nèi)再加入25mMPB若干，搖勻，避免泡沫。放入2 8°C冰箱備用。心肌黃酶的稀釋1)心肌黃酶純品若干。向瓶?jī)?nèi)加入25mMPB 1ml，濃度為100IU/ml，待充分溶解。2)取出溶解液若干轉(zhuǎn)移到200ml燒杯中，再加入25mMPB若干，混勻，放入2 8°C冰 箱備用。輔酶凍干粉配制取清洗干凈的2ml玻璃瓶若干，用移液器先向每只瓶?jī)?nèi)加輔酶NAD+溶液250ul，再向瓶 內(nèi)加入心肌黃酶250ul，將全部分裝好的玻璃瓶放入冷凍干燥機(jī)預(yù)凍(-40 -45°C )2小時(shí) 后冷凍干燥24小時(shí)。干燥后放_(tái)20°C可保存18個(gè)月。式齊I丨的配,泡丨方法與國(guó)夕卜i式齊Il不同點(diǎn)在于利用7令凍真空干'燥技術(shù),將輔 (NAD+)由 液杰轉(zhuǎn)變?yōu)楣探?。從而大大提高了試劑盒的有效期及穩(wěn)牛。
8.如權(quán)利要求7所述苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述所述的 標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控血片制備方法1)將全血用4 8層紗布過(guò)濾，然后離心3000轉(zhuǎn)20分鐘，棄取血漿；2)再用生理鹽水洗3次，3000轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄取上清，最后一次離心4000轉(zhuǎn)30分鐘；3)將血球倒入量筒內(nèi)量一下體積，記下毫升數(shù)；4)用一定濃度的牛血清白蛋白與血球混合調(diào)好比例，混勻，測(cè)血球壓積，(血球壓積 55-65%為宜)可進(jìn)行下一步工作；5)分別不同濃度的將配制好TSH標(biāo)準(zhǔn)液與血球混勻，在分析天平上稱(chēng)取血球重量并平 均分配到標(biāo)記好的試管中，待滴定；6)60g/L BSA 配制檸檬酸鈉若干濃鹽酸若干牛血清白蛋白若干生理鹽水定容若干 7)血片滴定(1)將配制混勻好的血滴制在903#濾紙上(每個(gè)血斑50ul左右為宜)(2)室溫晾干48小時(shí)(3)將晾干的血片收在鋁箔袋內(nèi)，放干燥劑，-18 -20°C保存
9.如權(quán)利要求1所述的苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于所述使用 方法包括以下步驟 苯丙氨酸測(cè)定，1、檢測(cè)前所有的試劑、樣本和微孔板條達(dá)到室溫(18 25°C)；，2、配制酶和輔酶儲(chǔ)存液分別向酶和輔酶凍干粉瓶?jī)?nèi)加雙蒸水0. 5ml，輕搖，避免產(chǎn)生泡沫，稀釋后可在2°C 8°C儲(chǔ)存2天。，3、配制酶和輔酶應(yīng)用液另取2只干凈的燒杯，分別加入酶和輔酶儲(chǔ)存液0. 5ml,再各加入酶稀釋液5ml，在 18°C 25°C可保持穩(wěn)定8小時(shí)，在2°C 8°C不能延長(zhǎng)穩(wěn)定性。(若做1/2板，取0. 25ml儲(chǔ) 存液加酶稀釋液2. 5ml)。，4、用打孔器打下直徑3mm標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、樣本血斑放入96微孔板相應(yīng)微孔中；，5、每孔加150μ 1三氯醋酸溶液，室溫振蕩(300 500轉(zhuǎn)/分)60分鐘；，6、加50μ 1的中和液到另一塊新的微孔板孔中；，7、吸取130μ1的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、樣本萃取液到另一微孔板相應(yīng)的微孔中，輕微振蕩；，8、加50μ 1的酶應(yīng)用液到每個(gè)孔中；，9、加50μ 1的輔酶應(yīng)用液到每個(gè)孔中；，10、在室溫(18°C 25°C)下振蕩溫育60分鐘(300轉(zhuǎn)/分)；，11、每孔加100μ 1底物，混勻，在3 5分鐘內(nèi)讀取OD值，酶標(biāo)儀使用波長(zhǎng)450nm(參 考波長(zhǎng)640nm)。，12、結(jié)果計(jì)算酶標(biāo)儀附帶軟件自動(dòng)計(jì)算樣品濃度值?；虬凑障旅娣椒ㄊ止び?jì)算a)坐標(biāo)紙上以標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值和與其相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。OD值為縱 軸或Y軸，濃度為橫軸或X軸。b)確定質(zhì)控品和每個(gè)樣品的苯丙氨酸濃度值首先在Y軸上查找OD值，橫向延伸至標(biāo) 準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)曲線上的點(diǎn)拉垂直線與X軸相交，得出苯丙氨酸濃度值，判斷結(jié)果。c)計(jì)算公式Y(jié)= aX+bd)單位轉(zhuǎn)換:lmg/dl= 60. 6 μ mol/L，13、產(chǎn)品性能指標(biāo)(1)試劑盒外觀整潔，文字符號(hào)標(biāo)識(shí)清晰(2)血制品經(jīng)檢測(cè)HIV、HbsAg,HCV、梅毒抗體陰性(3)劑量-反應(yīng)曲線的線性范圍1.lmg/dl 17. 3mg/dl (不同批次有一定誤差)，劑 量_反應(yīng)曲線經(jīng)數(shù)學(xué)公式Y(jié) = aX+b擬合，其相關(guān)系數(shù)R值應(yīng)不低于0. 99。(4)批內(nèi)精密度不大于10%(5)批間精密度不大于15%(6)準(zhǔn)確性回收率為85% 119%(7)靈敏度最低可檢出限小于1.55mg/dl(8)特異性與酪氨酸、組氨酸和甘氨酸無(wú)交叉反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于苯丙氨酸脫氫酶檢測(cè)新生兒苯丙酮尿癥的篩查試劑，該發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域生物、醫(yī)藥和醫(yī)療器械。本發(fā)明的目的1、新生兒苯丙酮尿癥篩查的酶定量法檢測(cè)試劑盒，克服細(xì)菌抑制法半定量、熒光法試劑易受自然物質(zhì)中熒光素干擾缺點(diǎn)。2、創(chuàng)新技術(shù)a、利用冷凍真空干燥技術(shù)將L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)從而提高了試劑盒的有效期。該項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)達(dá)到國(guó)外先進(jìn)水平。b、利用冷凍真空干燥技術(shù)，將輔酶(NAD+)由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，從而大大提高了試劑盒的穩(wěn)定性。c、利用波長(zhǎng)450nm下進(jìn)行讀數(shù)，適用于所有的酶標(biāo)儀，改變了國(guó)外進(jìn)口試劑必須使用570nm的濾光片的局限。此項(xiàng)技術(shù)處于國(guó)際領(lǐng)先水平。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK101892290SQ20091014286
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者王曉華 申請(qǐng)人:北京協(xié)和洛克生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心