Ace抑制十肽的苯丙氨酸甲基化衍生物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是設(shè)及利用甲基化技術(shù)對提取自酪蛋白的 ACE抑制十膚YQKFPQYLQY進行修飾，從而提高該多膚的穩(wěn)定性。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代社會發(fā)展的不斷進步，生活節(jié)奏的不斷加快，生活方式也隨之發(fā)生了很 大變化，高脂高糖高鹽食物的攝入越來越多，運動量卻逐漸減少，運種不良的生活方式導(dǎo)致 高血壓患病率逐年增加，且呈現(xiàn)一定的年輕化趨勢。
[0003] 高血壓有原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓兩種類型。原發(fā)性高血壓患者占總高血壓 患者的95% W上，由原發(fā)性高血壓所引起的腦卒中、冠屯、病等，在總患病率和總死亡率中所 占的比例日益增高。高血壓發(fā)病期間，人們往往會服用一些輔助性降壓藥，目前，常用的降 壓藥主要有受體阻滯劑、利尿降壓藥、巧通道阻滯劑（CCB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑 (ACEI)和血管緊張素 Π 受體括抗劑(ARB)等。運些降壓藥物在一定程度上確實起到了降壓 的作用，但同時也會給服藥者帶來很大的毒副作用。例如利尿降壓藥可能會造成患者血糖、 血膽固醇、血尿酸和甘油Ξ醋升高及血清鐘降低等危害。β-受體阻滯劑會引起眩暈、疲急、 嗜睡、胃腸素亂(惡屯、、腹瀉）等，還可W引起嚴重的屯、動過緩、誘發(fā)急性屯、力衰竭或支氣管 哮喘、四肢冷厥及雷諾現(xiàn)象等。
[0004] 人們發(fā)現(xiàn)通過水解某些食品蛋白質(zhì)可W得到具有降壓效果的多膚，運種來源于天 然食品的ACE(angiotensin convening enzyme)抑制膚具有更高的安全性，而且對正常血 壓無降壓作用，因此成為了目前預(yù)防和治療高血壓最具開發(fā)價值的產(chǎn)品之一。
[0005] 在食源性生物活性膚中，又W乳源生物活性膚作用顯著。它是指與乳中某些蛋白 質(zhì)膚鏈的某些片段相同或相似，在乳中固有的或在乳蛋白降解過程中產(chǎn)生的具有生物活性 的膚類。隨著不同功能的乳源性活性膚的發(fā)現(xiàn)，對乳蛋白質(zhì)的研究已成為生理學(xué)界和營養(yǎng) 學(xué)界的研究熱點。
[0006] 酪蛋白（casein)是乳中含量最豐富的蛋白質(zhì)，在其大分子中含有多種具有生物活 性的小分子片段，在不同蛋白酶的作用下，可釋放出具有不同功能的分子片段，ACE抑制膚 就是其中的一種。近年來國內(nèi)外研究結(jié)果表明，當(dāng)乳中酪蛋白在生物體內(nèi)或食品加工過程 中用酶消化時，可W產(chǎn)生大量ACE抑制膚，運些ACE抑制膚具有無副作用、安全性高和易吸收 等優(yōu)點。
[0007] 本課題組前期通過對酪蛋白進行胃蛋白酶及膜蛋白酶水解，從水解產(chǎn)物中分離純 化得到具有ACE抑制活性的片段，并對其進行測序，得到的ACE抑制膚序列為YQKFPQ化QY。 (具體過程參看專利CN 103275176 A)
[000引N-甲基-α-氨基酸是很多具有生物活性生物天然產(chǎn)物的重要組成部分。對α-氨基 酸的Ν-甲基化修飾會影響多膚與受體的相互作用，和沒經(jīng)過甲基化修飾的前體相比生物活 性可能會發(fā)生改變。同時，包含Ν-甲基氨基酸的多膚類似物具有更高的抗蛋白酶降解能力。 因此，Ν-甲基氨基酸常作為氨基酸和多膚衍生物構(gòu)象研究的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有傳統(tǒng)方案方法上存在的不足，提供一種更為快捷、 純度更高的ACE抑制十膚YQKFPQYLQY的苯丙氨酸甲基化衍生物及其制備方法。
[0010] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案如下：
[0011] 一種ACE抑制十膚(YQKFPQYLQY)的苯丙氨酸甲基化衍生物的制備方法，按照下述 步驟進行：
[0012] 1)稱取Ig王樹脂放入反應(yīng)器中，加入二氯甲燒溶脹半小時，然后抽掉二氯甲燒，加 入序列中第一個氨基酸當(dāng)量的L型酪氨酸，Immol的N，N-二異丙基碳二亞胺；Immol的 4-二甲氨基化晚，加入6-lOml的富馬酸二甲脂溶液，用氮氣鼓泡反應(yīng)化;然后加入1ml化晚， 1ml乙酸酢，反應(yīng)半小時，抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酯胺、二氯甲燒洗凈；
[0013] 2)加入6-lOml贓晚去除9-巧甲氧幾基保護基，洗凈，巧Ξ酬檢測；
[0014] 3)向反應(yīng)器中加入序列中第二個氨基酸Gin 3mmol，3mmol 1-徑基苯并Ξ氮挫及 N，N-二異丙基碳二亞胺，氮氣鼓泡反應(yīng)一小時，抽掉液體，用二甲基甲酯胺洗凈，巧Ξ酬檢 測；
[001引4)依步驟2、3的方式依次加入序列中氨基酸1^73、口116(16)、口1'0、61]1、了71'心11、61]1、 kTyr，直至最后心了7重反應(yīng)結(jié)束，其中第四個氨基酸為甲基化苯丙氨酸化e(Me);
[0016] 5)加6-lOml的95%Ξ氣乙酸切割液，震蕩反應(yīng)化，將氨基酸的側(cè)鏈保護基團裂解 下來，得到粗膚產(chǎn)物；
[0017] 6)分析提純和質(zhì)譜檢測：用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀檢測該序列分 子量的正確性，用高效液相色譜將粗膚提純至90%純W上；
[0018] 7)收集純化好的目標(biāo)多膚溶液放入凍干機中進行濃縮凍干，凍干成白色粉末得到 ACE抑制膚YQKFPQYLQY的苯丙氨酸甲基化衍生物。
[0019] 所述ACE抑制十膚的苯丙氨酸甲基化衍生物：其特征是，其命名為YQKF (Me ) PQYLQY，其氨基酸序列為 Tyr-Gln-Ly s-Phe (Me) -Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr。
[0020] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0021] 1.本發(fā)明是在前期研究所獲得的酪蛋白源ACE抑制十膚a2f(98-107):YQKFPQYLQY 的基礎(chǔ)上，對序列上的苯丙氨酸進行甲基化修飾得到的新的ACE抑制十膚YQKF (Me) PQYLQY。 經(jīng)體外實驗和體內(nèi)實驗證實，該多膚具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活力和降血壓功能。
[0022] 2.在ACE抑制十膚的甲基化修飾衍生物YQKF (Me) PQ化QY的制備上，不采用水解蛋 白一一純化多膚一一基團修飾運一傳統(tǒng)技術(shù)路線，而是采用固相合成技術(shù)進行化學(xué)合成， 其中賴氨酸先甲基化修飾，而后再連接到多膚序列上。
[0023] 3.本發(fā)明的活性多膚YQKF(Me)PQ化QY的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性較原 序列均有所提高。穩(wěn)定性的提高，使得修飾后的ACE抑制十膚在生產(chǎn)加工、膽藏、運輸和銷售 的過程中性質(zhì)更加穩(wěn)定，因而更適合開發(fā)為保健食品或藥物。同時，修飾后的ACE抑制十膚 酸堿穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性更好，使其在消化道內(nèi)更不易被人體消化酶所降解，從而能夠穩(wěn) 定發(fā)揮降血壓的作用。
[0024] 4.本發(fā)明的ACE抑制十膚的甲基化修飾衍生物YQK(Me)FPQ化QY制備方法簡單，易 于提純，純度高。
【附圖說明】
[0025] 圖1所示為ACE抑制十膚YQKFPQYLQY的ACE抑制率；
[0026] 圖2所示為ACE抑制十膚YQKFPQ化QY的苯丙氨酸甲基化修飾衍生物YQKF(Me) PQ化QY的ACE抑制率；
[0027] 圖3所示為灌胃ACE抑制十膚YQKFPQYLQY對SHR大鼠血壓的影響；
[002引圖4所示為灌胃ACE抑制十膚YQKFPQYLQY對Wistar大鼠血壓的影響；
[0029] 圖5所示為灌胃ACE抑制十膚YQKFPQ化QY的苯丙氨酸甲基化修飾衍生物YQKF(Me) PQYLQY對SHR大鼠血壓的影響；
[0030] 圖6所示為灌胃ACE抑制十膚YQKFPQ化QY的苯丙氨酸甲基化修飾衍生物YQKF(Me) PQYLQY對Wistar大鼠血壓的影響；
[0031 ]圖7所示為ACE抑制十膚YQKFPQYLQY的熱穩(wěn)定性結(jié)果；
[0032] 圖8所示為ACE抑制十膚YQKFPQ化QY的的苯丙氨酸甲基化修飾衍生物YQKF(Me) PQYLQY的熱穩(wěn)定性結(jié)果；
[0033] 圖9所示為ACE抑制十膚YQKFPQYLQY的酸堿穩(wěn)定性結(jié)果；
[0034] 圖10所示為ACE抑制十膚YQKFPQ化QY的的苯丙氨酸甲基化修飾衍生物YQKF(Me) PQYLQY的酸堿穩(wěn)定性結(jié)果；
[0035] 圖11所示為ACE抑制十膚YQKFPQYLQY模擬胃液消化穩(wěn)定性結(jié)果；
[0036] 圖12所示為ACE抑制十膚YQKFPQYLQY模擬腸液消化穩(wěn)定性結(jié)果；
[0037] 圖13所示為ACE抑制十膚YQKFPQ化QY的的苯丙氨酸甲基化修飾衍生物YQKF(Me) PQYLQY的模擬胃液消化穩(wěn)定性結(jié)果；
[0038] 圖14所示為ACE抑制十膚YQKFPQ化QY的的苯丙氨酸甲基化修飾衍生物YQKF(Me) PQYLQY的模擬腸液消化穩(wěn)定性結(jié)果。
【具體實施方式】
[0039] W下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0040] 實施例1 :ACE抑制十膚YQKFPQYLQY的苯丙氨酸甲基化衍生物的制備
[0041] 1.稱取Ig王樹脂放入反應(yīng)器中，加入二氯甲燒溶脹半小時，然后抽掉二氯甲燒，加 入序列中第一個氨基酸當(dāng)量的L型酪氨酸，Immol的N，N-二異丙基碳二亞胺；Immol的 4-二甲氨基化晚，加入6-lOml的富馬酸二甲脂溶液，用氮氣鼓泡反應(yīng)化;然后加入1ml化晚， 1ml乙酸酢，反應(yīng)半小時，抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酯胺、二氯甲燒洗凈；
[0042] 2.加入6-lOml贓晚去除9-巧甲氧幾基保護基，洗凈，巧Ξ酬檢測；
[0043] 3.向反應(yīng)器中加入序列中第二個氨基酸Gin 3mmol，3mmol 1-徑基苯并Ξ氮挫及 N，N-二異丙基碳二亞胺，氮氣鼓泡反應(yīng)一小時，抽掉液體，用二甲基甲酯胺洗凈，巧Ξ酬檢 測；
[0044] 4.依步驟2、3的方式依次加入序列中第Ξ個氨基酸Lys、第四個氨基酸化e(Me)、第 五個氨基酸Pro、第六個氨基酸Gin、第屯個氨基酸Tyr、第八個氨基酸Leu、第九個氨基酸 Gin、第十個氨基酸kTyr，直至最后心了7重反應(yīng)結(jié)束，其中第四個氨基酸為甲基化苯丙氨酸 Phe(Me)；
[0045] 具體步驟為:a.加入6-lOml贓晚去除9-巧甲氧幾基保護基，洗凈，巧Ξ酬檢測；向 反應(yīng)器中加入序列中第Ξ個氨基酸:3mmol Lys，3mmol 1-徑基苯并Ξ氮挫及DIC，氮氣鼓泡 反應(yīng)一小時，抽掉液體，用DMF洗凈，巧Ξ酬檢測；
[0046] b.加入6-lOml贓晚去除9-巧甲氧幾基保護基，洗凈，印立酬檢測；向反應(yīng)器中加入 序列中第四個氨基酸:3mmol Phe(Me)，3mmol 1-徑基苯并Ξ氮挫及DIC，氮氣鼓泡反應(yīng)一小 時，抽掉液體，用DMF洗凈，巧Ξ酬檢測；
[0047] C.加入6-lOml贓晚去除9-巧甲氧幾基保護基，洗凈，印立酬檢測；向反應(yīng)器中加入 序列中第五個氨基酸:3mmol Pro,3mmol 1-徑基苯并Ξ氮挫及DIC，氮氣鼓泡反應(yīng)一小時， 抽掉液體，用DMF洗凈，巧Ξ酬檢測；
[004引 d.加入6-lOml贓晚去除9-巧甲氧幾基保護基，洗凈，巧Ξ酬檢測