人體血清中乙酰苯丙氨酸的快速檢測方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及乙酰苯丙氨酸的檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用表面增強激光拉曼 光譜檢測乙酰苯丙氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙酰苯丙氨酸在人體內(nèi)肝細(xì)胞中經(jīng)過羥化酶的作用，代謝為酪氨酸，在酶的作用 下進(jìn)一步分解為尿黑酸，尿黑酸經(jīng)過酶的作用轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸，最后經(jīng)過酶的水解作用，最 終代謝產(chǎn)物為二氧化碳和水。肝細(xì)胞發(fā)生病變后，會影響乙酰苯丙氨酸的代謝過程，因此， 通過研究人體血清中乙酰苯丙氨酸的含量變化，有助于研究肝細(xì)胞病變過程，例如，通過研 究肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸的含量變化，可以了解肝癌細(xì)胞的生長和破壞機理等。
[0003] 目前乙酰苯丙氨酸的分析技術(shù)主要有色譜、質(zhì)譜、核磁共振及液質(zhì)聯(lián)用和氣質(zhì)聯(lián) 用技術(shù)等，它們都有各自的優(yōu)勢與適用范圍。但這些設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、分析周期長，無法 滿足大批量樣品快速檢測的需求，也難以進(jìn)行普及。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種人體血清中乙酰苯丙氨酸的快速檢測方法， 具有準(zhǔn)確、快速、無損、低成本的特點，能夠滿足大批量樣品快速檢測的需求，易于普及，尤 其適用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的測定。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種人體血清中乙酰苯丙氨 酸的快速檢測方法，包括如下步驟： 51、 樣品前處理： 按體積比量取血清樣品0. 15~0. 25份，體積為m，溶于0. 45~0. 75份的提取試 劑中，混勻定容，體積為V，控溫〇°C~-4tC，經(jīng)離心機離心沉底，分層；分離得到上清液， 于-18°C~-25°C條件下冷凍一段時間，再取出控溫(TC~-4°C，用離心機再次離心沉底，分 層；將再次分離所得上清液過〇. 22 μ m~0. 45 μ m的有機系濾膜，所得濾液即為樣品待測 液； 所述提取試劑的制備方法為：按體積比量取甲醇2. 5~3. 5份、乙腈1. 5~2. 5份和 N，N-二甲基甲酰胺0.5~1.5份，混合置于容器內(nèi)，-18°C~-25°C密閉保存，用時搖勻； 52、 表面增強激光拉曼光譜檢測： 樣品待測液中依次加入表面增強試劑、無機鹽凝聚劑，再用激光拉曼光譜儀掃描，根據(jù) 1002cm iiScm 1對應(yīng)峰的強度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的乙酰苯丙氨酸含量為c(mg/L)，將 所述m、V、c按式?:計算，
得到X (mg/L)，即為血清樣品中乙酰苯丙氨酸的含量。
[0006] 進(jìn)一步地，所述步驟SI中，血清樣品與提取試劑采用渦旋混勻，-18°c~-25°c條 件下冷凍10分鐘，離心機10000轉(zhuǎn)/分鐘，每次離心3分鐘。
[0007] 進(jìn)一步地，所述步驟Sl中，所述有機系濾膜為尼龍濾膜。
[0008] 進(jìn)一步地，所述提取試劑的制備方法中，混合后液體于-18°c~-25°c保存24小 時。
[0009] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中，表面增強試劑為金納米溶膠，無機鹽凝聚劑為氯化鈉 溶液。
[0010] 進(jìn)一步地，按體積比，0. 1份待測液中依次加入0. 3份金納米溶膠、0. 1份氯化鈉 溶液。
[0011] 所述步驟S2中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為： A、 乙酰苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取乙酰苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶 中，加水定容至刻度，配制成濃度為I. 0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，根據(jù)血清樣品中的濃度范 圍進(jìn)行適當(dāng)稀釋，制成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液； B、 將制得的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中依次加入表面增強試劑、無機鹽凝聚劑，加入量與樣品待 測液的加入量相同，再分別用激光拉曼光譜儀掃描，記錄1002cm iiScm 1對應(yīng)峰的強度，將 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與其對應(yīng)峰強度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012] 本發(fā)明上述人體血清中乙酰苯丙氨酸的快速檢測方法，尤其適用于肝癌患者血清 中乙酰苯丙氨酸含量的測定。肝細(xì)胞肝癌（HCC)是最常見的腹內(nèi)惡性腫瘤之一，占原發(fā) 性肝癌（PHC)的91. 5%，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第5位和第3 位，同時它的5年生存率還不到7%。目前我國肝癌的發(fā)病人數(shù)占全球的55%，其死亡率排在 惡性腫瘤的第2位，是嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的疾病。通過研究肝癌患者血清中乙酰 苯丙氨酸的含量變化，對了解肝癌細(xì)胞的生長和破壞機理具有十分重要的意義，為肝癌細(xì) 胞的研究提供了一條新的途徑。
[0013] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于： 1)本發(fā)明提取試劑可高選擇性沉淀大分子蛋白，降低雜質(zhì)干擾，保留病變肝細(xì)胞代謝 標(biāo)志物乙醜苯丙氣酸，有效提尚目標(biāo)物提取率，提尚檢測的靈敏度。
[0014] 2)本發(fā)明選用納米增強試劑金納米溶膠和無機鹽凝聚劑氯化鈉溶液，并篩選出最 優(yōu)添加量，大大提高了檢測靈敏度。
[0015] 3)本發(fā)明確定了乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光譜特征定性波數(shù)，首次將該技術(shù)應(yīng)用 到肝癌血清中乙酰苯丙氨酸的定性定量檢測，具有準(zhǔn)確、快速、無損、低成本的特點，一個樣 品檢測時間小于15分鐘，靈敏度高，檢出限達(dá)到3. 0 mg/L，檢測成本低至2元/個樣品，檢 測方法簡單、易學(xué)，讀數(shù)直觀、方便，不需要醫(yī)學(xué)專業(yè)人員，易于普及，能夠滿足大批量樣品 快速檢測的需求，尤其適用于肝癌患者血清中乙酰苯丙氨酸含量的測定，對研究肝癌細(xì)胞 的生長和破壞機理具有十分重要的意義。
【附圖說明】
[0016] 圖1是肝癌血清中含3. 0 mg/L的乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光譜圖； 圖2是空白血樣的激光拉曼光譜圖； 圖3是實施例1中健康人體血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光譜圖； 圖4是實施例2中肝癌早期患者人體血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光譜圖； 圖5是實施例3中肝癌晚期患者人體血清中乙酰苯丙氨酸的激光拉曼光譜圖； 圖6是乙酰苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0017] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)人體血清中病變肝細(xì)胞代謝產(chǎn)物乙酰苯丙氨酸含量檢測成本 高、耗時長、準(zhǔn)確度低、操作復(fù)雜，且不能夠適應(yīng)大批量樣品快速檢測需求的問題，本發(fā)明首 次將表面增強激光拉曼光譜檢測方法應(yīng)用到人體血清中乙酰苯丙氨酸的定性、定量檢測， 通過采用專用提取試劑高效提取血清樣品中乙酰苯丙氨酸，排出其他成分對檢測的干擾， 制成樣品待測液，經(jīng)激光拉曼光譜儀掃描，記錄其1002cm 1 ± 3cm 1對應(yīng)峰的強度，能夠從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品待測液中對應(yīng)的乙酰苯丙氨酸含量，進(jìn)而能夠計算得到血清中乙酰苯 丙氨酸含量。
[0018] 下面舉例對本發(fā)明檢測方法作進(jìn)一步說明。
[0019] 1、乙酰苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取乙酰苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成濃度 為 L 0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，稀釋制成 L 0 mg/L、5. 0 mg/L、10. 0 mg/L、20. 0 mg/L、50. 0 mg/L系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0020] 2、樣品待測液制備 量取血清樣品0. 15~0. 25 mL于10 mL離心管中，按三倍體積比加入0. 45~0. 75 mL專用提取試劑，禍旋混勾1.0 min，于0°C~_4°C離心機內(nèi)離心3. Omin (10000轉(zhuǎn)/分 鐘）； 轉(zhuǎn)移上清液于2. OmL具塞試管中，置于-18°C~-25°C冰箱冷凍lOmin，取出于(TC~ -4°C離心機內(nèi)離心3. Omin (10000轉(zhuǎn)/分鐘）； 將所得上清液過〇. 22 μ m~0. 45 μ m有機相尼龍濾膜，所得濾液即為待測液。
[0021] 所用提取試劑的制備方法為：按體積比量取甲醇2. 5~3. 5mL、乙腈1. 5~2. 5mL 和N，N-二甲基甲酰胺0. 5~I. 5mL，混合置于容器內(nèi)，-18°C~-25°C密閉保存24小時， 用時搖勻。
[0022] 3、設(shè)定激光拉曼光譜儀工作條件 激光功率：200mW ; 積分時間：IOsec ; 平均次數(shù)：2 ; 平滑參數(shù)：1。
[0023] 4、定性測定 取前制的樣品待測液0.1 mL，依次加入0.3