專利名稱：提純重組體人血清清蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡易提純通過基因操作以高產(chǎn)率獲得的人血清清蛋白的方法。本發(fā)明還涉及一種含重組體人血清蛋白的組合物，該組合物顯示出極低的顯色度，這是重組體人血清清蛋白特征的重要問題。
人血清清蛋白(以下簡寫為HSA)是含在血漿中的最大量的蛋白質(zhì)。它有助于維持血液中的滲透壓，并與營養(yǎng)物和代謝物結(jié)合，從而輸送這些物質(zhì)。具有這些功能的HSA一直被用作治療因清蛋白損失或清蛋白合成減少和在出血性休克中引起的血清蛋白減少的藥物。
HSA一直主要由采集血液的分餾物生產(chǎn)。然而，由血液生產(chǎn)HSA的方法有這樣一些問題，血液的分散供應(yīng)，經(jīng)濟(jì)上的缺點(diǎn)及不希望物質(zhì)的污染，如肝炎病毒。因此，一直存在著開發(fā)一種可用來代替天然存在HSA的材料的急迫需求。
在這些環(huán)境下，隨重組體DNA技術(shù)進(jìn)層，借助基因操作大規(guī)模生產(chǎn)和提純HSA(作為起源于血液的HSA的替代物)一直被開發(fā)。
為提純由基因操作而得到的HSA(以后稱為重組體HSA，并簡寫為rHSA)，不適合應(yīng)用提純源于血漿中的HSA同樣的常規(guī)方法。這是因?yàn)橛麖膔HSA中去除的雜質(zhì)與含在源于血漿中的HSA中的雜質(zhì)全然不同。換句話說，rHSA被，比如，賦予重組體HSA特征的顯色物質(zhì)，源于宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)，多糖等污染。特別是，必須充分去除源于宿主細(xì)胞中的組分，因?yàn)樗鼈儗τ诨畹纳?，包括人類，是外來物質(zhì)，因此可引起抗原性的問題。
因此，一直進(jìn)行著各種研究，以便通過培養(yǎng)將源于宿主細(xì)胞及培養(yǎng)組分中的組分所產(chǎn)生的rHSA分離和提純到足夠的程度。以這樣一種工藝作為常規(guī)工藝的一種例證，它包括使含rHSA的酵母培養(yǎng)基受壓制→超濾性膜處理→加熱→超濾性膜處理，然后用如采用陽離子交換劑和陰離子交換劑的色譜法和疏水色譜法的工藝處理[JP-A-5-317079(相當(dāng)于EP-A-570916)(本文所用術(shù)語“JP-A”是指未審查的日本專利申請)，Biotechnology of Blood Proteins，，1993，227，293-298]。此外，有上述工藝接著螯合樹脂或硼酸/硼酸鹽處理方法的報(bào)道(EP-A-570916，JP-A-6-245789(相當(dāng)于EP-A-612761))。
在上述常規(guī)方法中，主要的是要求進(jìn)行包括上述的一些步驟的提純，借此消除源于宿主細(xì)胞中的抗原，并達(dá)到高的純度。另一方面，這種工藝有這樣一些缺點(diǎn)，rHSA的產(chǎn)率下降，以及由于大量的步驟而拖長了處理時(shí)期。雖然一直努力提高每個(gè)步驟的產(chǎn)率，以便改善rHSA的產(chǎn)率，但似乎在產(chǎn)率上未作出進(jìn)一步的改進(jìn)，這樣rHSA的產(chǎn)率已達(dá)到了上限。此外，上述的常規(guī)工藝還有另外的難題在一開放系統(tǒng)中進(jìn)行壓制，這樣就有被污染的風(fēng)險(xiǎn)。即，衛(wèi)生學(xué)上的控制，這在作為藥物生產(chǎn)rHSA是極重要的，這是極困難的。此外，rHSA的顯色程度最低只可降到約0.015的A350/A280之比(在含250mg/ml，rHSA的溶液情況下)(JP-A-7-170993和JP-A-7-170994(相當(dāng)于EP-A-658569))。
另一方面，一直在開發(fā)從粗培養(yǎng)基中直接回收目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，該法在培育完成后不進(jìn)行任何的諸如消除細(xì)胞或濃縮培養(yǎng)基的預(yù)處理(如，Pharmacia開發(fā)的，采用擴(kuò)張床吸附技術(shù)的Streamline法，International Publication in Japan No.6-500050)(相當(dāng)于EP-A-538467))。
直到目前未見關(guān)于將上述擴(kuò)張床吸附技術(shù)用于提純r(jià)HSA，特別是從酵母培養(yǎng)基中回收和提純r(jià)HSA的情況的報(bào)道。因此仍不知道這類方法對rHSA提純的合理地處理及對其產(chǎn)率的改進(jìn)是否實(shí)際上是有效的。然而，期待著將這種方法或與其類似的方法用于提純r(jià)HSA將有助于簡化包括若干步驟的常規(guī)提純處理。
然而，產(chǎn)生了一個(gè)問題，為使用上述方法在通過Streamline柱吸附(吸附劑Streamline SP)采用的酸性條件下，該培養(yǎng)基中所含的rHSA被含在該培養(yǎng)基中的蛋白酶迅速降解，從而使rHSA的產(chǎn)率嚴(yán)重下降。因此，就應(yīng)用上述擴(kuò)張床吸附技術(shù)來提純r(jià)HSA而言是困難的。
因此，急需開發(fā)這樣一種工藝，用它可在穩(wěn)態(tài)下高產(chǎn)率提純r(jià)HSA而無損于擴(kuò)張床吸附技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)(如提純工藝的簡化和合理化等)。
本發(fā)明的目的是提供在短時(shí)間內(nèi)將重組體HSA提純到一個(gè)高純度水平和卓越的質(zhì)量水平的簡單方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種rHSA，從其中充分地消除了源于宿主、培養(yǎng)基等的基因操作特征的顯色物質(zhì)，并提供一種含所得rHSA的組合物。
為解決上述難題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)通過直接加熱其中仍保留宿主細(xì)胞的HSA生產(chǎn)系統(tǒng)的培養(yǎng)基可簡單而有效地使蛋白酶失話?；谶@一發(fā)現(xiàn)，他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將此加過熱的溶液直接與懸浮在流化床中吸附劑顆粒接觸而不去除該細(xì)胞時(shí)，可以高產(chǎn)率提純r(jià)HSA。而且，他們發(fā)現(xiàn)，上述加熱處理與吸附劑顆粒處理結(jié)合就有可能將常規(guī)的提純r(jià)HSA的工藝步驟從5個(gè)(即壓制-超濾性膜處理-加熱-超濾膜處理一陽離子交換劑處理)減到2個(gè)(加熱-吸附劑顆粒處理)，從而大大地縮短了提純時(shí)間，而同時(shí)又提高了產(chǎn)率。
此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，他們的工藝使獲得rHSA成為可能，這種rHSA基本上不含任何源于宿主細(xì)胞的雜質(zhì)，而且與用常規(guī)工藝所得的rHSA相比，顯示出大為降低的顯色程度。
因此，本發(fā)明所涉及的是一種提純r(jià)HSA的工藝，它包括加熱含rHSA及產(chǎn)生rHSA的宿主的培養(yǎng)基，將此加過熱的溶液與懸浮于流化床中的吸附劑顆粒相接觸，然后回收被吸附的部分。更具體地說，本發(fā)明涉及一種提純r(jià)HSA的工藝，它包括加熱含rHSA和產(chǎn)生rHSA的宿主的培養(yǎng)基，將此加了熱的溶液向上供入其中懸浮著吸附劑顆粒的流化床中，以便此加過熱的溶液與該吸附顆粒接觸，然后倒換流向并朝下輸入緩沖液以洗脫和回收被吸附劑顆粒吸附的rHSA。
本發(fā)明還涉及一種提純工藝，其中產(chǎn)生rHSA的宿主的培養(yǎng)基經(jīng)1分鐘至10小時(shí)被加熱到50-100℃的溫度，一種提純r(jià)HSA的工藝，其中被加熱的溶液在0.1-50ms的導(dǎo)電性氣氛中，PH值約3-5，同吸附劑顆粒相，以及一種提純r(jià)HSA的工藝，其中吸附劑顆粒是那些有強(qiáng)的陽離子交換基團(tuán)的吸附劑顆粒。
本發(fā)明還涉及一種提純r(jià)HSA的工藝，其中，含rHSA的已吸附部分(它是按上述的提純工藝從流化床中回收的)經(jīng)受至少一種選自由疏水色譜法、陰離子交換劑處理、螯合樹脂處理、硼酸/硼酸鹽處理及超濾性膜處理構(gòu)成的方法組中的提純處理，最好是在還原劑存在下加熱后進(jìn)行。
本發(fā)明進(jìn)而還涉及一種含重組體人血清清蛋白的組合物，當(dāng)配成25％清蛋白溶液(即rHSA濃度250mg/ml)時(shí)它顯示出低于0.015的A350/A280之比。


圖1是顯示加熱處理對rHSA培養(yǎng)基穩(wěn)定性影響的圖。
圖2是顯示在加過熱的溶液與吸附劑顆粒相接觸的氣氛下的導(dǎo)電性與結(jié)合到吸附劑顆粒的rHSA的性能之間的關(guān)系曲線圖。
圖3是流程圖，它顯示了用streamlineSP從培養(yǎng)基(含酵母細(xì)胞)中提純r(jià)HSA的最優(yōu)流程。
圖4顯示了Streamline SP洗脫物的凝膠過濾HPLC分布圖，它包括加熱步驟(加熱→吸附劑顆粒)處理[a]和無加熱步驟(無加熱→吸附劑顆粒)處理[(b)]。(吸光度于280nm測得)。
圖5顯示通過監(jiān)測每個(gè)步驟的rHSA的顯色程度(A350/A280)的變化比較常規(guī)工藝和本發(fā)明工藝。
圖6是以本發(fā)明工藝所得的rHSA與以常規(guī)工藝所得的rHSA的吸附譜的比較。
圖7是顯示用本發(fā)明的方法所得的rHSA的GPC-HPLC分析結(jié)果的色譜(吸光度于280nm測得)。
在這些圖中，各符號(hào)含意如下A參照組。
B68℃，30分鐘，pH6.0。
C68℃，30分鐘，pH6.8。
D68℃，30分鐘，pH7.5。
E68℃，30分鐘，pH8.2。
F60℃，2小時(shí)，pH6.0。
G60℃，2小時(shí)，pH6.8。
H60℃，2小時(shí)，pH7.5。
I60℃，2小時(shí)，pH8.2。
J60℃，2小時(shí)，pH6.8，10mM半胱氨酸。
K60℃，2小時(shí)，pH7.5，10mM半胱氨酸。
L室溫(25℃)，2小時(shí)，pH6.0。
M室溫(250℃)，2小時(shí)，pH8.2。
1用常規(guī)工藝(壓制→膜→加熱→膜→陽離子交換劑-疏水色譜法-陰離子交換劑處理)。接著用螯合樹脂處理提純的rHSA。
2按實(shí)施例1工藝，用陰離子交換劑(DEAE)處理的rHSA。
3按實(shí)施例1工藝用螯合樹脂處理的rHSA。(1)按基因操作所得的HSA在本發(fā)明中，用基因操作而得的產(chǎn)生HSA的宿主，只要它是按基因操作而制備成的，則不受特別限制。就是，無論是在公知文獻(xiàn)中被報(bào)道過的，還是將來將被開發(fā)的那些宿主都可對其作適應(yīng)的選擇。更具體地是，可以產(chǎn)生HSA的，用基因操作而得的微生物(大腸桿菌、酵母、枯草桿菌(Bacillus Subtilis)等)和動(dòng)物細(xì)胞作這類宿主的例子。特別優(yōu)選地是使用酵母，特別是屬于Saccharomyces屬的(如，S.Cerevisiae)或Pichia屬(如，P.pastoris)的酵母作宿主。還有，營養(yǎng)缺陷型的菌株和抗菌素敏感的菌株是有用的。更優(yōu)選的是，采用Saccharomyces cerevisiae AH22菌株(a，his4，leu2，Can1)和Pichia pastoris GTS115菌株(his4)。
制備產(chǎn)生HSA的宿主，通過培養(yǎng)產(chǎn)生rHSA并從培養(yǎng)過的肉湯中分離和回收rHSA均按已知方法進(jìn)行，此法可作稍許修改。比如，制備產(chǎn)生HSA的宿主可用這樣的工藝完成，其中使用天然HSA基因(JP-A-58-56684，相應(yīng)于EP-A-73646，JP-A-58-90515，相應(yīng)于EP-A-79739及JP-A-58-150517，相應(yīng)于EP-A-91527)；一種其中采用修飾人血清清蛋白基因的工藝(JP-A-62-29985和JP-A-1-98486，相應(yīng)于EP-A-206733)；一種其中采用合成信號(hào)順序的工藝(JP-A-1-240191，相應(yīng)于EP-A-329127)，一種其中采用血清清蛋白信號(hào)順序的工藝(JP-A-2-167095，相應(yīng)于EP-A-319641)；一種其中將重組件質(zhì)粒引入染色體的工藝(JP-A-3-72889，相應(yīng)于EP-A-399455)；一種其中宿主被融合的工藝(JP-A-3-53877，相應(yīng)于EP-A-409156)；一種其中在含甲醇的培養(yǎng)基中產(chǎn)生突變的工藝；一種其中采用突變AOX2啟動(dòng)子的工藝(EP-A-506040)，一種其中HSA在B.Subtilis中表達(dá)的工藝(JP-A-62-215393，相應(yīng)于EP-A-229712)；一種其中HSA在酵母中表達(dá)的工藝(JP-A-60-41487，相應(yīng)于EP-A-123544，JP-A-63-39576，相應(yīng)于EP-A-248657，及JP-A-63-74493，相應(yīng)于EP-A-251744)及一種其中HSA在Pichia中表達(dá)的工藝(JP-A-2-104290，相應(yīng)于EP-A-344459)。
在這些方法中，其中在含甲醇的培養(yǎng)基誘發(fā)突變的方法以下列方式進(jìn)行。適宜的宿主轉(zhuǎn)化體，優(yōu)選是一種Pichia酵母，例證是菌株GTS115(NRRL保存號(hào)No.Y-15851)是以此常用方式通過引入質(zhì)粒而得到的，該質(zhì)粒含一種通過它將HSA在AOX1啟動(dòng)子的控制下表達(dá)到該宿主的AOX1基因區(qū)中的轉(zhuǎn)錄單位(參見JP-A-2-104290)。這種轉(zhuǎn)化體在含甲醇的培養(yǎng)基中幾乎不生長。因此，將此轉(zhuǎn)化體在含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生突變體，而且與能在此培養(yǎng)基中生長的菌株分離。在此培養(yǎng)基中的甲醇濃度范圍比如可以是0.0001-5％。該培養(yǎng)基既可以是合成的，又可以是天然的。此培養(yǎng)可在，比如，15-40℃的溫度下進(jìn)行約1-1000小時(shí)。
產(chǎn)生HSA宿主的培養(yǎng)可用上述專利中的每一種方法完成，可用這樣的一種方法完成其中產(chǎn)生者細(xì)胞和產(chǎn)物是通過分批供料培養(yǎng)(一種半批培養(yǎng))以高濃度獲得的，該法是以適當(dāng)小量通過逐漸供應(yīng)高濃度葡萄糖，甲醇等溶液進(jìn)行，以避免高濃度基質(zhì)對生產(chǎn)者細(xì)胞的抑制(JP-A-3-83595)；或用這樣一種方法完成其中HSA的產(chǎn)率是通過往該培養(yǎng)基中添加脂肪酸而改善的(JP-A-4-293495相應(yīng)于EP-A-504823和美國專利5,334,512)。
通常在用具有10-26個(gè)碳原子的脂肪酸或其鹽補(bǔ)充的工藝中采用的培養(yǎng)基可被用作培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主的培養(yǎng)基，而該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可在已知的條件下進(jìn)行。該培養(yǎng)基可以是合成的或是天然的。但最好是液態(tài)的培養(yǎng)基。比如，適宜的合成培養(yǎng)基可由碳源，如各種糖類；氮源，如尿素、銨鹽、硝酸鹽；痕量營養(yǎng)素，如各種維生素、核苷酸；及無機(jī)鹽，如Mg、Ca、Fe、Na、K、Mn、Co和Cu的鹽構(gòu)成。這培養(yǎng)基的說明性的例子是YNB液體培養(yǎng)基，它由0.7％的YeastNitrogen Base(Difco)和2％的葡萄糖組成。有用的天然培養(yǎng)基的說明性的例子是YPD液體培養(yǎng)基，它由1％的Yeast Extract(Difco)，2％的Bacto Peptone(Difco)和2％的葡萄糖組成。該培養(yǎng)基的pH值可以是中性的、弱堿性和或弱酸性的。在甲基營養(yǎng)宿主的情況下，該培養(yǎng)基可用約0.01-5％量的甲醇進(jìn)一步補(bǔ)充。
培養(yǎng)溫度的范圍最好是15-43℃(對酵母是20-30℃，對桿菌是20-37℃)。培養(yǎng)周期的范圍是1-1000小時(shí)，較好是20-360小時(shí)，用靜態(tài)的或振動(dòng)培養(yǎng)、或在攪動(dòng)和充氣條件下的分批、半分批或連續(xù)培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)之前，借助靜態(tài)或振動(dòng)培養(yǎng)或分批的、半分批的或在攪動(dòng)和充氣條件下的連續(xù)培養(yǎng)制備種子培養(yǎng)物是期望的。種子培養(yǎng)可使用上述的YNB液態(tài)培養(yǎng)基或YPD液態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行，最好是在30℃(對酵母)或37℃(對桿菌)進(jìn)行10-100小時(shí)。(2)提純r(jià)HSA(i)加熱處理按本發(fā)明的提純r(jià)HSA的工藝，在上述培養(yǎng)步驟中，所獲得的產(chǎn)生HSA的宿主培養(yǎng)基可被直接加熱處理，同時(shí)包含該宿主細(xì)胞而不進(jìn)行任何分離步驟，如離心分離或超濾性膜處理。這就是說，在本發(fā)明的提純工藝中第一步進(jìn)行加熱處理。
通常以50-100℃，1分鐘至10小時(shí)，較好是60-80℃，20分鐘至3小時(shí)，更好是68℃，30小時(shí)進(jìn)行加熱。最好是在有穩(wěn)定劑存在時(shí)進(jìn)行這種處理。穩(wěn)定劑的例子包括乙酰色氨酸、具有6-18個(gè)碳原子的有機(jī)羧酸及其鹽。這些穩(wěn)定劑可一起使用。加入乙酰色氨酸使最終濃度達(dá)到，如約1-100mM的量。具有6-18個(gè)碳原子的有機(jī)羧酸的例子包括己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸和油酸。最好用10mM的辛酸。其鹽的例子包括堿金屬鹽(鈉鹽、鉀鹽等)及堿土金屬鹽(鈣鹽等)。加入這些具有6-18個(gè)碳原子的有機(jī)羧酸或其鹽的量可以為，比如約1-100mM。
為抑制加熱引起的顯色，有效的是加入約1-100mM，更好是5-30mM的硫醇化合物(如，巰基乙醇、半胱氨酸、被還原的谷胱甘肽等)，而且，最好是在加熱步驟中進(jìn)一步加入10-1000mM的氨基胍(JP-A-3-103188)。
按常規(guī)方法，加熱無論是經(jīng)離心分離或過濾宿主培養(yǎng)基所得的上清液(濾液)或細(xì)胞。這是因?yàn)?，怕?dāng)直接加熱含細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，雜質(zhì)、脂類、核酸、蛋白酶等滲入會(huì)對目標(biāo)物的提純產(chǎn)生不希望的影響。因此，還不知道直接加熱含細(xì)胞的培養(yǎng)基對目標(biāo)物的提純是否有效。
然而，根據(jù)本發(fā)明已揭示，當(dāng)直接加熱含rHSA和宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基時(shí)，無論是rHSA的結(jié)構(gòu)功能，還是其產(chǎn)率均未惡化，但含在培養(yǎng)基中的充滿活力的蛋白酶卻被有效地失活。這樣，使蛋白酶失活的方法可簡化。此外，以基因操作而獲得的HSA可用下文將述及的工藝有效地提純。(ii)稀釋加熱的溶液及調(diào)整其性能然后將于上述(i)中所得的加熱的溶液與懸浮在流化床中的吸附劑顆粒一起處理。在這一處理之前，最好稀釋加熱的溶液，以便使之與導(dǎo)電率為0.1-50ms，較好是0.5-35ms，更好是5-15ms的氣氛中的吸附劑顆粒接觸。如在下文試驗(yàn)例3中所述，與該吸附劑顆粒結(jié)合的rHSA的量隨加熱的溶液稀釋度提高及加熱的顆粒與吸附劑接觸氣氛的導(dǎo)電率下降而增加，而且當(dāng)導(dǎo)電率為8-12ms左右時(shí)該量達(dá)到最大值。用作稀釋劑的溶劑無特別限制，只要該加熱的溶液中的rHSA的結(jié)構(gòu)功能不因此而惡化即可。在考慮吸附條件的同時(shí)可對其作適當(dāng)選擇。該稀釋劑的例子是濃度為50mM或更低的乙酸鹽緩沖液或蒸餾水。從方便的觀點(diǎn)看，用蒸餾水較好。
接著，將此溶液的pH值調(diào)到酸性的水平，這適于被吸附劑顆粒吸收。通常將它調(diào)到pH3-5，較好是pH4-4.8，更好是約pH4.5。雖然任何酸性溶液都可用來調(diào)整pH值而無限制，但用乙酸為好。(iii)吸附劑顆粒處理在稀釋和調(diào)整pH值之后，將所得到的加熱的溶液與吸附劑顆粒接觸。
吸附劑顆粒的例子包括具有陽離子交換基團(tuán)的載體(如陽離子吸附劑)、如磺基基團(tuán)類或羧基基因類的吸附劑顆粒。磺基基團(tuán)類吸附顆粒的例子有磺基-瓊脂糖(Streamline SP、S-Sepharos，二者均由Pharmacia制造)、磺基-纖維素(S-Cellulofine，chisso Corporation制造)，磺丙基-瓊脂糖(SP-Sepharose，Pharmacia制造)、SP-Cellthru-Big Beads(Sterogene制造)、磺丙基-葡聚糖(SP-Saphadex，Pharmacia制造)、及磺丙基-聚乙烯(SP-Toyopearl，Tosoh Corporation制造)。羧基基團(tuán)類吸附劑顆粒的例子有羧甲基-瓊脂糖(CM-Cellthru-Big Beads，Sterogene制造)、羧甲基-葡聚糖(CM-Sephadex，Pharmacia制造)、及羧甲基纖維素(CM-Cellulofine，Chisso Corporation制造)。最好采用磺基基團(tuán)類的強(qiáng)陽離子吸附劑顆粒的，特別優(yōu)選Streamline SP(Pharmacia制造)。
該吸附劑顆粒尺寸范圍通常是，比如30-1100μm，以100-300μm為佳。
接觸可在pH值約為3-5，較好是4-4.8，更好是約4.5，鹽濃度約0.01-0.2M，更好是約0.05-0.1M的條件下進(jìn)行。
最好是預(yù)先使吸附劑顆粒在上述的接觸條件下平衡。更具體地是，最好用50mM的含50mM氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)使該吸附劑顆劑平衡。
通常使該吸附劑顆粒平衡，而試樣則被注入含此吸附劑顆粒的流化床、與該吸附劑顆粒接觸，然后按下列步驟從流化床洗脫。
就是，首先將上述的吸附劑顆粒填入合適的柱中，并使其下沉。然后將平衡緩沖液從該柱的底部入口朝上送入，借此使該吸附劑顆粒懸浮。在此步驟中，向上流動(dòng)的緩沖液的流速對因重力作用而產(chǎn)生的吸附劑顆粒的沉降起著平衡的作用，該吸附劑顆粒以平衡的狀態(tài)均勻的懸浮著(即所謂的流化床)。含細(xì)胞的，已按上述(i)加熱和(ii)稀釋步驟處理過的粗培養(yǎng)基從該柱的底部入口供入其中已形成上述流化床的柱中。然后目標(biāo)rHSA與吸附劑顆粒結(jié)合，而細(xì)的顆粒及源于該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基的雜質(zhì)就這樣在流化床中的吸附顆粒中間穿過，從而從柱的頂部排出。還有，與吸附劑顆粒松散結(jié)合的雜質(zhì)用連續(xù)和向上供入的洗滌緩沖液洗去。最好是按擴(kuò)張床吸附技術(shù)[Journal of Chromatography，597(1992)，129-145]完成這些步驟。
平衡緩沖液作為洗滌緩沖液使用。
通過倒換流向和從柱的頂部入口向下供入洗脫緩沖液而回收rHSA?？稍趐H值范圍約8-10，較好約8.5-9.5，而更好約9，鹽濃度范圍約0.2-0.5M，較好約0.3-0.4M的條件下進(jìn)行rHSA的洗脫。緩沖液的具體例子是含0.3M氯化鈉的0.1M的磷酸鹽緩沖液(pH9)。
包括使吸附劑顆粒平衡，將試樣注入含吸附劑顆粒的流化床，與吸附劑顆粒接觸，從流化床洗脫等的上述工序可通過采用裝有Streamline柱(吸附劑Streamline SP，Pharmacia制造)的Streamline系統(tǒng)(Pharmacia制造)以高重現(xiàn)性方便而有效地進(jìn)行。
這樣可得到高純度的rHSA。通過上述吸附劑顆粒處理所得的rHSA的純度幾乎可與按含多個(gè)步驟的常規(guī)方法所得的rHSA純度相比，所述的步驟包括壓制→超濾性膜處理→加熱→超濾性膜處理→陽離子交換劑處理。此外，rHSA可以穩(wěn)態(tài)(即不被降解)高產(chǎn)率獲得，這歸因于用吸附劑顆粒處理之前先加熱培養(yǎng)基。因此，本發(fā)明使將上述的提純r(jià)HSA的常規(guī)工藝的步驟數(shù)目從5個(gè)減到2個(gè)成為可能，因而大大地縮短了提純周期。本發(fā)明還使從培養(yǎng)基中提純r(jià)HSA的產(chǎn)率的提高成為可能，此產(chǎn)率可與常規(guī)方法相比。
通過這些處理而得到的rHSA可用常規(guī)提純工藝進(jìn)一步提純。此處使用的提純工藝的例子包括通常使用的工藝，如疏水色譜法、超濾性膜處理、陰離子交換劑處理、螯合樹脂處理及硼酸/硼酸鹽處理。無論是這些處理中的一種，或是它們的組合均可采用。為獲得改善質(zhì)量的提純r(jià)HSA產(chǎn)物，最好是按如下順序進(jìn)行，疏水色譜法、超濾性膜處理、陰離子交換劑處理、超濾性膜處理、螯合樹脂處理、堿酸/硼酸鹽處理及超濾性膜處理。
在上述提純之前，最好在溶液與吸附劑顆粒接觸后，在有還原劑存在時(shí)再次加熱洗脫的吸附部分。如下文試驗(yàn)例6中所示，這種加熱處理對降低rHSA的顯色特性的程度是十分有效的，但rHSA的產(chǎn)率不受影響，從而可與省掉加熱處理的情況相比。就是，這種加熱處理使通過后續(xù)的提純步驟大大地消除顯色物成為可能。
加熱溫度一般為50-100℃，約60-80℃較好，而更好是60℃。加熱時(shí)間一般為10分鐘至10小時(shí)，約30分鐘至5小時(shí)較好，而更好是1小時(shí)。
本文所用的還原劑無特別限制，只要它有還原效果即可。它的例子包括具有SH基團(tuán)的低分子量化合物(如，半胱氨酸、半胱胺、胱胺、甲硫氨酸、谷胱甘肽等)、亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽、亞磷焦亞硫酸鹽及抗壞血酸。最好使用半胱氨酸。關(guān)于加入量，比如，半胱氨酸可以使最終濃度為約1-100mM的量加入，而亞硫酸鹽則可以最終濃度為約0.001-10％的量加入。
最好是有穩(wěn)定劑存在時(shí)進(jìn)行此處理。穩(wěn)定劑的例子包括乙酰色氨酸和具有6-18個(gè)碳原子的有機(jī)羧酸或其鹽。這些穩(wěn)定劑可一起使用。乙酰色氨酸比如可使該溶液的最終濃度為約1-100mM的量加入。具有6-18個(gè)碳原子的有機(jī)羧酸的例子包括己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸和油酸。用10mM的辛酸為好。其鹽的例子包括堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)及堿土金屬鹽(如鈣鹽等)。這些具有6-18個(gè)碳原子的有機(jī)羧酸或其鹽可以，比如1-100mM的量加入。通過進(jìn)一步加入10-1000mM的氨基胍，可消除因加熱而引起的顯色(JP-A-3-103188)。(a)疏水色譜法可以常規(guī)方式進(jìn)行疏水色譜法。用于疏水色譜法的載體的例子包括具有載帶4-18個(gè)碳原子的烷基(丁基、辛基、十八烷基等)或苯基的不溶解載體。最好采用具有苯基的載體，如苯基纖維素(Phenyl-Cellulofine，Chisso Corporation制造)。在此步驟中，可將rHSA回收入未吸附的部分。接觸可在，比如，pH為約6-8，較好為約6.5-7、鹽濃度為約0.01-0.5M，較好為約0.05-0.2M的條件下進(jìn)行。(b)陰離子交換劑處理也可以常規(guī)的方式進(jìn)行陰離子交換劑處理。任何陰離子交換劑都可使用，只要它是一種具有陰離子交換基團(tuán)的不溶載體即可。這種陰離子交換基團(tuán)的例子包括二乙氨乙基(DEAE)基團(tuán)和季氨乙基(QAE)基團(tuán)。最好是用具有DEAE基團(tuán)的陰離子交換劑，如DEAE-瓊脂糖(DEAE-Sepharose，Pharmacia制造)、DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephedex，Pharmacia制造)和DEAE-聚乙烯基(DEAE-Toyopearl，Tosoh Corporation制造)。在此步驟中，rHSA被回收到未吸附部分中。接觸可在，比如，pH約6-8，較好是約6.5-7，鹽濃度為約0.01-0.1M的條件下進(jìn)行。
通過此陰離子交換劑處理可消除顯色物及痕量雜質(zhì)。(c)超濾性膜處理。
在完成疏水色譜分離和/或陰離子交換劑處理之后，如此回收的含rHSA部分最好經(jīng)超濾性膜處理?？赏ㄟ^此超濾性膜處理消除熱原。在此超濾膜處理中，最好是使用分子量界限為100-300K的超濾性膜。作為其具體的例子，可引證Pellicom過濾片膜100K(Millipore制造)。(d)螯合樹脂處理螯合樹脂處理對消除通過基因操作而得的為HSA特征的顯色物尤為有效。按上述的提純工藝，這種處理最好在疏水色譜分離一超濾性膜處理-陰離子交換劑處理-超濾性膜處理之后進(jìn)行。通過使具有特定配位體的螯合樹脂與rHSA接觸來完成這一處理，然后在通過的餾分中得到rHSA。該螯合樹脂載體部分是一種具有疏水性的為佳。其例子包括一種苯乙烯/二乙烯基苯共聚物和一種丙烯酸/異丁烯酸共聚物。另一方面，該螯合樹脂的配位體部分的例子包括在分子中有多個(gè)亞氨基基團(tuán)、氨基基團(tuán)、亞乙基氨基基團(tuán)的多羥基化合物基團(tuán)，如N-甲基葡糖胺、多胺基團(tuán)(包括聚亞烷基多胺，如聚乙烯多胺)和硫脲基團(tuán)。方便的是采用市售的那些具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物載體的螯合樹脂，如DI-AION CRB02(配位體N-甲基葡糖胺基團(tuán)，Mitsu bishi Kasei Corporation制造)、LEWATIT TP214(配位體NHCSNH2、Bayer制造)及AmberliteCG4000。
適于螯合樹脂處理的條件如下pH酸性或中性或堿性(pH3-9，最好是pH4-7)。
時(shí)期1小時(shí)或更長，最好是6小時(shí)或更長。
離子強(qiáng)度50mmho或更低，以1-10mmho為佳。
混合比每250mg HSA 0.1-100g，較好1-10g(濕基準(zhǔn))樹脂。(e)硼酸/硼酸鹽處理通過用硼酸或硼酸鹽(本文指的是硼酸/硼酸鹽)進(jìn)一步處理通過上述處理而得到的含rHSA溶液則可消除具有抗原性，源于宿主的雜質(zhì)及可用苯酚-硫酸法檢測的非抗原性游離雜質(zhì)。
本文可用的硼酸的例子包括原硼酸、偏硼酸和四硼酸。硼酸鹽的例子包括堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽等)及堿土金屬鹽(如鈣鹽等)。最好用四硼酸鈣。硼酸或硼酸鹽可以使最終濃度為0.01-1M，較好是約0.05-0.2M的量添加。這種處理，比如，在pH約8-11，較好是約pH9-10、經(jīng)約1-100小時(shí)，較好是約5-50小時(shí)的條件下進(jìn)行。在此步驟中，這種含rHSA的低導(dǎo)電率的溶液是格外希望的。比如，該含rHSA的溶液的導(dǎo)電率是1ms或更低。還有，這種具有高rHSA濃度的含rHSA溶液也是格外希望的。比如，此rHSA的濃度為5％或更高，較好是約15-25％。
完成上述硼酸/硼酸鹽處理后，用常規(guī)方法，如離心分離或超濾從上清液中回收rHSA。(3)源于基因操作的高度提純的HSA的性能這樣獲得的高度提純的rHSA是一種均一的物質(zhì)，其分子量約為67000而等電點(diǎn)為4.9。它單獨(dú)地由單體構(gòu)成，基本上無二聚物，多聚物或分解產(chǎn)物(分子量約43000)。它基本上還沒有源于產(chǎn)生者宿主的任何抗原性雜質(zhì)或多糖。當(dāng)配成250mg/ml的rHSA溶液(25％的溶液)時(shí)，它具有低于0.015，較好是0.013或更低，更好是約0.01-0.015的A350/A280之比。可通過采用各種已知提純技術(shù)的適當(dāng)組合(上述技術(shù)(a)-(e)等)而得到顯色度如此降低(即低的A350/A280比值)的rHSA。
本發(fā)明首次使提供這樣一種重組體HSA(或含其的組合物)成為可能當(dāng)配成25％的rHSA溶液時(shí)顯示出低于0.015的A350/A280之比。(4)配制用已知的方法(超濾性膜處理、加穩(wěn)定劑、防腐過濾、吸管吸取、冷凍干燥等)可將按本發(fā)明方法而得的rHSA配制成各種制品。這樣獲得的rHSA制品可作為血清清蛋白制品，以與源于質(zhì)粒的常規(guī)HSA情況采用的同樣劑量和方式用于臨床。它們還被作為藥劑的穩(wěn)定劑、填充劑或載體使用。
本文所用的術(shù)語“含rHSA的組合物”指的是這樣一種材料它以高濃度，但低于100％含有本發(fā)明的高純度rHSA并含痕量的其它組分。
為進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但又不作任何限制，則提出以下實(shí)施例。實(shí)施例1(1)培養(yǎng)基的加熱處理按EP-A-655503中所述的方法獲得并培育產(chǎn)生HSA的酵母pichia pastoris。
將放2.8升這樣獲得的含細(xì)胞的培養(yǎng)基以30分鐘加熱到68℃。此加熱處理在有10mM辛酸鈉存在時(shí)進(jìn)行。該培養(yǎng)基的pH值為6。接著，將此加過熱的溶液快冷到約15℃，然后用蒸餾水稀釋約1倍(總體積5.5升)。然后用乙酸溶液將其pH值調(diào)到4.5。(2)吸附劑顆粒處理(Streamline SP處理)向Streamline SP柱(C50，5×100cm，凝膠體積300ml，Pharmacia制造，它已用50mM的含50mM氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH4.5平衡)向上輸入5.5升用上述加熱處理(1)而得到的含酵母細(xì)胞的培養(yǎng)基(導(dǎo)電率＜10ms)。輸入在攪動(dòng)下，以100cm/時(shí)的流速進(jìn)行。接著，將與用來平衡該柱相同的緩沖液(體積為該柱容量的2.5倍)向上供入該柱，借此以100cm/時(shí)的流速洗滌此柱1小時(shí)，再用300cm/時(shí)的流速洗滌30分鐘。接著使流動(dòng)方向反向，再將洗脫液(100mM磷酸鹽緩沖液(pH9)，含300mM氯化鈉、流速50cm/時(shí))供入該柱。這樣就得到了含rHSA的餾分。
這樣洗脫的含rHSA餾份通過測量280nm的吸光度而被檢測。(3)加熱處理將這樣得到的，含rHSA的餾分在10mM半胱氨酸，5mM辛酸鈉和100mM氨基胍氫氯化物(pH7.5)存在下在60℃加熱1小時(shí)。(4)疏水色譜法將上述(3)中加過熱的rHSA溶液倒入裝有Phenyl-Cellulofine的柱中(5×25cm，凝膠體積500ml，Chisso Corporation制造)，該柱用50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)(含0.15M的氯化鈉)平衡。在這些條件下，rHSA未被此Phenyl-Cellulofine柱吸收，但是通過它。用分子量截止為30000的超濾性膜(Millipone制造)將通過此柱的含rHSA溶液濃縮至約0.2升的體積，并用50mM的磷酸緩沖液(pH6.8)替換該含rHSA的溶液。(5)陰離子交換劑處理完成疏水色譜分離后，將已濃縮的含rHSA的溶液及替換的緩沖液注入裝有DEAE-Sepharose FF的，并用50mM磷酸鹽溶液(pH6.8)平衡的柱(5×25cm，凝膠體積500ml，Pharmacia制造)中。在這些條件下，rHSA未被DEAE-Sepharose柱吸收，但是通過它。用分子量截止為30000的超濾性膜(Millipore制造)將通過該柱的rHSA濃縮至體積為0.2升，再用蒸餾水替換此含rHSA溶液。(6)螯合樹脂處理向0.2升提純的濃度約為7％的rHSA中加入乙酸以將pH值調(diào)到4.5。然后將其注入裝有DIAION CRBO2的，用50mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)平衡的柱(5×2.5cm，凝膠體積500ml，MitsubishiKaseiCorporation制造)中，然后循環(huán)一夜。在這些條件下，rHSA未被凝膠吸收，但是通過該柱。
(7)硼酸/硼酸鹽處理將rHSA濃度調(diào)到2.5％，同時(shí)將該溶液的導(dǎo)電率調(diào)到1ms或更低。向其中加入四硼酸鈉，以使最終濃度為100mM。接著，往其中加入氯化鈣，以使最終濃度為100mM，而同時(shí)將pH值保持在9.5。使之靜置約10小時(shí)后，去除因此而形成的沉淀，回收上清液，再將之濃縮和脫鹽。然后用分子量截止為30000的超濾性膜(millipore制造)將其濃縮，然后再經(jīng)緩沖液替換。若需要，通過用0.22μm濾器(Millipore制造)過濾消毒后添加穩(wěn)定劑(辛酸鈉和乙酰色氨酸)。可將所得的rHSA溶液用于注射。試驗(yàn)例1加熱處理對rHSA培養(yǎng)基的穩(wěn)定效果含在rHSA培養(yǎng)基中的有效的蛋白酶使rHSA降解是公知的。如表1所示，在pH4的酸性條件下rHSA的降解進(jìn)行得極快。
表1rHSA培養(yǎng)基的pH穩(wěn)定性試樣貯存條件 貯存pH值HSA濃度產(chǎn)率(mg/ml)(％)培養(yǎng)基(含15℃，15小時(shí) 對照 7.6 100.0酵母細(xì)胞)(靜止) 6.0 7.7 100.94.5 7.2 94.04.0 3.0 39.9rHSA被約pH4.5的Streamline SP吸收。因此檢測約pH4.5的rHSA穩(wěn)定性，并且將加熱的溶液的pH值調(diào)至4.5并使之在室溫下靜置一夜后通過測定rHSA的穩(wěn)定性來檢測使蛋白酶失活有效的，作為在靜態(tài)下保持rHSA的預(yù)處理的加熱條件。圖1示出了結(jié)果。在此加熱階段，往每份試樣中加辛酸鈉，以使最終濃度為10mM。所用的加熱條件如下
A對照物B68℃，30分鐘，pH6.0。
C68℃，30分鐘，pH6.8。
D68℃，30分鐘，pH7.5。
E68℃，30分鐘，pH8.2。
F60℃，2小時(shí)，pH6.0。
G60℃，2小時(shí)，pH6.8。
H60℃，2小時(shí)，pH7.5。
I60℃，2小時(shí)，pH8.2。
J60℃，2小時(shí)，pH6.8，10mM胱氨酸。
K60℃，2小時(shí)，pH7.5，10mM胱氨酸。
L室溫(25℃)，2小時(shí)，pH6.0。
M室溫(25℃)，2小時(shí)，pH8.2。
結(jié)果表明，30分鐘加熱至68℃比2小時(shí)加熱至60℃更有效。調(diào)整pH值，在pH6左右得到最為期望的結(jié)果，這是被加熱的培養(yǎng)基的起始pH值。試驗(yàn)例2rHSA培養(yǎng)基的pH值和與吸附劑結(jié)合能力之間的關(guān)系用乙酸將該培養(yǎng)基(rHSA55.6mg)的pH值調(diào)到不同水平(pH4.5-4.9)，接著再加入1ml用50mM乙酸鹽緩沖液平衡的Stream-Line SP凝膠。在室溫混合和攪拌1小時(shí)后，再用每種平衡緩沖液洗滌，測定留在未吸附餾份中的rHSA的量(％)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與吸附劑結(jié)合的rHSA的量隨pH值的下降而增加，并于pH4.5左右達(dá)到最大值(表2)。表2rHSA培養(yǎng)基的pH值和與凝膠的結(jié)合能力試樣 未吸附的餾份未吸附的餾份(吸附狀態(tài))中的rHSA(mg)中的rHSA(％)原料 55.6 100.0未加凝膠pH 4.5 51.091.7加1ml凝膠pH 4.5 5.1 9.2pH 4.6 7.613.7pH 4.7 14.926.8pH 4.8 33.159.5pH 4.9 49.488.8試驗(yàn)例3加熱的溶液與吸附劑顆粒接觸的氣氛的導(dǎo)電性和rHSA與吸附劑顆粒結(jié)合能力之間的關(guān)系加熱后，該培養(yǎng)基[導(dǎo)電率約20ms(于25℃)，rHSA47.1mg]用蒸餾水稀釋得到各種稀釋度，并用乙酸將每份稀釋液的pH值調(diào)到4.5，接著加入1ml用含50mM氯化鈉的50mM的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)平衡的Streamline SP凝膠。在室溫下混合1小時(shí)，再用平衡緩沖液洗滌后，用含0.3M氯化鈉的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH9)洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與吸附劑顆粒結(jié)合的rHSA的量隨稀釋度的增加和該溶液的導(dǎo)電率的下降而增加，并且在氣氛(在凝膠混合物中)導(dǎo)電率(該加熱的溶液與吸附劑顆粒相接觸的導(dǎo)電率)為約8-12ms時(shí)達(dá)到最大程度(圖2)。試驗(yàn)例4Streamline SP洗脫液的穩(wěn)定性用蒸餾水將培養(yǎng)基稀釋一倍，再用乙酸將pH值調(diào)到4.5。然后將定量的，用含50mM的氯化鈉的50mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)平衡的Streamline SP凝膠加入，并于室溫?cái)嚢杌旌衔?小時(shí)。接著用平衡緩沖液洗滌凝膠。并用含0.3mM的氯化鈉的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH9)將rHSA洗脫。然后測餾份(pH8)中的rHSA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，三天后在事先加熱(68℃，30分鐘)的培養(yǎng)基中的rHSA來顯出變化，而由于降解，源于未處理的培養(yǎng)基中的rHSA則降低到約50％(表3)。
表3Streamline SP洗脫液的穩(wěn)定性(室溫，3天，pH8)試樣 貯存前的rHSA 貯存后的rHSA 殘留率(mg/ml) (mg/ml)(％)未加熱rHSA培養(yǎng)基的洗脫液 4.392.44 55.7加熱的rHSA培養(yǎng)基(60℃，2小時(shí))4.554.45 97.6的洗脫液加熱的rHSA培養(yǎng)基(68℃，30分鐘) 4.524.67 103.4的洗脫液試驗(yàn)例5比較(加熱→吸附劑顆粒)處理和(未加熱→吸附劑顆粒)處理之間的rHSA產(chǎn)率和顯色程度基于試驗(yàn)例1-4的結(jié)果，確立了加熱→吸附劑顆粒處理工藝的最優(yōu)流程(圖3)。
按圖3的流程，試驗(yàn)用Streamline SP柱(5×100cm，凝膠體積300ml)從含酵母細(xì)胞的培養(yǎng)基(2.8升)提純r(jià)HSA。另一方面，將含酵母細(xì)胞的培養(yǎng)基(2.7升)用沒有初始加熱的吸附劑顆粒處理，以提純r(jià)HSA。
結(jié)果，通過(未加熱→吸附劑顆粒)處理達(dá)到的總產(chǎn)率為50％，而通過本發(fā)明的(加熱→吸附劑顆粒)處理達(dá)到一個(gè)較高的總產(chǎn)率(約85％)。還有，按(未加熱→吸附劑顆粒)處理而得的rHSA顯示出按A350/A280的顯色程度為0.048，而按本發(fā)明(加熱→吸附劑顆粒)處理所得的rHSA顯示出較低的顯色程度(0.0345)(表4)。圖4示出了按(加熱→吸附劑顆粒)處理的Streamline洗脫液的凝膠過濾HPLC曲線圖和按(未加熱→吸附劑顆粒)處理的Streamline SP洗脫液的凝膠過濾HPLC曲線圖之間的比較。后者顯示出rHSA的嚴(yán)重的分解和降解。表4用Streamline SP柱提純r(jià)HSA體積rHSA 產(chǎn)率顯色程度試樣 (升) (g)(％)(A350/A280)加熱的試樣培養(yǎng)基 2.8 19.3 100 0.0475加熱(68℃，30分) 5.5 17.590.5 0.0291柱通過液 10.5 1.3 6.6 -柱洗脫液 1.2 16.585.4 0.0345未加熱的試樣培養(yǎng)基 2.7 11.9 100 0.0482加于柱中的溶液(稀釋，pH調(diào)整) 5.3 10.084.2 0.0366柱通過液 10.5 1.0 8.8 -柱洗脫液 1.2 5.950.0 0.0480試驗(yàn)例6隨半胱氨酸一同加熱對rHSA顯色程度的影響將被用作起始原料的，上述表4的(加熱→吸附劑顆粒)處理中的Streamline SP柱的rHSA洗脫液經(jīng)受實(shí)施例1(4)和(5)中所述的疏水色譜法和陰離子交換劑處理，然后評價(jià)顯色程度(A350/A280)。在此評價(jià)中，采用了兩種Streamline SP洗脫液試樣，即一種由在半胱氨酸存在下(最終濃度10mM)加熱得到的試樣，而另一是在半胱氨酸存在下，但未加熱得到的試樣。結(jié)果，無論是否有半胱氨酸存在，這兩種試樣的rHSA產(chǎn)率幾乎相同。然而關(guān)于顯色程度，在陰離子交換劑處理后(表5)，在有半胱氨酸存在下加熱的試樣顯示為0.0128，這大大低于未加熱試樣的0.0184。
表5Streamline步驟后提純r(jià)HSA試樣顯色程度(A350/A280)Streamline洗脫液0.0311與半胱氨酸一同加熱 0.0212苯基處理0.0197超濾(UF30K-R) 0.0205DEAE處理0.0128Streamline洗脫液0.0311苯基處理0.0270超濾(UF30K-R) 0.0275DEAE處理0.0184試驗(yàn)例7通過引入Streamline SP處理降低顯色程度(A350/A280)
圖5示出了按常規(guī)工藝中每個(gè)步驟的rHSA和按本發(fā)明工藝的rHSA之間的顯色程度(A350/A280)改變的比較，本發(fā)明的工藝包括Streamline SP步驟直到陰離子交換劑步驟。在使用StreamlineSP處理和此后在半胱氨酸存在下立即進(jìn)行加熱的本發(fā)明工藝中，與常規(guī)工藝大的區(qū)別在疏水色譜步驟可看到。在完成陰離子交換劑處理后，看到了極低的顯色程度(0.0128)。圖6示出了如表5所示的按常規(guī)工藝的螯合樹脂處理后所得試樣(曲線1)和如實(shí)施例1所述的在本發(fā)明的提純工藝中的陰離子交換劑處理和螯合樹脂處理之后所得試樣(曲線2和3)之間的吸收譜的對比。結(jié)果，與如表5所示的按常規(guī)方法在螯合樹脂處理后所得的試樣相比，按本發(fā)明方法在陰離子交換劑處理后提純的rHSA的吸收譜已在整個(gè)可視區(qū)域(350-700nm)顯示出令人矚目的低的圖形。在按本發(fā)明方法用螯合樹脂處理后，這區(qū)別變得更為明顯。試驗(yàn)例8用凝膠過濾HPLC的本發(fā)明方法得到的rHSA分析圖7示出了凝膠過濾高性能液體色譜法(GPC-HPLC)分析rHSA試樣的結(jié)果，該試樣是在實(shí)施例1中所述的本發(fā)明規(guī)定各步驟(rHSA培養(yǎng)基、Streamline SP洗脫、Streamline SP未吸附餾份、DEAE后處理餾份)后而得的。結(jié)果，變得清楚的是，含在該培養(yǎng)基中的除rHSA外的高分子量物質(zhì)和低分子量物質(zhì)大部分與酵母細(xì)胞一起被高效地洗掉進(jìn)入Streamline SP未吸附餾份，而清蛋白被專門地回收于該洗脫液中。用此餾份作原料并進(jìn)一步用陰離子交換劑(DEAE)處理而制得的試樣的HPLC圖形顯示出一個(gè)單獨(dú)的清蛋白(HSA單體)的尖銳的峰。這樣，其純度比得上，甚至超過由常規(guī)提純工藝的DEAE步驟所得試樣的純度。
基于這些試驗(yàn)例，算出由常規(guī)提純工藝的DEAE步驟所得的rHSA產(chǎn)率和由包括吸附劑顆粒(Streamline SP)處理步驟的工藝的DEAE濃縮步驟得到的rHSA產(chǎn)率并將其彼此相比。按照包括吸附劑顆粒(Streamline SP)處理的工藝，步驟數(shù)目從常規(guī)工藝的5個(gè)(即壓制→膜→加熱→膜→陽離子交換劑處理)減少到2個(gè)。因此處理時(shí)間大大縮短而產(chǎn)率提高30％。試驗(yàn)例9源于宿主的雜質(zhì)的分析按與本發(fā)明實(shí)施例1中所述工藝的同樣方式提純不產(chǎn)生清蛋白的酵母培養(yǎng)基。然后用其對兔作免疫接種。通過采用這樣獲得的抗血清，對提純的清蛋白溶液中的源于酵母的雜質(zhì)進(jìn)行檢測試驗(yàn)。為此改用酶免疫測定(EIA)。該試樣的清蛋白濃度被調(diào)到250mg/ml。
結(jié)果，從在硼酸/硼酸鹽處理后所得的提純清蛋白中，以0.1mg/ml的檢測極限，未檢到源于酵母的抗原性雜質(zhì)。試驗(yàn)例10按實(shí)施例1工藝提純的本發(fā)明rHSA的性質(zhì)(1)分子量用上述的HPLC凝膠過濾法測分子量。按本發(fā)明方法提純的rHSA的分子量約為67000，這幾乎與源于質(zhì)粒的HSA的分子量相同。(2)等電點(diǎn)按Allen等人的方法(J.Chromatog.，146，1(1978))使用聚酰胺凝膠測定等電點(diǎn)。按本發(fā)明方法提純的rHSA的等電點(diǎn)約為4.9，即，幾乎與源于質(zhì)粒的HSA的等電點(diǎn)相同。(3)顯色程度通過采用提純的rHSA溶液(清蛋白濃度250mg/ml)，測量此溶液在280和350nm的吸光度，及計(jì)算A350/A280之比確定顯色程度。按本發(fā)明方法提純的rHSA顯示了極低的約0.012的顯色程度(A350/A280)。實(shí)施例2(1)培養(yǎng)基的加熱處理將約1000升的，包含由EP-A-6555503中所述方法，以與實(shí)施例1相同的方式而得的細(xì)胞的培養(yǎng)基30分鐘加熱到68℃。該加熱處理是在10mM的辛酸鈉存在下進(jìn)行的。該培養(yǎng)基的pH值為6。接著，所此加熱的溶液冷至25℃，再用蒸餾水稀釋約一倍(總體積約2000升)。在稀釋前以該培養(yǎng)基體積的約1.1％(v/v)的量的乙酸溶液(99.7％)將其pH值調(diào)到4.5。(2)吸附劑顆粒處理(Streamline SP處理)向用含50mM的氯化鈉的50mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)平衡的Streamline SP柱(C1000，100×110cm柱凝膠體積150升，Parmacia制造)向上輸入按上述加熱處理(1)所得的2000升含酵母細(xì)胞的培養(yǎng)基。此輸入在攪動(dòng)下以100-250cm/時(shí)的流速進(jìn)行，直到往該柱中加入此培養(yǎng)基完成為止，以免細(xì)胞沉淀。接著，將同樣的緩沖液(體積為該柱容量的5倍)作為用于平衡該柱的緩沖液向上供入該柱，借此以100-500cm/時(shí)的流速洗滌此柱。接著，反轉(zhuǎn)流向，將洗脫液(含300mM氯化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH9)、流速50-100cm/時(shí))供入該柱。這樣就獲得含rHSA的餾份。
通過測量在280nm的吸光度測定這樣洗脫的含rHSA的餾份。(3)加熱處理將這樣得到的含rHSA的餾份，在10mM半胱氨酸、10mM的辛酸鈉、每摩爾rHSA4摩爾的量的油酸鈉，以及100mM氨基胍氫氯酸鹽(pH7.5)存在下，于60℃，加熱1小時(shí)，以降低rHSA的顯色程度并促進(jìn)二聚物向單體的轉(zhuǎn)化。
表6示出了用1噸培養(yǎng)基的依次4次試驗(yàn)的結(jié)果。68℃，30分鐘加熱處理和有半胱氨酸的加熱處理后的平均產(chǎn)率分別為98.6％和88.4％。四次試驗(yàn)總產(chǎn)率的好的結(jié)果為87.1％，這與實(shí)施例1的結(jié)果極為一致，在實(shí)施例1中用的是實(shí)驗(yàn)規(guī)模的柱(C50)。因此，證明了本發(fā)明方法有大范圍的重現(xiàn)性。
表6批號(hào) 步驟 體積 rHSA 產(chǎn)率 顯色程度No.(升) (g) (％)(A350/A280)1培養(yǎng)基922 5868 100.0 0.0596加熱(68℃，30分) 1900 5399 92.0 0.0379柱通過液 6000- - -柱洗脫液 200- - -有半胱氨酸加熱 62 4840 82.5 0.02682培養(yǎng)基943 6246 100.0 0.0547加熱(68℃，30分) 1960 6351 101.7 0.0375柱通過液 6400- - -柱洗脫液 300- - -有半胱氨酸加熱 61 5674 90.9 0.02483培養(yǎng)基937 6200 100.0 0.0539加熱(68℃，30分) 1877 6261 101.1 0.0307柱通過液 5777462 7.4 -柱洗脫液 200 - - -有半胱氨酸加熱 111 5594 90.2 0.02274培養(yǎng)基916 6845 100.0 0.0520加熱(68℃，30分) 1885 6818 99.6 0.0556柱通過液 5885- - -柱洗脫液 300- - -有半胱氨酸加熱 111 5804 84.8 0.0235參考例1鑒定rHSA(評估產(chǎn)率)在上述試驗(yàn)例1-8和10中，通過使含rHSA的溶液經(jīng)凝膠過濾HPLC從數(shù)量上對其作了評估(包括產(chǎn)率)。詳細(xì)的洗脫條件如下。
將含rHSA的溶液倒入用含0.1％的NaN3和0.3％的NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)平衡的TSK-GeL G3000 SWxL柱(0.78×30cm，Toso h Corporation制造)。然后用此平衡緩沖液作洗脫液以1ml/分的流速將rHSA洗脫，然后通過測量280nm和350nm的吸光度進(jìn)行鑒定。
基于發(fā)現(xiàn)了通過這樣地直接加熱含酵母的培養(yǎng)基可使蛋白酶簡單而有效地失活，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了一種通過加熱其中保留酵母細(xì)胞的培養(yǎng)基，然后使此加熱的培養(yǎng)基直接與懸浮于流化床中的吸附劑顆粒接觸，簡便而有效地提純r(jià)HSA的方法。從而，步驟數(shù)目從常規(guī)工藝的5步(包括壓制→膜→加熱→膜→陽離子交換劑處理)減少到加熱→吸附劑顆粒處理兩步。因而處理時(shí)間大為縮短，而產(chǎn)率提高。此外，對重組體HSA的顯色特性的難題通過本發(fā)明提純工藝可以解決，由此可有效地消除引起顯色的顯色物質(zhì)。
進(jìn)而，按照本發(fā)明，包括從培養(yǎng)細(xì)胞到提純的各步驟的全部生產(chǎn)重組體HSA的工藝可在一封閉系統(tǒng)線上進(jìn)行，因而帶來了這樣一些優(yōu)點(diǎn)，即可使HSA的生產(chǎn)自動(dòng)化，而符合衛(wèi)生學(xué)的管理(這是在生產(chǎn)作為醫(yī)藥的rHSA時(shí)的基本要求)則可方便地進(jìn)行。
因此，本發(fā)明的工藝作為提純r(jià)HSA的工藝是高度有效的，它不僅使縮短處理時(shí)間的提高產(chǎn)率成為可能，而且還改進(jìn)了產(chǎn)品的質(zhì)量。
此外，本發(fā)明使提供一種不含與產(chǎn)生者宿主等有關(guān)的雜質(zhì)并顯示充分抑制對作為藥物無用的顯色性的rHSA成為可能。
盡管本發(fā)明詳細(xì)地及通過參照其特定的實(shí)施方案而陳述的，但本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員很清楚，在其中可作各種變更和修改而不違背其精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種提純重組體人血清清蛋白的工藝，它包括加熱含有所述清蛋白和產(chǎn)生重組體人血清清蛋白的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，使所述的經(jīng)加熱的溶液與懸浮于流化床中的吸附劑顆粒在選擇性吸附所述清蛋白的條件下接觸，及回收吸附的餾份。
2.權(quán)利要求1的提純重組體人血清清蛋白的工藝，它包括加熱含所述清蛋白和產(chǎn)生重組體人血清清蛋白的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，將所述經(jīng)加熱的溶液向上供入其中懸浮著吸附劑顆粒的流化床，以使所述經(jīng)加熱的溶液與該吸附劑顆粒在選擇性吸附所述清蛋白的條件下接觸，然后反轉(zhuǎn)流向并向下供入一種緩沖液以洗脫和回收吸附的餾份。
3.權(quán)利要求1或2的提純重組體人血清清蛋白的方法，其中加熱是在50-100℃，1分至10小時(shí)下進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求3的提純重組體人血清清蛋白的工藝，其中使加熱的溶液與pH值約3-5的吸附劑顆粒接觸。
5.權(quán)利要求4的提純重組體人血清清蛋白的工藝，其中所述的經(jīng)加熱的溶液在導(dǎo)電率為0.1-50ms的氣氛中與所述的吸附劑顆粒接觸。
6.權(quán)利要求5的提純重組體人血清清蛋白的工藝，其中的所述吸附劑顆粒有強(qiáng)的陽離子交換基團(tuán)。
7.一種提純重組人血清清蛋白的工藝，其中按權(quán)利要求1或2的提純工藝回收的，含人血清清蛋白的經(jīng)吸附餾份被進(jìn)一步經(jīng)至少一種選自由疏水色譜法、陰離子交換劑處理、螯合樹脂處理、硼酸/硼酸鹽處理和超濾性膜處理所組成的組中的處理。
8.一種提純重組體人血清清蛋白的方法，其中通過權(quán)利要求1或2的提純方法回收的，含人血清清蛋白的經(jīng)吸附的餾份，在還原劑存在下被加熱，然后經(jīng)至少一種選自由疏水色譜法、陰離子交換劑處理、螯合樹脂處理、硼酸/硼酸鹽處理和超濾膜處理組成的組中的處理。
9.一種含人血清清蛋白的組合物，當(dāng)配制成25％的所述清蛋白溶液時(shí)，它含具有A350/A280比低于0.015的重組體人血清清蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過加熱含rHSA及產(chǎn)生rHSA宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，將所述經(jīng)加熱的溶液向上供入其中懸浮著吸附劑顆粒的流化床，以使之與該吸附劑顆粒接觸，而然后回收含rHSA的吸附餾分的提純重組體人血清清蛋白(rHSA)的方法，及一種當(dāng)配制成25％的所述清蛋白溶液時(shí)，含有顯示出低于0.015的A350/A280之比的rHSA的組合物。
文檔編號(hào)C07K14/765GK1127299SQ95117159
公開日1996年7月24日 申請日期1995年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月31日
發(fā)明者野田宗宏, 鷲見昭典, 大村孝男, 橫山和正 申請人:株式會(huì)社綠十字