專利名稱：：經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血清穩(wěn)定性增加或血清半壽期延長的治療性蛋白質(zhì)或肽，具體涉及與運鐵蛋白分子融合或插入運鐵蛋白分子的治療性蛋白質(zhì)或肽，所述分子經(jīng)過修飾，從而降低或抑制了糖基化、鐵結(jié)合和/或運鐵蛋白受體結(jié)合。
背景技術(shù)：
：天然狀態(tài)或重組產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)或肽一般是不穩(wěn)定的分子，其表現(xiàn)出短時間的血清穩(wěn)定性或短的血清半壽期。另外，當對這些分子進行配制，尤其是配制成水溶液供診斷和治療用時，它們經(jīng)常十分不穩(wěn)定。實踐中，有幾種方法可以延長或促進蛋白質(zhì)類治療性分子的體內(nèi)或體外穩(wěn)定性。聚乙二醇(PEG)是一種能與蛋白質(zhì)結(jié)合，導致蛋白質(zhì)作用時間延長、活性得以持續(xù)的物質(zhì)。如果與PEG的結(jié)合能延長蛋白質(zhì)的活性，施用蛋白質(zhì)的頻率即可降低。然而，PEG結(jié)合經(jīng)常會降低或破壞蛋白質(zhì)的治療活性。與能延長治療性蛋白質(zhì)的血清半壽期的異源蛋白質(zhì)融合也能使治療性蛋白質(zhì)或肽穩(wěn)定化。例如，與非融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)相比，與白蛋白和抗體片段融合的治療性蛋白質(zhì)表現(xiàn)出延長的血清半壽期，參見美國專利5，876，969和5，766,88。另一種血清蛋白質(zhì)，即糖基化的人運鐵蛋白(Tf)也被用于與治療性蛋白質(zhì)融合，從而在細胞內(nèi)進行靶向傳遞，或者攜帶異源物質(zhì)穿越血-腦屏障。通過使全長Tf與神經(jīng)生長因子(NGF)或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)融合，用這些含有糖基化人Tf的融合蛋白使NGF或CNTF靶向穿越血-腦屏障。參見美國專利5,672，683和5977，307。在這些融合蛋白中，分子的Tf部分被糖基化并與兩個鐵原子結(jié)合，這是Tf與細胞上的Tf受體結(jié)合所必需的，根據(jù)所述專利發(fā)的。通過將HIV-1蛋白酶序列插入糖基化運鐵蛋白表面暴露的環(huán)中，也可產(chǎn)生運鐵蛋白融合蛋白，籍此研究產(chǎn)生另一種Tf融合蛋白形式的能力，所述融合蛋白經(jīng)由Tf受體耙向傳遞至細胞內(nèi)部(Ali等，(1999)■/所o/.CAem.274(34):24066-24073)。血清運鐵蛋白(Tf)是分子量為80,000道爾頓的單體糖蛋白，它與循環(huán)中的鐵結(jié)合，并經(jīng)由運鐵蛋白受體(TfR)將鐵轉(zhuǎn)運至多個組織(Aisen等，(1980)Wev.所oc/2em.49:357-393;MacGillivray等，(1981)/所o/.C72em.258:3543-3553，美國專利5,026，651)。Tf是最常見的血清分子之一，它含有高達約5-10%的總血清蛋白質(zhì)。在酗酒者的血液中，糖缺損運鐵蛋白的水平與糖基化運鐵蛋白相比有所升高，且表現(xiàn)出較長的半壽期(約14-17天)。參見vanEijk等，(1983)C7/".C/z/m.爿cto132:167-171,Stibler(1991)C//",CAem,37:2029-2037(1991),Arndt(2001)C"".CTzem.47(1):13-27和Stibler等，"Carbohydrate-deficientconsumption",AdvancesintheBiosciences,(EdNordmann等),Pergamon,1988，Vol.71,pages353-357)。已清楚了解Tf的結(jié)構(gòu)，并闡明受體結(jié)合、鐵結(jié)合與釋放以及碳酸根離子結(jié)合的機理(美國專利5,026,651，5,986，067和MacGillivray等，(1983)JC/zem.258(6):3543-3546)。作為一種癌癥療法，已使用運鐵蛋白和能結(jié)合運鐵蛋白受體的抗體傳遞或攜帶毒性藥劑至腫瘤細胞(Baselga和Mendelsohn，1994)，運鐵蛋白已被用作非-病毒基因治療載體，用于將DNA傳遞至細胞中(Frank等，1994;Wagner等，1992)。已用幾種蛋白質(zhì)和肽闡明使用運鐵蛋白受體作為入點能將蛋白質(zhì)傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),所述蛋白質(zhì)和肽包括CD4(Walus等,1996)，得自腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Pardridge等，1994),得自膠質(zhì)的神經(jīng)營養(yǎng)因子(Albeck等)，vasointestinal肽類似物(Bickel等，1993)，p淀粉樣肽(Saito等,1995),和反義寡核苷酸(Pardridge等，1995)。然而，尚未修飾或改造過運鐵蛋白融合蛋白，以延長治療性蛋白質(zhì)或肽的血清半壽期，或通過降低或抑制Tf組成成分的糖基化來提高生物可用性，或降低或防止鐵和/或Tf受體結(jié)合。發(fā)明簡述如下文所詳述，本發(fā)明包括經(jīng)修飾的Tf融合蛋白，其含有至少一種治療性蛋白質(zhì)、多肽或肽實體，其中Tf部分已被改造以延長分子的血清半壽期或提高其生物可用性。本發(fā)明還包括含有該融合蛋白的藥物制劑和組合物，通過與經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合以增強治療性蛋白質(zhì)的血清穩(wěn)定性、延長血清半壽期和提高生物可用性的方法，編碼經(jīng)修飾Tf融合蛋白的核酸分子等。本發(fā)明的另一方面涉及用經(jīng)修飾的Tf融合蛋白治療患者的方法。在優(yōu)選實施方案中，經(jīng)修飾的Tf融合蛋白含有經(jīng)修飾可降低或防止糖基化和/或鐵和受體結(jié)合的人運鐵蛋白Tf組成成分。本發(fā)明還涉及1.含有與至少一種治療性蛋白質(zhì)或肽融合的運鐵蛋白(Tf)蛋白質(zhì)的融合蛋白，所述運鐵蛋白表現(xiàn)出降低的糖基化。2.項1的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽的血清半壽期高于治療性蛋白質(zhì)或肽在非融合狀態(tài)的血清半壽期。3.項1的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf的C-末端融合。4.項1的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf的N-末端融合。5.項1的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被插入Tf的至少一個環(huán)中。6.項1的融合蛋白，其中Tf蛋白對TfR的親和性降低。7.項1-5中任一項的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳運鐵蛋白(乳鐵蛋白)。8.項6的融合蛋白，其中TF蛋白不與TfR結(jié)合。9.項1的融合蛋白，其中Tf蛋白對鐵的親和性降低。10.項9的融合蛋白，其中Tf蛋白不與鐵結(jié)合。11.項1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有至少一個能防止糖基化的突變。12.項ll的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳運鐵蛋白(乳鐵蛋白)。13.項l的融合蛋白，它在衣霉素的存在下表達。14.項l的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有Tf蛋白N結(jié)構(gòu)域的一部分、橋連肽和Tf蛋白C結(jié)構(gòu)域的一部分。15.項14的融合蛋白，其中橋連肽將治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf連起來。16.項14的融合蛋白，其中所述治療性蛋白質(zhì)、肽或多肽被插入Tf蛋白的N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域之間。17.項l的融合蛋白，其中Tf蛋白在絞鏈區(qū)具有至少一個氨基酸取代、缺失或添加。18.項17的融合蛋白，其中所述絞鏈區(qū)選自大約殘基94至大約殘基96，大約殘基245至大約殘基247，大約殘基316至大約殘基318，大約殘基425至大約殘基427，大約殘基581至大約殘基582和大約殘基652至大約殘基658。19.項l的融合蛋白，其中所述Tf蛋白在選自下列的位置處具有至少一個氨基酸取代、缺失或添加Asp63,Gly65,Tyr95,Tyr188,Lys206,His207,His249,Asp392，Tyr426，Tyr514，Tyr517,His585，Thr120,Arg124，Ala126:Gly127,Thr452，Arg456,Ala458和Gly459。20.項5的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽取代至少一個環(huán)。21.項ll的融合蛋白，其中糖基化位點選自對應于氨基酸N413，N611的氨基酸殘基。22.項6或8的融合蛋白，其中Tf在對應于選自下列氨基酸的氨基酸殘基處含有至少一個氨基酸取代、缺失或添加Asp63，Gly65，Tyr95,Tyr188,Lys206，His207，His249，Asp392，Tyr426，Tyr514,Tyr517,His585，Thr120，Arg124,Ala126，Gly127,Thr452，Arg456，Ala458和Gly459。23.含有與至少一種治療性蛋白質(zhì)或肽融合的運鐵蛋白(Tf)蛋白質(zhì)的融合蛋白，所述運鐵蛋白表現(xiàn)出降低的對運鐵蛋白受體(TfR)的親和性。24.項l的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽的血清半壽期高于治療性蛋白質(zhì)或肽在非融合狀態(tài)的血清半壽期。25.項l的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf的C-末端融合。26.項l的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf的N-末端融合。27.項l的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被插入Tf的至少一個環(huán)中。28.項23的融合蛋白，其中TF蛋白不與TfR結(jié)合。29.項23的融合蛋白，其中Tf蛋白對鐵的親和性降低。30.項9的融合蛋白，其中Tf蛋白不與鐵結(jié)合。31.項23的融合蛋白，其中所述Tf蛋白表現(xiàn)出降低的糖基化，或不表現(xiàn)出糖基化。32.項31的融合蛋白，含有至少一個能防止糖基化的突變。33.項23的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有Tf蛋白N結(jié)構(gòu)域的一部分、橋連肽和Tf蛋白C結(jié)構(gòu)域的一部分。34.項33的融合蛋白，其中橋連肽將治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf連起來。35.項33的融合蛋白，其中所述治療性蛋白質(zhì)、肽或多肽被插入Tf蛋白的N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域之間。36.項23的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf絞鏈區(qū)具有至少一個氨基酸取4戈、缺失或添加。37.項36的融合蛋白，其中所述絞鏈區(qū)選自大約殘基94至大約殘基96，大約殘基245至大約殘基247,大約殘基316至大約殘基318，大約殘基425至大約殘基427，大約殘基581至大約殘基582和大約殘基652至大約殘基658。38.項23的融合蛋白，其中所述Tf蛋白在選自下列的位置處具有至少一個氨基酸耳又代、缺失或添加Asp63,Gly65,Tyr95,Tyr188,Lys206,His207,His249，Asp392,Tyr426，Tyr514,Tyr517，His585，Thr120,Arg124,Ala126,Gly127,Thr452，Arg456,Ala458和Gly459。39.項25的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽取代至少一個環(huán)。40.項31的融合蛋白，其中糖基化位點選自對應于氨基酸N413，N611的氨基酸殘基。41.編碼項1或23中任一項的融合蛋白的核酸分子。42.含有項41的核酸分子的載體。43.含有項42的載體的宿主細胞。44.含有項41的核酸分子的宿主細胞。45.表達Tf融合蛋白的方法，包括在能表達所編碼的融合蛋白的條件下培養(yǎng)項43的宿主細胞。46.表達Tf融合蛋白的方法，包括在能表達所編碼的融合蛋白的條件下培養(yǎng)項44的宿主細胞。47.項43的宿主細胞，其中細胞是原核或真核細胞。48.項44的宿主細胞，其中細胞是原核或真核細胞。49.項47的宿主細胞，其中細胞是酵母細胞。50.項48的宿主細胞，其中細胞是酵母細胞。51.含有項41的核酸分子的轉(zhuǎn)基因動物。52.生產(chǎn)Tf融合蛋白的方法，包括從項51的轉(zhuǎn)基因動物中分離融合蛋白。53.項52的方法，其中Tf融合蛋白含有乳鐵蛋白。54.項53的方法，其中融合蛋白從轉(zhuǎn)基因動物的生物液體分離。55.項53的方法，其中液體是血清或乳汁。56.治療患者疾病或疾病癥狀的方法，包括施用項1或項23的融合蛋白的步驟。附圖簡述圖1顯示了人(Hu)運鐵蛋白(Tf)N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域的序列比對結(jié)果，圖中突出了相似性和同一性。圖2A-2B顯示了得自不同物種的運鐵蛋白序列的比對結(jié)果。淺色陰影相似性；深色陰影同一性。圖3顯示了Tf表面暴露的多個治療性蛋白質(zhì)、多肽或肽插入位點的位置。圖4A-4B顯示了產(chǎn)生經(jīng)修飾Tf融合蛋白所用的多個優(yōu)選抗-TNFa抗體的VH和VL區(qū)域。圖5顯示了pREX0010。圖6顯示了pREXOOll。圖7顯示了pREX0012。圖8顯示了pREX0013。圖9顯示了pREX0014。圖10顯示了pREX0015。發(fā)明詳述一般性描述已發(fā)現(xiàn)通過使治療性蛋白質(zhì)、多肽或肽與足以延長其血清半壽期的經(jīng)修飾運鐵蛋白的全部或部分進行基因融合或化學偶聯(lián)，可以穩(wěn)定治療性蛋白質(zhì)(如多肽、抗體或肽，或其片段和變體)以延長血清半壽期和/或在體內(nèi)將治療性蛋白質(zhì)的活性維持更長時間。經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白包括與治療性蛋白質(zhì)或肽共價連接的運鐵蛋白或運鐵蛋白結(jié)構(gòu)域，其中與野生型運鐵蛋白序列相比，運鐵蛋白部分經(jīng)修飾后含有一個或多個氨基酸取代、插入或缺失。在一個實施方案中，Tf融合蛋白經(jīng)改造后可以減少或防止Tf或Tf結(jié)構(gòu)域內(nèi)的糖基化。在其它實施方案中，Tf蛋白或Tf結(jié)構(gòu)域經(jīng)修飾后與鐵或碳酸才艮離子的結(jié)合減弱或消失，或與Tf受體(TfR)的親和性減弱或不與該受體結(jié)合。因此，本發(fā)明包括運鐵蛋白融合蛋白，含有該融合蛋白的治療性組合物，通過施用該融合蛋白治療、預防或改善疾病的方法。本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白包括治療性蛋白質(zhì)的至少一個片斷或變體和經(jīng)修飾運鐵蛋白的至少一個片斷或變體，兩者彼此相連，優(yōu)選通過基因融合(即通過翻譯核酸產(chǎn)生運鐵蛋白融合蛋白，在所述核酸中，編碼全部或部分治療性蛋白質(zhì)的多核苦酸與編碼全部或部分經(jīng)修飾運鐵蛋白的多核苷酸在框內(nèi)進行連接)或化學偶聯(lián)彼此相連。治療性蛋白質(zhì)和運鐵蛋白一旦成為運鐵蛋白融合蛋白的一部分，即可稱之為運鐵蛋白融合蛋白"部分"、"區(qū)域"或"組成成分"(例如"治療性蛋白質(zhì)部分"或"運鐵蛋白部分")。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了運鐵蛋白融合蛋白，其含有治療性蛋白質(zhì)和經(jīng)修飾的血清運鐵蛋白，或者由這兩種組分組成。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了運鐵蛋白融合蛋白，其含有治療性蛋白質(zhì)的生物活性和/或治療活性片斷和經(jīng)修飾的運鐵蛋白，或者由所述治療性蛋白質(zhì)片斷和經(jīng)修飾的運鐵蛋白組成。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了運鐵蛋白融合蛋白，其含有治療性蛋白質(zhì)的生物活性和/或治療活性變體和經(jīng)修飾的運鐵蛋白，或者由所述治療性蛋白質(zhì)變體和經(jīng)修飾的運鐵蛋白組成。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了運鐵蛋白融合蛋白，其含有治療性蛋白質(zhì)以及經(jīng)修飾運鐵蛋白的生物活性和/或治療活性片斷。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是活性形式的治療性蛋白質(zhì)。屬
技術(shù)領(lǐng)域：
普通技術(shù)人員一般理解的意思相同。本發(fā)明的實踐或試驗中可以使用任何與本文所述類似或等同的方法和材料，但本文描述了優(yōu)選的方法和材料。定義本文所用術(shù)語"生物活性"指的是治療性分子、蛋白質(zhì)或肽在生物環(huán)境(即生物體或其體外復制物)中行使的功能或一整套活性。生物活性包括但不限于所要求融合蛋白的治療性分子部分的功能，例如但不限于誘導效應細胞系的細胞外基質(zhì)分泌，誘導激素分泌，誘導趨化性，誘導有絲分裂發(fā)生，誘導分化或抑制效應細胞的細胞分裂。如果本發(fā)明的融合蛋白或肽表現(xiàn)出其治療性蛋白質(zhì)的天然配對物的一個或多個生物活性，即可認為它們具有生物活性。通過序列比對鑒定出本文所用的與運鐵蛋白序列"相對應的氨基酸"或"等同的氨基酸，，，從而使第一個運鐵蛋白序列和至少第二個運鐵蛋白序列之間的同一性或相似性最大化。用于鑒定第二個運鐵蛋白序列中的等同氨基酸的數(shù)字基于鑒定第一個運鐵蛋白序列中的相應氨基酸所用的數(shù)字。在某些情況下，可以使用這些短語來描述與兔血清運鐵蛋白中的某些殘基相比較而言的人運鐵蛋白中的氨基酸殘基。本文所用術(shù)語"Tf蛋白的片斷"或"Tf蛋白"或"Tf蛋白的部分"指的是含有天然Tf蛋白或其突變體的至少約5%,10%，20%,30%，40%,50%，60%,70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%的氨基酸序列。本文所用術(shù)語"基因"指的是與生物學功能相關(guān)的任何DNA區(qū)段。因此，基因包括但不限于編碼序列和/或其表達所需的調(diào)節(jié)序列?；蛞部砂ǚ潜磉_的DNA區(qū)段，例如形成其它蛋白質(zhì)的識別序列的區(qū)段。可由多個來源獲得基因，包括從感興趣的來源克隆，或由已知或推測的序列信息合成，基因可包括經(jīng)設(shè)計后具有所需參數(shù)的序列。本文所用的"異源多核苷酸"或"異源核酸"或"異源基因"或"異源序列"或"外源性DNA區(qū)段"指的是源自相對于特定宿主細胞而言為外源的多核苷酸、核酸或DNA區(qū)段，或指來源相同，但對其原始形式進行過修飾的多核苦酸、核酸或DNA區(qū)段。宿主細胞中的異源基因包括相對于特定宿主細胞而言雖為內(nèi)源性的，但已被修飾過的基因。因此，該術(shù)語指的是對細胞而言為外源或異源的DNA區(qū)段，或者指與細胞同源，但在宿主細胞核酸內(nèi)的某個位置處，一般不會出現(xiàn)該元件的DNA區(qū)段。例如，與人Tf序列結(jié)合的酵母細胞天然信號序列是異源的。本文所用的"分離的"核酸序列指的是經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測定，基本上不含其它核酸序列的核酸序列，例如至少約20%純，優(yōu)選至少約40%純，更優(yōu)選約60%純，甚至更優(yōu)選約80%純，最優(yōu)選約90%純，甚至最優(yōu)選約95%純的核酸序列。例如，通過基因工程中所用的標準克隆方法，將核酸序列從其天然位置處轉(zhuǎn)移至欲重新產(chǎn)生該序列的不同位點處，即可獲得分離的核酸序列?？寺》椒òㄇ邢潞头蛛x所需的核酸片斷，該片斷含有編碼多肽的核酸序列，將所述片斷插入載體分子，再將重組載體摻入宿主細胞，即可在所述細胞中復制多拷貝或多克隆的核酸序列。核酸序列可以源自基因組、cDNA、RNA、半合成、合成或其任意組合。當DNA編碼序列之間的框內(nèi)融合導致DNA編碼序列被翻譯成多肽融合物時，即可認為兩個或多個DNA編碼序列是"連接的"或"融合的"。與Tf融合物有關(guān)的術(shù)語"融合"包括但不限于至少一種治療性蛋白質(zhì)、多肽或肽與Tf的N-末端結(jié)合，與Tf的C-末端結(jié)合，和/或在Tf內(nèi)的任意兩個氨基酸之間插入。本文所用的"經(jīng)修飾的運鐵蛋白"指的是與野生型運鐵蛋白相比，氨基酸序列中存在至少一個修飾的運鐵蛋白分子。本文所用的"經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白"指的是至少一個經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子(或其片斷或變體)與至少一個治療性蛋白質(zhì)分子(或其片斷或變體)融合形成的蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語"核酸"或"多核苷酸"指的是單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非另有限定，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的類似物的核酸，所述類似物具有與參照核酸類似的結(jié)合特性，并以類似于天然核苷酸的方式被代謝。除非另有說明，特定的核酸序列也暗含其經(jīng)保守修飾的變體(如筒并密碼子取代)和互補序列以及明確指出的序列。具體地說，通過產(chǎn)生一個或多個選定(或全部)密碼子的第三位被混合的-堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列，即可獲得簡并密碼子取代(Batzer等，(1991)NucleicAcidRes.19:5081;Ohtsuka等，(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608;Cassol等，(1992);Rossolini等，(1994)Mol,Cell.Probes8:91-98)。術(shù)語核酸可以與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA互換使用。當使某個DNA區(qū)段處于與另一個DNA區(qū)段的功能關(guān)系中時，可認為前者是"可操作相連的"。例如，當信號序列的DNA被表達成參與融合蛋白分泌的前蛋白質(zhì)時，可認為它與編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA可操作相連；如果啟動子或增強子促進序列轉(zhuǎn)錄，可認為它們與編碼序列可操作相連。一般說來，可操作相連的DNA序列是鄰接的，對于信號序列或融合蛋白而言，所述DNA序列既是鄰接的也是處于讀碼期的。然而，增強子無需與在其控制下轉(zhuǎn)錄的編碼序列鄰接。在此上下文中，通過在方便的限制性位點或所述位點中插入的銜接子或接頭處進行連接來完成連接。本文所用術(shù)語"啟動子"指的是參與結(jié)合RNA聚合酶以起始轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。本文所用術(shù)語"重組的"指的是經(jīng)重組DNA轉(zhuǎn)化的細胞、組織或生物體。本文所用的靶向?qū)嶓w、蛋白質(zhì)、多肽或肽指的是與特定細胞類型[正常的(如淋巴細胞)或異常的(如癌細胞)]特異性結(jié)合，因此可用于將Tf融合蛋白或化合物(藥物或細胞毒性劑)特異性靶向該細胞類型的分子。本文所用的"治療性蛋白質(zhì)"指的是具有一種或多種治療和/或生物活性的蛋白質(zhì)、多肽、抗體、肽或其片斷或變體。本發(fā)明包含的治療性蛋白質(zhì)包括但不限于蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗體和生物制品。本文中的術(shù)語肽、蛋白質(zhì)和多肽可以互換使用。另外，術(shù)語"治療性蛋白質(zhì)"可指治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)源性的或天然的關(guān)聯(lián)物。顯示出"治療活性"的多肽或有"治療活性"的蛋白質(zhì)指的是具有一種或多種與治療性蛋白質(zhì)(例如，如本文所述的或本領(lǐng)域已知的一種或多種治療性蛋白質(zhì))有關(guān)的已知生物活性和/或治療活性的多肽。作為一個非限制性的例子，"治療性蛋白質(zhì)"是可用于治療、預防或改善疾病的蛋白質(zhì)。所述疾病可以是人或非人動物的疾病，例如可以用于獸醫(yī)。本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指的是將核酸(即核苷酸聚合物)轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。本文所用術(shù)語"基因轉(zhuǎn)化"指的是將DNA,特別是重組DNA轉(zhuǎn)移和摻入至細月包內(nèi)。本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)化子"指的是經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞、組織或生物體。本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"指的是以確保其功能的方式插入生物體、宿主細胞或載體中的核酸。本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)基因的"指的是通過多種轉(zhuǎn)化方法中的一種，接受了外源基因或經(jīng)修飾基因，特別是編碼經(jīng)修飾Tf融合蛋白的基因的細胞、細胞培養(yǎng)物、生物體、細菌、真菌、動物、植物及其后代，其中相對于接受外源基因或經(jīng)修飾基因的生物體物種而言，外源基因或經(jīng)修飾基因得自相同或不同的物種。"變體"指的是與參照核酸或多肽有所不同，但能保持其基本特性的多核苷酸或核酸。一般說來，變體整體上非常相似，在很多區(qū)域中，與參照核酸或多肽相同。本文所用的"變體"指的是本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分，該部分的序列與天然治療性蛋白質(zhì)序列有所不同，但保持了天然蛋白質(zhì)如本文所述的或本領(lǐng)域已知的至少一種功能性和/或治療性特性。本文所用術(shù)語"載體"寬泛地指任何編碼外源性核酸的質(zhì)粒、噬粒或病毒。該術(shù)語也包括便于將核酸轉(zhuǎn)移至毒?；蚣毎械姆?質(zhì)粒、非-噬粒和非-病毒化合物，例如聚賴氨酸化合物等。載體也可以是適用作傳遞載體以將核酸或其突變體傳遞至細胞中的病毒載體，或者載體也可以是適用于相同目的的非-病毒載體。用于將DNA傳遞至細胞和組織中的病毒和非-病毒載體的例子是本領(lǐng)域眾所周知的，描述于例如Ma等，(1997，A^/.yic^/.U.S.A.94:12744-12746)。病毒載體的例子包括但不限于重組痘苗病毒，重組腺病毒，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，重組腺伴隨病毒，重組禽痘病毒等(Cranage等，7鄉(xiāng),EMBOJ.5:3057-3063;國際專利申請?zhí)朩094/17810，公開于1994年8月18日；國際專利申請?zhí)朩094/23744,公開于1994年10月27日)。非—病毒載體的例子包括但不限于脂質(zhì)體，DNA的多胺衍生物等。本文所用術(shù)語"野生型"指的是天然的多核苷酸或多肽序列。運鐵蛋白和運鐵蛋白修飾可以使用任何運鐵蛋白制備本發(fā)明的經(jīng)修飾Tf融合蛋白。野生型人Tf(Tf)是679個氨基酸的蛋白質(zhì)，約為75kDa(不計糖基化)，它具有兩個似乎源自基因復制的主要結(jié)構(gòu)域，N(約330個氨基酸)和C(約340個氨基酸)。參見GenBank登錄號NM001063,XM002793,Ml2530，XM039845，XMO39847和S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)(皆全文列入本文作為參者)以及SEQIDNO:l,2和3。這兩個結(jié)構(gòu)域隨著時間的變化也發(fā)生了異化，但保持了高水平的同一性/相似性(圖1)。N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域進一步被分成兩個亞結(jié)構(gòu)域，Nl和N2，Cl和C2。Tf的功能是將鐵轉(zhuǎn)運至體細胞中。該過程由所有細胞，特別是處于活性生長中的細胞上表達的Tf受體(TfR)介導。TfR識別鐵結(jié)合型Tf(兩個鐵結(jié)合型Tf與一個受體結(jié)合)，然后發(fā)生內(nèi)吞作用，從而將TfR/Tf復合物轉(zhuǎn)運至內(nèi)體中，此時局部pH值的降低導致結(jié)合鐵的釋放，TfR/Tf復合物重新循環(huán)至細胞表面并釋放出Tf(已知為非-鐵結(jié)合型apoTf)。受體結(jié)合需通過Tf的C結(jié)構(gòu)域。由于與非糖基化鐵結(jié)合的Tf能結(jié)合受體，因此C結(jié)構(gòu)域中的兩個糖基化位點似乎并不參與受體結(jié)合。每個Tf分子可攜帶兩個鐵原子。它們在N1和N2，C1和C2亞結(jié)構(gòu)域之間的間隙中復合，導致分子構(gòu)象改變。Tf經(jīng)由Tf受體if爭越血腦屏障(BBB)。在人運鐵蛋白中，鐵結(jié)合位點至少含有氨基酸Asp63(含有天然Tf信號序列的SEQIDNO:2的Asp82);Asp392(SEQIDNO:2的Asp411);Tyr95(SEQIDNO:2的Tyrl14);Tyr426(SEQIDNO:2的Tyr445);Tyrl88(SEQIDNO:2的Tyr207);Tyr514或517(SEQIDNO:2的Tyr533或Tyr536);His249(SEQIDNO:2的His268);His585(SEQIDNO:2的His604)，絞鏈區(qū)至少含有N結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基94-96，245-247和/或316-318,以及C結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基425-427，581-582和/或652-658，碳酸鹽結(jié)合位點至少含有氨基酉菱Thrl20(SEQIDNO:2的Thrl39);Thr452(SEQIDNO:2的Thr471);Argl24(SEQIDNO:2的Argl43);Arg456(SEQIDNO:2的Arg475);Alal26(SEQIDNO:2的Alal45);Ala458(SEQIDNO:2的Ala477);Glyl27(SEQIDNO:2的Glyl46);Gly459(SEQIDNO:2的Gly478)。在本發(fā)明的一個實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白包括經(jīng)修飾的人運鐵蛋白，但任何動物Tf分子都可用于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白，包括人Tf變體，奶牛、豬、綿羊、狗、兔、大鼠、小鼠、倉鼠、echnida、鴨嘴獸、雞、青蛙、天蛾幼蟲、猴以及其它牛、犬和禽類(參見圖2中的一套有中方便地獲得。人Tf核苦酸序列可以獲得(參見SEQIDNO:l,2和3以及上文所述的登錄號，它們可得自www.ncbi.nlm.nih.gov/)，可以使用這些序列來以制備自相關(guān)的分子，如乳運鐵蛋白(乳鐵蛋白，GenBank登錄號薩一002343)。已發(fā)現(xiàn)天然防御性鐵-結(jié)合蛋白乳鐵蛋白(Lf)具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤和抗炎癥活性。該蛋白質(zhì)存在于外泌物中，所述外泌物通常暴露于正常菌群、乳汁、眼淚、鼻分泌液、唾液、支氣管粘液、胃腸液、宮頸-陰道粘液和精液中。另外，Lf是循環(huán)多形核嗜中性白細胞(PMN)的次級特異性顆粒的主要成分。在膿毒性區(qū)域，PMN脫粒后即釋放出脫輔基蛋白質(zhì)。Lf的主要功能是清除液體和發(fā)炎區(qū)域的游離鐵，從而抑制自由基-介導的損害，并降低金屬的可用性以侵害微生物和腫瘤細胞。在檢查成人12511^周轉(zhuǎn)率的研究中，證實Lf能被肝臟和脾臟快速吸收，；改射性可在肝臟和脾臟中維持幾周(Bennett等，(1979)，C//".5W.flow/.」57:453-460)。在另一個實施方案中，本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括運鐵蛋白剪接變體。在一個例子中，運鐵蛋白剪接變體可以是人運鐵蛋白剪接變體。在一個具體實施方案中，人運鐵蛋白剪接變體可以是Genbank登錄號AAA61140。在另一個實施方案中，本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括乳鐵蛋白剪接變體。在一個例子中，人血清乳鐵蛋白剪接變體可以是嗜中性粒細胞乳鐵蛋白的新剪接變體。在一個具體實施方案中，嗜中性粒細胞乳鐵蛋白剪接變體可以是Genbank登錄號AAA59479。在另一個具體實施方案中，嗜中性粒細胞乳鐵蛋白剪接變體可含有下列氨基酸序列EDCIALKGEADA(SEQIDNO:8)，其包括新的剪接-變異區(qū)域。可以用任何Tf蛋白、片斷、結(jié)構(gòu)域或經(jīng)改造的結(jié)構(gòu)域制備經(jīng)修飾的Tf蛋白。也可使用單個Tf結(jié)構(gòu)域，如單個N或C結(jié)構(gòu)域制備Tf融合蛋白。在一些實施方案中，使用單個N結(jié)構(gòu)域較為有利，因為Tf糖基化位點存在于C結(jié)構(gòu)域中，N結(jié)構(gòu)域本身不與鐵或Tf受體結(jié)合。在其它實施方案中，可制備治療性蛋白質(zhì)與單個C結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中C結(jié)構(gòu)域已被改變，以降低、抑制或防止糖基化，鐵結(jié)合和/或Tf受體結(jié)合。在一些實施方案中，Tf或Tf部分應足夠長，從而與非融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)的血清穩(wěn)定性(半壽期)、體外溶液穩(wěn)定性或生物可用性相比，增加治療性蛋白質(zhì)的血清穩(wěn)定性、體外溶液穩(wěn)定性或生物可用性。所述穩(wěn)定性、血清半壽期或生物可用性的增加可以是超過未融合治療性蛋白質(zhì)的約30%，50%,70%，80%，90%或更高的增加。在一些情況下，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白表現(xiàn)出約10-20或更多天，約12-18天或約14-17天的血清半壽期。當Tf的C結(jié)構(gòu)域是融合蛋白的一部分時，可突變兩個N-聯(lián)糖基化位點，即對應于SEQIDNO:3的N413和N611的氨基酸殘基，以在酵母系統(tǒng)中表達，從而防止糖基化或高甘露糖基化并延長融合蛋白和/或治療性蛋白說明唾液酸-,或在有些情況下產(chǎn)生單唾液酰-Tf或雙唾液酰-Tf)。除了對應于N413和N611的Tf氨基酸外，也可對N-X-S/T糖基化位點內(nèi)的鄰近殘基進行突變以防止或大大減少糖基化。參見Funk等的美國專利5,986,067。據(jù)報道巴斯德畢赤氏酵母中表達的TfN結(jié)構(gòu)域在S32處被單個己糖O-聯(lián)糖基化，也可對此位點進行突變或修飾以防止這種糖基化。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白包括經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子，其中運鐵蛋白表現(xiàn)出降低的糖基化，其包括但不限于脫唾液酸-，單唾液酰-和雙唾液酰-形式的Tf。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括經(jīng)突變后可防止糖基化的重組運鐵蛋白突變體。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括完全被糖基化的重組運鐵蛋白突變體。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括經(jīng)突變后可防止糖基化的重組人血清運鐵蛋白突變體，其中SEQIDNO:3的Asn413和Asn611中的至少一個被突變成不允許糖基化的氨基酸。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括經(jīng)突變后可防止或大大降低糖基化的重組人血清運鐵蛋白突變體，其中可對N-X-S/T糖基化位點內(nèi)的鄰近殘基進行突變。正如下文所詳細討論的那樣，可以對本發(fā)明的經(jīng)》務飾Tf融合蛋白進行改造以使其不與鐵結(jié)合和/或不與Tf受體結(jié)合。在本發(fā)明的其它實施方案中，鐵結(jié)合得以保留，可以以兩種方式使用Tf的鐵結(jié)合能力，一種是將治療性蛋白質(zhì)或肽傳遞至細胞內(nèi)部和/或使其穿越BBB。經(jīng)常需改動這些結(jié)合鐵和/或Tf受體的實施方案，以降低或防止糖基化，從而延長治療性蛋白質(zhì)的血清半壽期。當負載有鐵時，單獨的N結(jié)構(gòu)域不與TfR結(jié)合，與鐵結(jié)合的C結(jié)構(gòu)域會與TfR結(jié)合，但結(jié)合親和性不同于完整的分子。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中突變體未能保留結(jié)合金屬的能力。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中相對于野生型血清運鐵蛋白而言，突變體對金屬具有較弱的結(jié)合親和性。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中相對于野生型血清運鐵蛋白而言，突變體對金屬具有較強的結(jié)合親和性。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中突變體未能保留結(jié)合運鐵蛋白受體的能力。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中相對于野生型血清運鐵蛋白而言，突變體對運鐵蛋白受體具有較弱的結(jié)合親和性。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中相對于野生型血清運鐵蛋白而言，突變體對運鐵蛋白受體具有較強的結(jié)合親和性。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中突變體未能保留結(jié)合碳酸鹽的能力。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中相對于野生型血清運鐵蛋白而言，突變體對碳酸鹽具有較弱的結(jié)合親和性。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括具有突變的重組運鐵蛋白突變體，其中相對于野生型血清運鐵蛋白而言，突變體對碳酸鹽具有較強的結(jié)合親和性。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括重組人血清運鐵蛋白突變體，其中至少一個選自SEQIDNO:3的Asp63，Gly65，Tyr95,Tyrl88,His249，Asp392，Tyr426,Tyr514，Tyr517和His585的氨基酸殘基具有突變，其中突變體保留了結(jié)合金屬的能力。在可替代的實施方案中，重組人血清運鐵蛋白突變體在至少一個選自SEQIDNO:3的Asp63，Gly65，Tyr95,Tyrl88，His249,Asp392,Tyr426,Tyr514,Tyr517和His585的氨基酸殘基中具有突變，其中突變體結(jié)合金屬的能力降低。在另一個實施方案中，重組人血清運鐵蛋白突變體在至少一個選自SEQIDNO:3的Asp63,Gly65,Tyr95,Tyrl88,His249,Asp392,Tyr426,Tyr517和His585的氨基酸殘基中具有突變，其中突變體未保留結(jié)合金屬的能力。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括重組人血清運鐵蛋白突變體，其中SEQIDNO:3的Lys206或His207中具有突變，其中與野生型人血清運鐵蛋白相比，突變體對金屬具有較強的結(jié)合親和性(參見美國專利5,986,067，其全文列入本文作為參考)。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括重組人血清運鐵蛋白突變體，其中SEQIDNO:3的Lys206或His207中具有突變，其中與野生型人血清運鐵蛋白相比，突變體對金屬具有較弱的結(jié)合親和性。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分包括重組人血清運鐵蛋白突變體，其中SEQIDNO:3的Lys206或His207中具有突變，其中突變體不與金屬結(jié)合。可以使用任何能利用的技術(shù)來制備本發(fā)明的融合蛋白，包括但不限于常用的分子4支術(shù)，例i口Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中7>開的技術(shù)。當使用本領(lǐng)域眾所周知的定點誘變技術(shù)進行核苷酸取代時，優(yōu)選對編碼氨基酸的次要特性進行改變，即進行保守的氨基酸取代，但是，也可以進行其它非保守的取代，尤其是當產(chǎn)生Tf融合蛋白的經(jīng)修飾運鐵蛋白部分，例如表現(xiàn)出降低的糖基化、降低的鐵結(jié)合等的經(jīng)修飾Tf融合蛋白時，可以進行非保守取代。具體預期的是氨基酸取代、小的缺失或插入(一般為1至約30個氨基酸)；運鐵蛋白結(jié)構(gòu)域之間的插入；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端的曱硫氨酸殘基，或運鐵蛋白結(jié)構(gòu)域之間或連接運鐵蛋白和治療性蛋白質(zhì)或肽的少于50,40,30，20或10個殘基的小接頭肽；或便于純化的小延伸，如聚-組氨酸序列段，抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。保守氨基酸取代的例子有相同組氨基酸內(nèi)的取代，如堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)，芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、曱硫氨酸)組內(nèi)發(fā)生的取代。非-保守取代包括用一組氨基酸取代另一組氨基酸。例如，非-保守取代包括用極性氨基酸取代疏水性氨基酸。有關(guān)核苷酸取代的一般性描述，可參見例如Ford等，(1991),2:95-107。非-保守取代、缺失和插入可特別用于產(chǎn)生本發(fā)明的TF融合蛋白，所述融合蛋白與鐵的結(jié)合降低或消失，融合蛋白與Tf受體的結(jié)合降低或消失和/或糖基化降低或消失。在本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)中，根據(jù)下述常規(guī)列表，按照下列系統(tǒng)設(shè)計氨基酸U酸表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>通過在對應于一個或多個TfN結(jié)構(gòu)域殘基Asp63,Tyr95,Tyrl88,His249和/或C結(jié)構(gòu)域殘基Asp392，Tyr426，Tyr514和/或His585的氨基酸殘基中進行突變，包括缺失、取代或插入，即可降低或破壞鐵結(jié)合和/或受體結(jié)合。通過突變氨基酸Lys206，Hys207或Arg632也可影響鐵結(jié)合。通過在對應于一個或多個TfN結(jié)構(gòu)域殘基Thrl20,Argl24，Alal26，Glyl27和/或C結(jié)構(gòu)域殘基Thr452，Arg456,Ala458和/或Gly459的氨基酸殘基中進行突變，包括缺失、取代或插入，即可降低或破壞碳酸鹽結(jié)合。碳酸鹽結(jié)合的降低或破壞反過來可影響鐵和/或受體結(jié)合。通過在對應于一個或多個上文針對鐵結(jié)合所述的TfN結(jié)構(gòu)域殘基的氨基酸殘基中進行突變，包括缺失、取代或插入，即可降低或破壞與Tf受體的結(jié)合。如上所述，通過對對應于C結(jié)構(gòu)域殘基N413和/或N611的N-X-S/T位點附近的一個或多個TfC結(jié)構(gòu)域殘基所對應的氨基酸殘基進行突變，包括缺失、取代或插入，即可降低或防止糖基化(參見美國專利5，986，067)。例如，可將N413和/或N611突變成Glu殘基。當未修飾本發(fā)明的Tf融合蛋白以防止糖基化、鐵結(jié)合、碳酸鹽結(jié)合和/或受體結(jié)合時，可從融合蛋白上去除或剝離糖基化、鐵和/或碳酸根離子。例如，可使用可獲得的去糖基化酶從融合蛋白上裂解糖基化殘基，特別是與Tf部分結(jié)合的糖殘基，可使用糖基化酶有缺陷的酵母防止糖基化，和/或可在能防止糖基化的試劑(如衣霉素(tunicamycin))存在時培養(yǎng)重組細胞?？蓪f進行其它的突變以改變TF的三維結(jié)構(gòu)，如對絞鏈區(qū)進行》務飾以防止出現(xiàn)鐵結(jié)合和Tf受體識別所需的Tf折疊。例如，可在以下氨基酸殘基中或其附近進行突變N結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基94-96，245-247和/或316-318以及C結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基425-427，581-582和/或652-658。另外，可在這些位點的側(cè)翼區(qū)內(nèi)或其附近進行突變以改變Tf結(jié)構(gòu)和功能。在本發(fā)明的一個方面，運鐵蛋白融合蛋白可用作載體蛋白以延長治療性蛋白質(zhì)的半壽期或生物可用性，以及在某些情況下，使治療性蛋白質(zhì)傳遞至細胞內(nèi)部和/或穿越血腦屏障。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白包括經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子，其中運鐵蛋白未保留穿越血腦屏障的能力。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白包括經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子，其中運鐵蛋白分子保留了與運鐵蛋白受體結(jié)合并將治療性肽轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)部的能力。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白包括經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子，其中運鐵蛋白分子未保留與運鐵蛋白受體結(jié)合并將治療性肽轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)部的能力。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白包括經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子，其中運鐵蛋白分子保留了與運鐵蛋白受體結(jié)合并將治療性肽轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)部的能力，但未保留穿越血腦屏障的能力。在可替代的實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白包括經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子，其中運鐵蛋白分子保留了穿越血腦屏障的能力，但未保留與運鐵蛋白受體結(jié)合并將治療性肽轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)部的能力。經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合物可含有一個或多個拷貝的與Tf蛋白N-末端和/或C-末端結(jié)合的治療性蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，治療性蛋白質(zhì)與Tf蛋白的N-末端和C-末端結(jié)合，融合蛋白可在Tf的任一端或兩端含有一個或多個治療性蛋白質(zhì)的等同物。在其它實施方案中，治療性蛋白質(zhì)或多肽被插入Tf蛋白的已知結(jié)構(gòu)域，例如插入一個或多個Tf5不中(參見Ali等，(1999)7:Ao/og.C7zew.274(34):24066-24073)。在其它實施方案中，治療性蛋白質(zhì)或治療性肽凈皮插入Tf的N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域之間。一般說來，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白可具有一個經(jīng)修飾的得自運鐵蛋白的區(qū)域和一個得自治療性蛋白質(zhì)的區(qū)域。然而，可以使用每種蛋白質(zhì)的多個區(qū)域制備本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白。類似地，可以使用一種以上的治療性蛋白質(zhì)制備本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白，從而產(chǎn)生多-功能的經(jīng)修飾Tf融合蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白含有與運鐵蛋白分子或其部分融合的治療性蛋白質(zhì)或其部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白含有與運鐵蛋白分子的N末端融合的治療性蛋白質(zhì)。在可替代的實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白含有與運鐵蛋白分子的C末端融合的治療性蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白含有與治療性蛋白質(zhì)的N末端融合的運鐵蛋白分子。在可替代的實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白含有與治療性蛋白質(zhì)的C末端融合的運鐵蛋白分子。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子含有與可能成為治療性肽N末端的部分融合的運鐵蛋白分子的N末端。在可替代的實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子含有與治療性肽C末端融合的運鐵蛋白分子的N末端。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子含有與可能成為治療性肽C末端的部分融合的運鐵蛋白分子的C末端。在可替代的實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白分子含有與治療性肽N末端融合的運鐵蛋白分子的C末端。在其它實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白含有與經(jīng)修飾運鐵蛋白的N-末端和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，與N-和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)是相同的治療性蛋白質(zhì)。在可替代的實施方案中，與N-和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)是不同的治療性蛋白質(zhì)。在另一個可替代的實施方案中，與N-和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)是不同的治療性蛋白質(zhì)，但這些蛋白質(zhì)可用于治療或預防相同的疾病。在另一個實施方案中，與N-和C-末端融合的治療性蛋白質(zhì)是不同的治療性蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可用于治療或預防本領(lǐng)域已知一般同時在患者中出現(xiàn)的疾病。除了使經(jīng)修飾的運鐵蛋白部分與治療性蛋白質(zhì)部分的N末端和/或C-末端融合可以獲得本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白外，通過將感興趣的治療性蛋白質(zhì)或肽(如本文所述的治療性蛋白質(zhì)或肽，或者，例如，與治療性蛋白質(zhì)或其片段或其變體結(jié)合的單鏈抗體)插入經(jīng)修飾運鐵蛋白的內(nèi)部區(qū)域，也可以產(chǎn)生本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白。經(jīng)修飾運鐵蛋白的內(nèi)部區(qū)域包括但不限于鐵結(jié)合位點、絞鏈區(qū)、碳酸氫鹽結(jié)合位點或受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在經(jīng)修飾運鐵蛋白分子的蛋白質(zhì)序列內(nèi)，存在多個通過二硫鍵穩(wěn)定化的環(huán)或轉(zhuǎn)角。這些環(huán)可用于插入或內(nèi)部融合有治療活性的肽，特別是那些需要二級結(jié)構(gòu)以成為功能性或治療性蛋白質(zhì)的肽，從而實質(zhì)上產(chǎn)生具有特定生物活性的經(jīng)修飾運鐵蛋白分子。當治療性蛋白質(zhì)或肽被插入或置換至少一個Tf分子的環(huán)時，除了在表面暴露的任何環(huán)區(qū)域內(nèi)進行插入外，還可在Tf的其它區(qū)域進行插入。例如，可以在含有TF氨基酸32-33,74-75，256-257,279-280和288-289的環(huán)內(nèi)進行插入(Ali等，文獻同上)(見圖3)。如上所述，也可以在Tf的其它區(qū)域內(nèi)進行插入，例如在下文將要詳細描述的鐵和碳酸氫鹽結(jié)合位點、絞鏈區(qū)和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行插入。也可以使用Tf蛋白序列中適于修飾/置換以插入蛋白質(zhì)或肽的環(huán)來開發(fā)隨機肽插入物的可篩選文庫。在克隆至Tf結(jié)構(gòu)域和/或與Tf末端融合之前，可以使用任何方法制備核酸插入物以產(chǎn)生肽文庫，包括可利用的噬菌體和細菌展示系統(tǒng)。Tf的N-末端是自由的，并指向背離分子體的方向。因此，N-末端上的蛋白質(zhì)或肽融合物是一個優(yōu)選實施方案。所述融合物包括將治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf分開的接頭區(qū)域，例如但不限于一段聚-甘氨酸序列。對前導序列之間的連接的關(guān)注、前導序列的選擇以及經(jīng)密碼子操作/最優(yōu)化的mRNA結(jié)構(gòu)(不是主要的莖環(huán)以抑制核糖體發(fā)展)會增加分泌，使用標準的重組蛋白質(zhì)技術(shù)可以容易地完成這些任務。由于C-末端6個氨基酸中存在二硫鍵，因此，Tf的C-末端似乎更加隱蔽和安全。在人Tf中，C-末端氨基酸是脯氨酸，根據(jù)其定向的方式，要么將融合物指向背離的方向，要么將融合物指向分子體內(nèi)部。在本發(fā)明的一些實施方案中，可在C-末端使用接頭或間隔區(qū)組成成分。在其它實施方案中，可以使小分子治療劑與鐵復合，并荷載于經(jīng)修飾的Tf蛋白融合物上，用于將治療劑傳遞至細胞內(nèi)部并穿越BBB。添加靶向肽，或例如SCA可將有效荷載靶向特定的細胞類型，如癌細胞。核酸本發(fā)明還提供了核酸分子。它們編碼經(jīng)修飾的Tf融合蛋白，所述融合蛋白含有與治療性蛋白質(zhì)共價連接或連接的運鐵蛋白或運鐵蛋白的一部分。如下文所詳細討論的，可以使用任何治療性蛋白質(zhì)。融合蛋白可進一步含有接頭區(qū)，例如少于約50,40,30，20或IO個氨基酸殘基的接頭。接頭可在運鐵蛋白或其部分以及治療性蛋白質(zhì)之間進行共價連接。本發(fā)明的核酸分子可以是純化的，也可以是非純化的。本發(fā)明還提供了用于復制核酸分子并表達編碼的融合蛋白的宿主細胞和載體?？梢允褂萌魏屋d體或宿主細胞，包括原核或真核細胞，特別優(yōu)選酵母表達系統(tǒng)。本領(lǐng)域已知多種用于此目的的載體和宿主細胞。針對所需的用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地選擇適當?shù)乃拗骷毎洼d體。編碼運鐵蛋白、運鐵蛋白部分和所需治療性蛋白質(zhì)的DNA序列可克隆自多種本領(lǐng)域已知的基因組或cDNA文庫。使用基于探針的方法分離所述DNA序列的技術(shù)是常規(guī)技術(shù)，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)。分離所述DNA序列的探針可基于公開的DNA或蛋白質(zhì)序列(參見例如Baldwin,GS.(1993)ComparisonofTransferrinSequencesfromDifferentSpecies.Comp.Biochem.Physiol.106B/1:203-218和其中提及的所有參考文獻，這些文獻皆全文列入本文作為參考)?；蛘撸部梢允褂猛ㄟ^參考文獻摻入本文的、由Mullis等，(美國專利4,683,195)和Mullis(美國專利4,683,202)公開的聚合酶鏈反應(PCR)法。文庫的選擇和分離所述DNA序列所用探針的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平所能掌握的。本領(lǐng)域已知通過將一種多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列及其保守的核香酸或氨基酸取代物與另一種多核苷酸或多肽的序列進行比較，即可測定兩種多核苷酸或多肽之間的"相似性"。本領(lǐng)域還已知"同一性"指的是兩種多肽或兩種多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，所述相關(guān)程度是通過兩行序列之間匹配的同一性測定的。同一性和相似性都是容易計算的(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed"OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W"ed.，AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,PartI，Griffin,A.M.,andGriffin,H.G"eds.，HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G"AcademicPress,1987;和SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds,，MStocktonPress,NewYork,1991)。盡管有多種方法可用于測定兩個多核苷酸或多肽序列之間的同一性和相似性，但術(shù)語"同一性，，和"相似性"是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G"AcademicPress,1987;SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.，MStocktonPress,NewYork,1991;和Carillo,H.，andLipman,D.，SIAMJ.AppliedMath.，48:1073(1988))。常規(guī)用于測定兩個序列之間的同一性或相似性的方法包括但不卩艮于GuidetoHugeComputers,MartinJ.Bishop,ed.,AcademicPress,SanDiego,1994,和Carillo，H.，andLipman,D.，SIAMJ.AppliedMath.48:1073(1988)中公開的方法。將測定同一性的優(yōu)選方法設(shè)計成可使兩個受測試序列之間出現(xiàn)最大程度的匹配。計算機程序整理出測定同一性和相似性的方法。測定兩個序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，NucleicAcidsResearch12(1):387(1984))，BLASTP，BLASTN，F(xiàn)ASTA(Atschul等，J.Molec.Biol.215:403(1990))。將上文所指的相似性或同一性程度測定為兩個序列之間的同一性程度，它能表示第一個序列與第二個序列的差異。通過本領(lǐng)域已知的計算機程序，如GCG程序包中提供的GAP(NeedlemanandWunsch(1970)JournalofMolecularBiology48:443-453),可以測定兩個核酸序列之間的同一性程度。為了在本發(fā)明中測定兩個核酸序列之間的同一性程度，使用具有下列設(shè)置的GAP:GAP產(chǎn)生罰分為5.0，GAP延伸罰分為0.3。密碼子最優(yōu)化遺傳密碼的簡并性使得可以對運鐵蛋白和/或所需治療性蛋白質(zhì)的核苷酸序列進行變異，但仍會產(chǎn)生氨基酸序列與天然DNA序列所編碼多肽的氨基酸序列相同的多肽。已知為"密碼子最優(yōu)化"的方法(描述于美國專利5,547,871,其全文列入本文作為參考)為人們提供了一種設(shè)計經(jīng)改變的DNA序列的方法。密碼子最優(yōu)化基因的設(shè)計應考慮多個因素，包括生物體中的密碼子使用頻率、近鄰的頻率、RNA穩(wěn)定性、形成二級結(jié)構(gòu)的潛能、合成路徑和該基因?qū)⒉捎玫腄NA操作。特別是，當使用酵母表達系統(tǒng)時，可以使用可利用的方法，用最容易被酵母識別的密碼子來改變編碼給定融合蛋白的密碼子。遺傳密碼的簡并性允許以多種不同的方法編碼和翻譯相同的氨基酸序列。例如，亮氨酸、絲氨酸和精氨酸各由6個不同的密碼子編碼，而纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和甘氨酸各由4個不同的密碼子編碼。然而，在真核生物和原核生物中，不同基因組之間的同義密碼子有所不同。例如，哺乳動物的同義密碼子-選擇模式非常類似，而在進化上關(guān)系較遠的生物體，如酵母(釀酒酵母)、細菌(如大腸桿菌)和昆蟲(如D.me/朋ogaWw)的基因組密碼子使用頻率模式明顯不同(Grantham,R等，Nucl.AcidsRes.,8，49-62(1980);Grantham,R等，Nucl.AcidsRes.，9,43-74(1981);Maroyama,T等,Nucl.AcidsRes.，14,151-197(1986);Aota，S等，Nucl.AcidsRes"16,315-402(1988);Wada,K等，Nucl.AcidsRes"19Supp.，1981-1985(1991);Kurland,C.G.,FEBSLetters,285，165-169(1991))。密碼子-選擇模式的差異似乎通過調(diào)節(jié)肽延長速率，來對各個基因的表達水平產(chǎn)生影響(Kurland，C.G.,FEBSLetters,285,165-169(1991);Pedersen,S.,EMBOJ.,3,2895-2898(1984);Sorensen，M.A.，J.Mol.Biol"207,365-377(1989);Randall,L.L等，Eur.J.Biochem.,107,375-379(1980);Curran，J.F.,andYams，M.，J.Mol.Biol"209,65-77(1989);Varenne，S等，J.Mol，Biol.,180,549-576(1984),Varenne，S等，J.Mol,Biol"180,549-576(1984);Garel,J,R，J.Theor.Biol"43,211-225(1974);Ikemura，T.,J.Mol.Biol"146,1-21(1981);Ikemura，T"J.Mol.Biol"151,389-409(1981》。合成基因的優(yōu)選密碼子使用頻率應反映核基因的密碼子使用，所述基因得自欲用于重組蛋白質(zhì)表達的細胞/生物體(特別是酵母)的原樣(或盡可能密切相關(guān)的)基因組。如上所述，在一個優(yōu)選實施方案中，在對治療性蛋白質(zhì)核苷酸序列進行本文所述的適于在酵母中進行表達的修飾之前或之后，對人Tf序列的密碼子進行最優(yōu)化。載體用于本發(fā)明的表達單位一般含有以5，至3'方向可操作相連的下述元件轉(zhuǎn)錄啟動子；分泌信號序列；編碼經(jīng)修飾的Tf融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白含有與編碼所需治療性蛋白質(zhì)或肽的DNA序列連接的運鐵蛋白或運鐵蛋白部分；和轉(zhuǎn)錄終止子。如上所述，與Tf部分融合或位于Tf部分內(nèi)部的治療性蛋白質(zhì)或肽的任何排布都可用于本發(fā)明的載體中。由選定的宿主細胞確定適當啟動子、信號序列和終止子的選擇，這一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，下文將要更具體地進行討論?？捎糜诒景l(fā)明的適當酵母載體描述于美國專利6，291，212,其包括YRp7(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:1035-1039，1978)，YEpl3(Broach等，Gene8:121-133，1979)，pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature275:104-108，1978),pPPC0005,pSeCHSA，pScNHSA，pC4及其衍生物。有用的酵母質(zhì)粒載體還包括可得自StratageneCloningSystems,LaJolla，CA92037，USA的pRS403-406,pRS413-416和畢赤氏酵母載體。質(zhì)粒pRS403，pRS404,pRS405和pRS406是酵母整合質(zhì)粒(YIp)，其中摻入了酵母選4奪標記HIS3，7RPI,LEU2和URA3。質(zhì)粒pRS413~41.6是酵母著絲粒質(zhì)粒(Ycp)。所述載體一般包括選擇標記，所述選擇標記是多種表現(xiàn)出顯性表型的基因之一，對所述表型而言，應存在可選擇轉(zhuǎn)化子的表型試驗。優(yōu)選的選擇標記是能補償宿主細胞營養(yǎng)缺陷、提供抗生素抗性或使細胞能利用特定碳源的標記，其包括LEU2(Broach等，文獻同上)，URA3(Botstein等，Gene8:17,1979),HlS3(Struhl等，文獻同上)或POTl(Kawasaki和Bell，EP171,142)。其它適當?shù)倪x擇標記包括能賦予酵母細胞氯霉素抗性的CAT基因。用于酵母的優(yōu)選啟動子包括酵母糖酵解基因的啟動子(Hitzeman等，JBiol.Chem.225:12073-12080，1980;Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1:419-434，1982;Kawasaki,美國專利4,599，311)或乙醇脫氫酶基因的啟動子(Young等，inGeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals,Hollaender等，(eds.),p.355，Plenum,N.Y"1982;Ammerer，Meth.Enzymol.101:192-201,1983)。在此方面，特別優(yōu)選的啟動子是TPI1啟動子(Kawasaki，美國專利4,599,311)和ADH2-4.sup.C[參見美國專利6，291,212]啟動子(Russell等，Nature304:652-654,1983)。表達單位還可包括轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是TPI1終止子(Alber和Kawasaki,文獻同上)。除了酵母，還可以在絲狀真菌，如曲霉屬真菌菌林中表達本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白。有用啟動子的例子包括得自^^wg/〃^mWw/ara糖酵解基因的啟動子，如ADH3啟動子(McKnight等，EMBOJ.4:2093-2099,1985)和tpiA啟動子。適當終止子的例子是ADH3終止子(McKnight等，文獻同上)?？蓪⒗蒙鲜鼋M分的表達單位克隆至載體中，所述載體能插入例如曲霉的染色體DNA。用于實施本發(fā)明的哺乳動物表達載體包括能介導經(jīng)修飾的Tf融合蛋白轉(zhuǎn)錄的啟動子。優(yōu)選的啟動子包括病毒啟動子和細胞啟動子。優(yōu)選的病毒啟動子包括腺病毒2的主要晚期啟動子(KaufmanandSharp,Mol.Cell.Biol.2:1304-13199，1982)和SV40啟動子(Subramani等，Mol.Cell.Biol.1:854-864:1981)。優(yōu)選的細胞啟動子包括小鼠金屬硫蛋白1啟動子(Palmiter等，Science222:809-814，1983)和小鼠V.sub..kappa.[參見美國專利6，291,212]啟動子(Grant等，Nuc.AcidsRes.15:5496，1987)。特別優(yōu)選的啟動子是小鼠V.sub.H[參見美國專利6,291,212]啟動子(Loh等，文獻同上)。所述表達載體還可含有一套位于啟動子下游和編碼運鐵蛋白融合蛋白之DNA序列上游的RNA剪接位點。優(yōu)選的RNA剪接位點可得自腺病毒和/或免疫球蛋白基因。表達載體中還可含有位于所需編碼序列下游的聚腺苷酸化信號。聚腺苷酸化信號包括SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信號(KaufmanandSharp,文獻同上)，腺病毒5E1B區(qū)的聚腺苷酸化信號和人生長激素基因終止子(DeNoto等，Nuc.AcidsRes.9:3719-3730，1981)。特別優(yōu)選的聚腺苦酸化信號是V.sub.H[參見美國專利6,291,212]基因終止子(Loh等，文獻同上)。表達載體可包括位于啟動子和RNA剪接位點之間的非編碼病毒前導序列，如腺病毒2三聯(lián)前導序列。優(yōu)選的載體還可包括增強子序列，如SV40增強子和小鼠.mu.[參見美國專利6，291,212]增強子(Gillies,Cell33:717-728,1983)。表達載體還可包括編碼腺病毒VARNA的序列。轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化真菌的技術(shù)已在文獻中公開，所述技術(shù)描述于例如Beggs(文獻同上)，Hinnen等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929-1933,1978)，Yelton等,(Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1740-1747,1984)和Russell(Nature301:167-169,1983)。宿主細胞的基因型一般含有基因缺陷，該缺陷可由表達載體中存在的選擇標記補償。特定宿主和選擇標記的選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。通過例如磷酸鉤介導的轉(zhuǎn)染(Wigler等，Cell14:725，1978;CorsaroandPearson,SomaticCellGenetics7:603,1981;GrahamandVanderEb,Virology52:456，1973.)，可將含有本發(fā)明的經(jīng)修飾Tf融合蛋白的克隆DNA序列導入培養(yǎng)的哺乳動物細胞。也可以使用其它將克隆的DNA序列導入哺乳動物細胞的技術(shù)，例如電穿孔(Neumann等，EMBOJ.1:841-845,1982)或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法。為了鑒定出整合了克隆DNA的細胞，一般將選擇標記與所需基因或cDNA—起導入細胞。用于經(jīng)培養(yǎng)的哺乳動物細胞的優(yōu)選選擇標記包括賦予藥物抗性的基因，如新霉素、潮霉素和氨曱蝶呤抗性基因。選擇標記可以是可擴增的選擇標記。優(yōu)選的可擴增選擇標記是DHFR基因。特別優(yōu)選的可擴增標記是DHFR.sup.r[參見美國專利6,291,212]cDNA(SimonsenandLevinson,Proc.Natl.Adac.Sci.USA80:2495-2499，1983)。Thilly對選擇標記進行了評述(MammalianCellTechnology,ButterworthPublishers,Stoneham，Mass.)，選擇標記的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易掌握的。宿主細胞胞，優(yōu)選為酵母細胞。除了經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞本身外，本發(fā)明還包括這些細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，優(yōu)選為單克隆(克隆均一)的培養(yǎng)物，或衍生自單克隆培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。如果多肽被分泌出來，培養(yǎng)基中會含有多肽與細胞，或者經(jīng)過濾或離心后不含細胞，僅含多肽。用于實施本發(fā)明的宿主細胞包括能被外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染、并能在培養(yǎng)基中生長的真核細胞，有些情況下也包括原核細胞，例如，經(jīng)培養(yǎng)的哺乳動物、昆蟲、真菌、植物和細菌細胞。真菌細胞，包括酵母類(例如糖酵母，裂殖糖酵母，畢赤氏酵母)可用作本發(fā)明的宿主細胞。預期可在本發(fā)明的實踐中用作宿主以表達本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白的酵母屬例子有畢赤氏酵母(以前被分類為漢遜氏酵母)，糖酵母，克魯維氏酵母，曲霉，假絲酵母，球擬酵母，有孢圓酵母，裂殖糖酵母，固嚢酵母，Pac/z，"o/em接合糖酵母，德巴利氏酵母，木霉，頭孢，腐質(zhì)審,毛零,4連孑包審，K3rovWa，4每奇酵母,纟工冬孑包,Z^wccw/on'(iz'w附,5c^yoasct^，鎖扭P酵母,五"domyco/j^s等。4唐酵母的例子有酉良酒酵母,意大利糖酵母和魯氏糖酵母。克魯維氏酵母的例子有脆壁克魯維氏酵母，乳克魯維氏酵母和馬克斯克魯維氏酵母。適當?shù)挠墟邎A酵母是戴爾凱氏有孢圓酵母。畢赤氏酵母(漢遜氏酵母)的例子是Pa"gwto(以前被稱為多形漢遜氏酵母)，Pa"owa/a(以前被稱為異常漢遜氏酵母)和巴斯德畢赤氏酵母。對于產(chǎn)生本發(fā)明的Tf融合蛋白特別有用的宿主細胞是曱醇營養(yǎng)型巴斯德畢赤氏酵母(Steinlein等，(1995)尸ra^'"五x;^^s.Pwn/6:619-624)。因其醇氧化酶啟動子已被分離和克隆，巴斯德畢赤氏酵母已被開發(fā)成一個用于產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的優(yōu)越宿主；1985年首次報道了巴斯德畢赤氏酵母的轉(zhuǎn)化。缺乏葡萄糖時，巴斯德畢赤氏酵母可利用甲醇作為碳源。巴斯德畢赤氏酵母表達系統(tǒng)可使用曱醇-誘導的醇氧化酶(AOXl)啟動子，該啟動子能控制編碼醇氧化酶表達的基因，所述酶可催化曱醇代謝中的第一步。已鑒定出該啟動子，并將其摻入一系列巴斯德畢赤氏酵母表達載體中。由于巴斯德畢赤氏酵母中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)一般能正確折疊并分泌至培養(yǎng)基中，因此，發(fā)酵經(jīng)基因工程改造的巴斯德畢赤氏酵母即可提供極好的大腸桿菌表達系統(tǒng)替代物。使用該系統(tǒng)已制備出多種蛋白質(zhì)，包括破傷風毒素片斷，百日咳桿菌pertactin，人血清白蛋白和溶菌酶。例如，可按Malardier等，(1989)Gene78:147-156所述進行尖孢鐮孢(F釀酒酵母菌抹是另一種優(yōu)選的宿主。在優(yōu)選實施方案中，使用了在糖蛋白的與天冬酰胺-有聯(lián)系的糖基化所需基因中含有基因缺陷的酵母細胞，或更具體地為釀酒酵母宿主細胞。使用標準的突變和選擇技術(shù)即可制備具有所述缺陷的釀酒酵母宿主細胞，但是，也有很多可以獲得的酵母菌林已被修飾，可防止或降低糖基化或高甘露糖基化。Ballou等，(J.Biol.Chem.255:5986-5991，1980)描述了甘露糖蛋白生物合成突變體的分離，所述突變體的基因有缺陷，影響到與天冬酰胺-有聯(lián)系的糖基化。為了最優(yōu)化異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，也優(yōu)選宿主菌林攜有突變，如釀酒酵母pep4突變(Jones,Genetics85:23-33，1977)，所述突變導致蛋白酶解活性降低。在其它蛋白酶編碼區(qū)中含有突變的宿主菌林對于大量生產(chǎn)本發(fā)明的Tf融合蛋白特別有用。在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的宿主細胞。本文所用術(shù)語"適當?shù)纳L培養(yǎng)基"指的是含有細胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。細胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)可包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和生長因子。生長培養(yǎng)基一般通過例如藥物選擇或必需營養(yǎng)物質(zhì)的缺陷來選擇含有DNA構(gòu)建體的細胞，所述缺陷由位于DNA構(gòu)建體上或與DNA構(gòu)建體一起被共轉(zhuǎn)染的選擇標記補償。例如，優(yōu)選在化合物確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母細胞，所述培養(yǎng)基含有非-氨基酸氮源、無機鹽、維生素和必需氨基酸補劑。優(yōu)選將培養(yǎng)基的pH維持在pH大于2小于8,優(yōu)選為pH6.5。維持穩(wěn)定pH的方法包括緩沖和恒定pH控制，優(yōu)選通過添加氫氧化鈉。優(yōu)選的緩沖劑包括琥珀酸和Bis陽Tris(SigmaChemicalCo.，St.Louis,Mo.)。優(yōu)選在含有滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)與天冬酰胺-有聯(lián)系的糖基化所需基因中具有缺陷的酵母細胞。優(yōu)選的滲透穩(wěn)定劑是以0.1M至1.5M,優(yōu)選為0.5M或l.OM的濃度添加至培養(yǎng)基中的山梨醇。一般在市售的含血清或不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)培養(yǎng)的哺乳動物細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易選擇適用于所用的特定細胞系的培養(yǎng)基。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞培養(yǎng)一段時間，一般為1-2天以開始表達所需的DNA序列。然后使用藥物選擇以選擇出以穩(wěn)定形式表達選擇標記的細胞的生長。對于已被可擴增選擇標記轉(zhuǎn)染的細胞而言，可逐步增加藥物濃度以選擇出拷貝數(shù)有所增加的克隆序列，從而提高表達水平。也可以使用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)來生產(chǎn)本發(fā)明的經(jīng)修飾Tf融合蛋白。BacPAKTM桿狀病毒表達系統(tǒng)(BDBiosciences(Clontech))在昆蟲宿主細胞中高水平表達重組蛋白質(zhì)。將靶基因插入轉(zhuǎn)移載體，所述載體與線性化的BacPAK6病毒DNA—起被共轉(zhuǎn)染至昆蟲宿主細胞。BacPAK6DNA缺失桿狀病毒基因組的必需部分。當DNA與載體重組時，可恢復必需元件，耙基因被轉(zhuǎn)移至桿狀病毒基因組。重組之后，挑選幾個病毒噬斑并純化之，證實重組表型。然后擴增新分離的重組病毒，并用于感染昆蟲細胞培養(yǎng)物以產(chǎn)生大量所需蛋白質(zhì)。分泌信號序列術(shù)語"分泌信號序列，，或"信號序列，，或"分泌前導序列"可以互換使用，其描述于例如美國專利6,291,212和美國專利5,547，871(皆全文列入本文作為參考)。分泌信號序列或信號序列或分泌前導序列編碼分泌肽。分泌肽是能介導成熟多肽或蛋白質(zhì)從細胞中分泌出來的氨基酸序列。一般說來，分泌肽的特征在于疏水氨基酸核心，它一般(也不排除其它情況)出現(xiàn)于新合成蛋白質(zhì)的氨基末端。分泌肽經(jīng)常在分泌過程中從成熟的蛋白質(zhì)上裂解下來。分泌肽可含有當可以使用分泌肽介導本發(fā)明的經(jīng)修飾Tf融合蛋白的分泌。一種可以與其它分泌肽聯(lián)合使用的分泌肽是酵母屏障蛋白的第三結(jié)構(gòu)域。分泌信號序列或信號序列或分泌前導序列是一系列復雜的、導致蛋白質(zhì)分泌的翻譯后加工步驟所必需的。如果存在完整的信號序列，被表達的蛋白質(zhì)進入粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔，然后通過高爾基體轉(zhuǎn)運至分泌載體，最終運送至細胞外。一般說來，信號序列緊接在起始密碼子之后，并在待分泌蛋白質(zhì)的氨基末端編碼信號肽。在大多數(shù)情況下，通過特定的蛋白酶，即信號肽酶裂解信號序列。優(yōu)選信號序列能改善使用病毒、哺乳動物或酵母表達載體的重組蛋白質(zhì)表達的加工和輸出效率。在一些情況下，可以使用天然Tf信號序列表達和分泌本發(fā)明的融合蛋白。接頭本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白的Tf組成成分和治療性蛋白質(zhì)組成成分可以直接融合，或者使用多種長度的接頭肽使兩者融合，以提供較大的物理間距，使融合蛋白質(zhì)之間的空間靈活性更大，從而最大化治療性蛋白質(zhì)部分的易靠近性，例如，用于與其關(guān)聯(lián)受體結(jié)合。接頭肽可由柔性或更剛性的氨基酸組成。例如，接頭可以是例如但不限于一段聚-甘氨酸序列。接頭可以少于約50,40，30，20或IO個氨基酸殘基。接頭可以在運鐵蛋白或其部分和治療性蛋白質(zhì)之間與它們共價連接。檢測Tf融合蛋白檢測有生物活性的、經(jīng)修飾運鐵蛋白-治療性蛋白質(zhì)融合蛋白的試驗包括Western轉(zhuǎn)移、蛋白質(zhì)印跡或菌落濾膜以及檢測融合治療性蛋白質(zhì)的基于活性的試驗。使用Towbin等，(尸rac.A^/.爿co^,5W.76:4350-4354,1979)所述的方法可以制備Western轉(zhuǎn)移濾膜。簡單地說，在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳樣品。將凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜。通過使用例如Minifold(Schleicher&Schuell，Keene，N.H.)的硝酸纖維素濾膜過濾上清液樣品或濃縮物，即可制備蛋白質(zhì)印跡濾膜。通過在涂抹了適當生長培養(yǎng)基的硝酸纖維素濾膜上培養(yǎng)菌落，即可制備菌落濾膜。在此方法中，優(yōu)選固體培養(yǎng)基。使細胞在濾膜上培養(yǎng)至少12小時。通過用適當緩沖液沖洗從濾膜上除去細胞，所述緩沖液不會除去與濾膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的緩沖液含有25mMTris-base，19mM甘氨酸，pH8.3，20%曱醇。通過分析治療性蛋白質(zhì)組成成分的活性也可^f企測本發(fā)明的融合蛋白。所述試驗是容易實施的，包括但不限于表1所述的試驗。具體地說，可以使用表l"例舉的活性試驗"一欄中提及的試驗，來分析本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的功能活性(例如生物活性或治療活性)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用表1相應行中提及的試驗，常規(guī)檢測對應于本發(fā)明融合蛋白之治療性蛋白質(zhì)部分的治療性蛋白質(zhì)片斷的活性。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域已知的試驗常規(guī)檢測經(jīng)修飾運鐵蛋白之片斷的活性。例如，在一個檢測本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白結(jié)合或與治療性蛋白質(zhì)竟爭結(jié)合抗-治療性多肽抗體和/或抗-運鐵蛋白抗體之能力的實施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的多種免疫測定法，包括但不限于竟爭性和非-竟爭性檢測系統(tǒng)，所述系統(tǒng)使用了如下技術(shù)放射性免疫測定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)、夾心免疫測定法、免疫放射分析、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散分析、原位免疫測定法(使用例如膠體金、酶或放射性同位素標記)、western印跡、沉淀反應、凝集試驗(如凝膠凝集試驗)、補體固定試驗、免疫焚光試驗、A蛋白試驗和免疫電泳試驗等。在一個實施方案中，通過檢測第一抗體上的標記來檢測抗體結(jié)合。在另一個實施方案中，通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結(jié)合來檢測第一抗體。在另一個實施方案中，對第二抗體進行標記。在免疫測定法中檢測結(jié)合的多種方法是本領(lǐng)域已知的，它們也落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在另一個實施方案中，當鑒定出治療性蛋白質(zhì)的結(jié)合配對物(如受體或配體)時，通過本領(lǐng)域眾所周知的方法可纟企測含有該治療性蛋白質(zhì)作為融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的運鐵蛋白融合蛋白與所述結(jié)合配對物的結(jié)合，所述方法如還原和非-還原的凝膠層析、蛋白質(zhì)親合層析和親和印跡。其它方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并且落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。分離/純化經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白在允許有生物活性的融合蛋白分泌的條件下培養(yǎng)宿主細胞，從其培養(yǎng)基中分離被分泌的、有生物活性的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白。從培養(yǎng)基中除去細胞材料，使用本領(lǐng)域已知的分離技術(shù)分離出有生物活性的融合蛋白。適當?shù)姆蛛x技術(shù)包括沉淀和通過多種層析法的分級分離，所述層析法包括凝膠過濾、離子交換層析和親合層析。特別優(yōu)選的純化方法是在鐵結(jié)合或金屬鰲合柱上進行的親合層析，或使用抗體的免疫親合層析，所述抗體抗運鐵蛋白或治療性蛋白質(zhì)或多肽融合物的肽部分。優(yōu)選使抗體固定或結(jié)合于固體支持物或底物。特別優(yōu)選的底物是CNBr-活化的Sepharose(PharmaciaLKBTechnologies,Inc.,Piscataway,N丄)。通過此方法，在允許發(fā)生結(jié)合的條件下將培養(yǎng)基與抗體/底物混合。沖洗復合物以除去未結(jié)合的物質(zhì)，通過使用不利于復合物形成的條件釋放或洗脫運鐵蛋白融合蛋白。特別有用的洗脫方法包括改變pH，其中固定化抗體在第一個pH下對配體具有高親和性，而在第二個(較高或較低)pH下親和性降低；改變某個離液劑的濃度；或使用去污劑。被標記的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白也可以用放射性同位素或其它顯像劑標記本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白，并將其用于體內(nèi)診斷目的。優(yōu)選的放射性同位素顯像劑包括碘-125和鍀-99,特別優(yōu)選的是鍀-99。產(chǎn)生蛋白質(zhì)-同位素偶聯(lián)物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，其描述于例如Eckelman等，(美國專利4,652,440),Parker等，(WO87/05030)和Wilber等，(EP203,764)。或者，運鐵蛋白融合蛋白可與自旋標記增強劑結(jié)合，并用于磁共振(MR)成像。適當?shù)淖孕龢擞浽鰪妱┌ǚ€(wěn)定的、有空間位阻的、自由基化合物，如硝基氧。標記配體以進行MR成像的方法描述于例如Coffman等，(美國專利4,656,026)。為了進行給藥，可將經(jīng)標記的運鐵蛋白融合蛋白與藥物可接受載體或稀釋劑，如無菌鹽水或無菌水混合。優(yōu)選通過造影劑注射，優(yōu)選為靜脈內(nèi)注射進行給藥。制備融合蛋白本發(fā)明還提供了使用本文所述的核酸分子制備本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白的方法。一般說來，制備重組形式的蛋白質(zhì)一般包括下述步驟。首先需獲得編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的核酸分子。然后優(yōu)選使所述核酸分子與上文所述的適當控制序列可操作相連，以形成含有蛋白質(zhì)開放閱讀框的表達單位。使用所述表達單位轉(zhuǎn)化適當宿主，并在允許產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主。任選從培養(yǎng)基或細胞中分離重組蛋白質(zhì)；在允許有一些雜質(zhì)存在的情況下，蛋白質(zhì)的回收和純化不是必需的?？梢杂枚喾N方法完成上述步驟中的每一步。例如，使用如上所述的適當復制子和控制序列完成可在多種宿主中使用的表達載體的構(gòu)建?？刂菩蛟谏衔闹性敿氂懻撨^，或已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知?？梢栽诰幋a序列的末端添加適當?shù)南拗菩晕稽c(如果該位點一般不是現(xiàn)成的)，以提供可切下的基因插入這些載體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地改動本領(lǐng)域已知的任何宿主/表達系統(tǒng)，以與本發(fā)明的核酸分子聯(lián)合使用，產(chǎn)生所需的重組蛋白質(zhì)。如上所述，可以使用任何表達系統(tǒng)，包括酵母、細菌、動物、植物、真核和原核系統(tǒng)。在一些實施方案中，優(yōu)選酵母、哺乳動物細胞培養(yǎng)物和轉(zhuǎn)基因動物或植物生產(chǎn)系統(tǒng)。在其它實施方案中，可以使用經(jīng)修飾降低了天然酵母糖基化、高-糖基化或蛋白酶解活性的酵母系統(tǒng)。治療性分子在本發(fā)明的方法和組合物中，任何治療性分子都可用作Tf的融合配對物。本文所用的治療性分子一般為能在體外或體內(nèi)發(fā)揮有利生物學作用的蛋白質(zhì)或肽，包括能發(fā)揮與正常穩(wěn)態(tài)、生理學或疾病狀態(tài)相關(guān)的有利作用的蛋白質(zhì)或肽。治療性分子不包括常用作標記或蛋白質(zhì)純化輔助物的融合配對物，例如半乳糖苷酶(參見例如美國專利5,986,067和Aldred等，(1984)說oc/ze肌所op/z^.Cowm,.122:960-965)。例如，與疾病狀態(tài)有關(guān)的有利作用包括對治療受試者有利的任何作用，包括疾病預防、疾病穩(wěn)定化、減輕或緩和疾病癥狀或調(diào)節(jié)、緩和或治愈潛在缺陷以產(chǎn)生對被治療的受試者有利的作用。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白至少包括治療性蛋白質(zhì)的片斷或變體以及經(jīng)修飾血清運鐵蛋白的片斷或變體，優(yōu)選通過基因融合或化學偶聯(lián)使兩者彼此相連。在一個實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白包括與神經(jīng)藥劑相連的經(jīng)修飾運鐵蛋白分子。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白包括羧基末端與神經(jīng)藥劑的氨基末端相連的運鐵蛋白。在可替代的實施方案中，經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白包括氨基末端與神經(jīng)藥劑的羧基末端相連的運鐵蛋白。在具體實施方案中，神經(jīng)藥劑是神經(jīng)生長因子或睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。在另一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白至少含有治療性蛋白質(zhì)的片斷或變體，和/或抗體片斷或變體。在其它實施方案中，運鐵蛋白融合蛋白可含有蛋白質(zhì)或抗體的肽片斷或肽變體，其中變體或片斷保留了至少一種生物學或治療活性。運鐵蛋白融合蛋白可含有長度為至少約4，至少5,至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11,至少12,至少13,至少14，至少15,至少20,至少25,至少30，至少35，或至少約40,至少約50,至少約55，至少約60或至少約70或更多個氨基酸的、與經(jīng)修飾運鐵蛋白的N和/或C末端融合、插入其中、或插入其環(huán)中的肽片斷或肽變體作為治療性蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合分子含有可以是治療性蛋白質(zhì)片斷的治療性蛋白質(zhì)部分，它包括全長蛋白質(zhì)以及從氨基酸序列的氨基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合分子含有可以是治療性蛋白質(zhì)片斷的治療性蛋白質(zhì)部分，它包括全長蛋白質(zhì)以及從氨基酸序列的羧基末端缺失了一個或多個殘基的多肽。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合分子含有可以治療性蛋白質(zhì)部分，所述部分從氨基和羧基末端缺失了一個或多個氨基酸。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合分子含有治療性蛋白質(zhì)部分，所述部分與本文所述的參照治療性蛋白質(zhì)或其片斷至少約80%,85%,90%，95%,96%，97%,98%或99%相同。在另一個實施方案中，運鐵蛋白融合分子含有治療性蛋白質(zhì)部分，所述部分與上文所述的氨基酸序列N-和C-末端有缺失的參照多肽至少約80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合分子含有治療性蛋白質(zhì)部分，所述部分與例如治療性蛋白質(zhì)的天然或野生型氨基酸序列至少約80%，85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同。通過與一個或多個寡糖基團結(jié)合，可以修飾對應于本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的治療性蛋白質(zhì)，如細胞表面和分泌蛋白質(zhì)。被稱為糖基化的修飾可顯著影響蛋白質(zhì)的物理特性，對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、分泌和定位也是至關(guān)重要的。糖基化在沿著多肽主鏈的特定位置發(fā)生。通常有兩種主要的糖基化形式特征在于O-聯(lián)寡糖的糖基化，所述寡糖與絲氨酸或蘇氨酸殘基結(jié)合；以及特征在于N-聯(lián)寡糖的糖基化，所述寡糖與Asn-X-Ser/Thr序列中的天冬酰胺殘基結(jié)合，其中X可以是除脯氨酸外的氨基酸。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和細胞類型的變化影響鏈內(nèi)不同糖基化位點的糖類單位的數(shù)目和特性。在給定細胞類型內(nèi)，相同位點處也能常常見到糖基化異構(gòu)體。例如，幾種類型的人干擾素被糖基化?？梢孕揎棇诒景l(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的治療性蛋白質(zhì)及其類似物和變體，使得作為由表達它們的宿主細胞操縱其核酸序列的結(jié)果，或因其其它的表達條件導致一個或多個位點處的糖基化有所改變。例如，通過廢除或?qū)胩腔稽c，如通過取代或缺失氨基酸殘基，如用谷氨酰胺取代天冬酰胺即可產(chǎn)生糖基化異構(gòu)體，或者，可以通過在不會使其糖基化的宿主細胞，如糖基化有缺陷的酵母中表達蛋白質(zhì)，即可產(chǎn)生非糖基化的重組蛋白質(zhì)。這些方法是本領(lǐng)域已知的。治療性蛋白質(zhì)及其核酸序列是本領(lǐng)域眾所周知的，可得自公共數(shù)據(jù)庫，^口ChemicalAbstractsServicesDatabases(i口CASRegistry),GenBank禾口GenSeq。下文提及的登錄號和序列都全文列入本文作為參考。在其它實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白具有對應于表1相應欄和本申請其它地方所述的治療性蛋白質(zhì)之治療活性和/或生物活性的治療活性和/或生物活性(參見例如表1的"生物活性，，和"治療性蛋白質(zhì)X"欄)。在其它實施方案中，本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的治療活性蛋白質(zhì)部分是本文所述參照序列的片斷或變體。本發(fā)明還涉及含有本文所述的治療性蛋白質(zhì)片斷的經(jīng)修飾Tf融合蛋白。即使從蛋白質(zhì)的N-末端缺失一個或多個氨基酸會導致治療性蛋白質(zhì)部分的一種或多種生物學功能的修飾或丟失，但仍會保留其它治療活性和/或功能活性(如生物活性、多聚化的能力、結(jié)合配體的能力)。例如，從N-末端除去完整多肽的少部分殘基后，N-末端有缺失的多肽誘導和/或結(jié)合能識別完整或成熟形式之多肽的抗體的能力一般仍能保留下來。通過本文所述和本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，可以測定缺乏完整多肽的N-末端殘基的特定多肽是否仍能保留所述免疫學活性。N-末端缺失了大量氨基酸殘基的突變體也有可能保留一些生物學或免疫學活性。實際上，由少至6個氨基酸殘基組成的肽經(jīng)常能引發(fā)免疫應答。如上所述，即使從治療性蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端缺失一個或多個氨基酸會導致蛋白質(zhì)一種或多種生物學功能的修飾或丟失，但仍會保留其它功能活性(如生物活性、多聚化的能力、結(jié)合配體的能力)和/或治療活性。例如，從C-末端除去完整或成熟多肽的少部分殘基后，C-末端有缺失的多肽誘導和/或結(jié)合能識別完整或成熟形式之多肽的抗體的能力一般仍能保留下來。通過本文所述和/或本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，可以容易地測定缺乏參照多肽的N-末端和/或C-末端殘基的特定多肽是否仍能保留治療活性。治療性蛋白質(zhì)的肽片斷可以是片斷，所述片斷含有能顯示出衍生得到該片斷的治療性蛋白質(zhì)之多肽序列的治療活性和/或功能活性(如生物活性)的氨基酸序列，或由所述序列組成。其它多肽片斷是生物活性片斷。生物活性片斷是表現(xiàn)出與本發(fā)明所用治療性蛋白質(zhì)的活性相似、但不必相同之活性的片斷。片斷的生物活性可包括改善的合乎需要的活性或降低的不必要的活性。一般說來，蛋白質(zhì)的變體整體上非常類似，在很多區(qū)域都與對應于本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白之治療性蛋白質(zhì)部分的治療性蛋白質(zhì)的氨基酸序列相同。本發(fā)明也包括編碼這些變體的核酸。本發(fā)明可以使用的其它治療性多肽是由在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的嚴緊雜交條件下能與編碼治療性蛋白質(zhì)氨基酸序列之核酸分子的互補序列雜交的多核苦酸編碼的多肽。(參見例如Ausubel,F.M.等，eds.,l兆9CurrentprotocolinMolecularBiology,GreenPublishingAssociates,Inc.,andJohnWiley&SonsInc.,New.York)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。具有與本發(fā)明的問題氨基酸序列至少例如95%"相同的"氨基酸序列的多肽指的是除了受試多肽序列可在問題氨基酸序列的每100個氨基酸中包括多達5個氨基酸改變外，受試多肽的氨基酸序列與問題序列相同。換句話說，為了獲得具有與問題氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽，受試序列中多達5%的氨基酸殘基可被插入、缺失或用另一種氨基酸取代。參照序列的這些改變可發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或發(fā)生在所述末端位置之間的任何位置，或單個散布于參照序列的殘基中，或散布于參照序列內(nèi)的一個或多個鄰近基團中。在實踐中，使用已知的計算機程序可以常規(guī)測定任何特定多肽是否與例如，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白或其片斷(例如運鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分或運鐵蛋白融合蛋白的運鐵蛋白部分)的氨基酸序列至少約80%,85%,90%，95%,96%,97%,98%或99%相同。使用基于Bmfiag-等,(Comp.App.Biosci245-(1990))之算法的FASTDB計算機程序，即可確定測定問題序列(本發(fā)明的序列)和受試序列之間的最佳全面匹配的優(yōu)選方法，所述方法也^皮稱為完全序列比對。本發(fā)明的多核苷酸變體可在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或這兩處含有改變?？梢允褂煤懈淖兊亩嗪塑账嶙凅w制備經(jīng)修飾的Tf融合蛋白，所述改變能產(chǎn)生沉默的取代、添加或缺失，但不會改變所編碼多肽的特性或活性?？梢岳靡蜻z傳密碼簡并性所致的沉默取代產(chǎn)生的核苷酸變體。另外，可以利用以任意組合取代、缺失或添加了少于約50，少于40,少于30,少于20，少于10，或5-50,5-25,5-10，1-5或1-2個氨基酸的多肽變體。產(chǎn)生多核苷酸變體的原因可以有多個，例如針對特定宿主最優(yōu)化密碼子的表達(將人mRNA的密碼子改變?yōu)楸簧鲜鏊拗鳎缃湍富虼竽c桿菌優(yōu)選的密碼子)。在其它實施方案中，與野生型序列相比，治療性蛋白質(zhì)組成成分具有保守取代。"保守取代"欲指組內(nèi)交換，如脂肪族或疏水氨基酸Ala，Val，Leu和Ile的取代；羥基殘基Ser和Thr的取代；酸性殘基Asp和Glu的取代；酰胺殘基Asn和Gln的取代；堿性殘基Lys、Arg和His的取代；芳香族殘基Phe、Tyr和Trp的取代；和小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的取代。例如，Bowie等在"DecipheringtheMessageinProteinSequences:TolerancetoAminoAcidSubstitutions,"Science247:1306-1310(1990)中提供了有關(guān)如何進行表型沉默的氨基酸取代的指導。在具體實施方案中，本發(fā)明的多肽含有本文所述治療性蛋白質(zhì)和/或運鐵蛋白，和/或本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白的氨基酸序列的片段或變體，或由所述片段或變體組成，其中當與參照氨基酸序列相比時，所述片段或變體具有l(wèi)-5，5-10，5-25，5-50,10-50或50-150個氨基酸殘基的添加、取代和/或缺失。在其它實施方案中，氨基酸取代是保守的。本發(fā)明還包括編碼這些多肽的核酸。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白由通過肽鍵或經(jīng)修飾肽鍵彼此連接的氨基酸組成，它可含有除20個基因-編碼氨基酸以外的氨基酸?？梢酝ㄟ^任一種天然方法，例如翻譯后加工，或通過本領(lǐng)域眾所周知的化學修飾技術(shù)來修飾多肽?；A(chǔ)教材和更詳細的專題著作以及多巻研究文獻中詳細描述了所述修飾。修飾可發(fā)生在多肽的任何位置，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。應理解在給定多肽的幾個位點處，存在相同或不同程度的相同類型的修飾。給定多肽也可含有很多種修飾。多肽也可以因為例如遍在蛋白化而出現(xiàn)分支，它們也可以是分支或不分支的環(huán)形分子。環(huán)形、分支、以及分支環(huán)形多肽可以由翻譯后的天然加工過程獲得，也可以由合成方法制備。修飾包括乙?；?、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、與黃素共價結(jié)合、與血紅素組成成分共價結(jié)合、與核苷酸或核苷酸衍生物共價結(jié)合、與脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物共價結(jié)合、與phosphotidylinositol共價結(jié)合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去曱基化、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、prenylation、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硫酸鹽化、蛋白質(zhì)中由轉(zhuǎn)運-RNA介導的氨基酸添力。，如精氨?；捅樵诘鞍谆?參見例如Proteins-StructureandMolecularProperties,2ndEd.，T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993);POST-TRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS,B.C.Johnson,Ed"AcademicPress,New'York,pgs.1-12(1983);Seifter等(1990)Me仇五"^mo/.182:626-646;Rattan等，爿朋.」cad5W.663:48-62?？梢耘cTf融合或插入Tf中的治療性分子包括但不限于激素、基質(zhì)蛋白質(zhì)、免疫抑制劑、支氣管擴張藥、心血管藥劑、酶、CNS藥劑、神經(jīng)遞質(zhì)、受體蛋白質(zhì)或肽、生長激素、生長因子、抗病毒肽、融合抑制肽、細胞因子、淋巴因子、單核因子、白細胞介素、集落刺激因子、分化因子、血管生成因子、受體配體、癌癥-相關(guān)蛋白、抗腫瘤劑、病毒肽、抗菌肽、血液蛋白質(zhì)、拮抗劑蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、抗-血管生成因子、拮抗劑蛋白質(zhì)或肽、受體拮抗劑、抗體、單鏈抗體和細胞粘附分子。不同的治療性分子可與單個融合蛋白混合以產(chǎn)生雙或多功能的治療性分子。也可以聯(lián)合使用不同的分子以產(chǎn)生具有治療實體和靶向?qū)嶓w的融合蛋白。細胞因子是由免疫系統(tǒng)的細胞釋放的可溶性蛋白質(zhì)，它通過特定的受體發(fā)揮非酶解作用以調(diào)節(jié)免疫應答。細胞因子與激素的相似之處在于它們能在低濃度下起作用，以高親和性與特定受體結(jié)合。本文所用術(shù)語"細胞因子"用于描述能在具有該細胞因子的受體的細胞中引發(fā)特異性生物反應的天然或重組的蛋白質(zhì)，及其類似物和片段。細胞因子優(yōu)選包括白細胞介素，如白細胞介素-2(IL-2)(GenBank登錄號S77834),IL-3(GenBank登錄號M14743)，IL-4(GenBank登錄號M23442),IL-5(GenBank登錄號J03478)，IL-6(GenBank登錄號M14584),IL-7(GenBank登錄號NM—000880),IL-10(GenBank登錄號NM—000572)，IL-12(GenBank登錄號AF180562和GenBank登錄號AF180563),IL-13(GenBank登錄號U10307),IL-14(GenBank登錄號XM—170924),IL-15(GenBank登錄號X91233)，IL-16(GenBank登錄號NM—004513)，IL-17(GenBank登錄號NM—002190)和IL-18(GenBank登錄號NM—001562),造血因子，如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(GenBank登錄號X03021),粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(GenBank登錄號X03656),血小板活化因子(GenBank登錄號NM—000437)和促紅細胞生成素(GenBank登錄號X02158)，腫瘤壞死因子(TNF)如TNFot(GenBank登錄號X02910),淋巴因子，如淋巴毒素-a(GenBank登錄號X02911)，淋巴毒素-P(GenBank登錄號L11016)，白細胞調(diào)節(jié)素，巨噬細胞遷移抑制因子(GenBank登錄號M25639)，和神經(jīng)白細胞素(GenBank登錄號K03515),代謝過程調(diào)節(jié)劑，如leptin(GenBank登錄號U43415)，干擾素，如干擾素a(IFNot)(GenBank登錄號M54886)，IFN(3(GenBank登錄號V00534)，IFNy(GenBank登錄號J00219)，IFNo(GenBank登錄號NMJ)02177),血小板反應蛋白1(THBSl)(GenBank登錄號NM—003246)，THBS2(GenBank登錄號L12350),THBS3(GenBank登錄號L38969),THBS4(GenBank登錄號NM—003248)和趨化因子。優(yōu)選本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白-細胞因子融合蛋白顯示出細胞因子生物活性。本文所用術(shù)語"激素"用于描述多種生物活性物質(zhì)中的任一種，所述物質(zhì)由某種細胞或組織產(chǎn)生，并能導致位于身體別處的另一種細胞或組織產(chǎn)生特異性生物學變化或活性。優(yōu)選激素包括胰島素原(GenBank登錄號V00565)，胰島素(GenBank登錄號NM—000207),生長激素l(GenBank登錄號V00520)，生長激素2(GenBank登錄號F006060)，生長激素釋放因子(GenBank登錄號NM—021081)，胰島素-樣生長因子I(GenBank登錄號M27544)，胰島素-樣生長因子II(GenBank登錄號NM—000612)，胰島素-樣生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-l)(GenBank登錄號M59316),IGFBP-2(GenBank登錄號X16302)，IGFBP-3(GenBank登錄號NM—000598),IGFBP-4(GenBank登錄號Y12508)，IGFBP-5(GenBank登錄號M65062)，IGFBP畫6(GenBank登錄號畫—002178),IGFBP-7(GenBank登錄號NM—001553)，絨毛膜促性腺素P鏈(GenBank登錄號NM—033142)，絨毛膜促性腺素a鏈(GenBank登錄號NM—000735)，促黃體素卩(GenBank登錄號X00264),促濾泡激素p(GenBank登錄號NM—000510)，促曱狀腺素(3(GenBank登錄號NM—000549)，促乳素(GenBank登錄號NM—000948),阿黑皮素原(GenBank登錄號V01510)，促腎上腺皮質(zhì)素(ACTH),(3-促脂解素，a-促黑激素(ot-MSH),y-促脂解素，p-MSH，(3-內(nèi)啡肽和中間葉促皮質(zhì)樣肽(CLIP)。本文所用術(shù)語"生長因子"用于描述任何與受體結(jié)合以促進細胞增殖的蛋白質(zhì)或肽。生長因子優(yōu)選包括血小板-衍生生長因子-a(PDGF-a)(GenBank登錄號X03795)，PDGF-P(GenBank登錄號X02811)，類固醇激素，表皮生長因子(EGF)(GenBank登錄號NM—001963)，成纖維細胞生長因子，如成纖維細胞生長因子l(FGFl)(GenBank登錄號NM—000800),FGF2(GenBank登錄號NM—002006)，F(xiàn)GF3(GenBank登錄號NM—005247)，F(xiàn)GF4(GenBank登錄號NM—002007)，F(xiàn)GF5(GenBank登錄號M37825),FGF6(GenBank登錄號X57075)，F(xiàn)GF7(GenBank登錄號NM_002009),FGF8(GenBank登錄號AH006649)，F(xiàn)GF9(GenBank登錄號NM—002010),FGF10(GenBank登錄號AB002097)，F(xiàn)GFll(GenBank登錄號NM—004112)，F(xiàn)GF12(GenBank登錄號NM—021032)，F(xiàn)GF13(GenBank登錄號NM—004114)，F(xiàn)GF14(GenBank登錄號NM—004115)，F(xiàn)GF16(GenBank登錄號AB009391),FGF17(GenBank登錄號NM—003867)，F(xiàn)GF18(GenBank登錄號AF075292)，F(xiàn)GF19(GenBank登錄號NM—005117),FGF20(GenBank登錄號畫—019851)，F(xiàn)GF21(GenBank登錄號NM—019113)，F(xiàn)GF22(GenBank登錄號NM—020637)和FGF23(GenBank登錄號NM—020638)，血管生成素(GenBank登錄號M11567),腦-衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GenBank登錄號M61176),睫狀神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(GenBank登錄號X60542)，轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGF-a)(GenBank登錄號X70340),TGF-p(GenBank登錄號X02812)，神經(jīng)生長因子-a(NGF-a)(GenBank登錄號NMJ)10915)，NGF-P(GenBank登錄號X52599),金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)(GenBank登錄號NM—003254)，TIMP2(GenBank登錄號NM—003255),TIMP3(GenBank登錄號U02571)，TIMP4(GenBank登錄號U76456)和巨噬細胞刺激因子l(GenBank登錄號L11924)。本文所用術(shù)語"基質(zhì)蛋白質(zhì)"用于描述通常存在于細胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)或肽。這些蛋白質(zhì)對于強度、過濾或粘附功能至關(guān)重要?；|(zhì)蛋白質(zhì)優(yōu)選包括膠原，如"交原I(GenBank登錄號Z74615)，膠原II(GenBank登錄號X16711),膠原III(GenBank登錄號X14420)，膠原IV(GenBank登錄號NM_001845),膠原V(GenBank登錄號NMJ)00393),膠原VI(GenBank登錄號NM一058175),膠原VII(GenBank登錄號L02870),膠原VIII(GenBank登錄號NM_001850)，膠原IX(GenBank登錄號X54412)，膠原X(GenBank登錄號X60382),膠原XI(GenBank登錄號J04177)和膠原XI1(GenBank登錄號U73778)，層粘連蛋白，如LAMA2(GenBank登錄號NM—000426)，LAMA3(GenBank登錄號L34155)，LAMA4(GenBank登錄號NMJ)02290)，LAMBl(GenBank登錄號NM—002291)，LAMB3(GenBank登錄號L25541),LAMCl(GenBank登錄號NM_002293),巢蛋白(GenBank登錄號畫—002508)，oc-tectorin(GenBank登錄號NM—005422)，(3-tectorin(GenBank登錄號NM—058222)和纖連蛋白(GenBank登錄號X02761)。術(shù)語"血液蛋白質(zhì)，，的傳統(tǒng)定義為來源于血漿的蛋白質(zhì)，但目前常由重組方法生產(chǎn)血液蛋白質(zhì)，其包括但不限于天然血清蛋白質(zhì)，其衍生物、片斷和突變體或變體，凝血因子，其衍生物、突變體、變體和片斷(包括因子VII，VIII,IX,X),蛋白酶抑制劑(抗凝血酶3，ot-l抗胰蛋白酶)，尿激酶型纖溶酶激活物，免疫球蛋白，vonWillebrand因子和vonWillebrand突變體，纖連蛋白，血纖蛋白原，凝血酶和血紅蛋白。本文所用術(shù)語"酶"用于描述任何能催化特異性反應，而自身永遠不會被改變或破壞的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類物質(zhì)。酶優(yōu)選包括凝結(jié)因子，如F2(GenBank登錄號XM_170688),F7(GenBank登錄號XM—027508),F8(GenBank登錄號XM—013124)，F(xiàn)9(GenBank登錄號NM—000133)，F(xiàn)10(GenBank登錄號AF503510)等，基質(zhì)金屬蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶I(GenBank登錄號MMPl)(GenBank登錄號NM—002421)，MMP2(GenBank登錄號NM004530)，MMP3(GenBank登錄號NM—002422),MMP7(GenBank登錄號NM—002423)，MMP8(GenBank登錄號NM—002424)，MMP9(GenBank登錄號NM_004994)，MMP10(GenBank登錄號NM_002425)，MMP12(GenBank登錄號NM—002426)，MMP13(GenBank登錄號X75308)，MMP20(GenBank登錄號NM一004771)，腺香脫氨酶(GenBank登錄號NM—000022)，促分裂原活化蛋白激酶，如MAPK3(GenBank登錄號XM—055766),MAP2K2(GenBank登錄號NM—030662)，MAP2K1(GenBank登錄號NM—002755),MAP2K4(GenBank登錄號NM—003010),MAP2K7(AF013588)和MAPK12(NMJ)02969)，激酶，如JNKK1(GenBank登錄號U17743)，JNKK2(GenBank登錄號AF014401)，JAK1(M64174)，JAK2(NM_004972)和JAK3(NM—000215)以及磷酸酶PPM1A(GenBank登錄號NM—021003)和PPM1D(GenBank登錄號NM—003620)。本文所用術(shù)語"轉(zhuǎn)錄因子"用于描述任何參與蛋白質(zhì)編碼基因之轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)或肽。轉(zhuǎn)錄因子包括Spl，Sp2(GenBank登錄號NM—003110)，Sp3(GenBank登錄號AY070137)，Sp4(GenBank登錄號NM—003112),NFYB(GenBank登錄號NM—006166)，Hap2(GenBank登錄號M59079)，GATA-1(GenBank登錄號NM—002049),GATA-2(GenBank登錄號NM_002050)，GATA-3(GenBank登錄號X55122)，GATA-4(GenBank登錄號L34357)，GATA-5，GATA-6(GenBank登錄號薩—005257)，F(xiàn)OG2(畫—012082),Eryf1(GenBank登錄號X17254)，TRPS1(GenBank登錄號NM—014112),NF-E2(GenBank登錄號NM—006163),NF-E3,NF-E4,TFCP2(GenBank登錄號NM_005653)，Oct-l(GenBank登錄號XI3403)，同源框蛋白，如HOXB2(GenBank登錄號NM—002145),HOX2H(GenBank登錄號X16665)，無毛同系物(GenBank登錄號NMJ)05144),抗母體decapentaplegic蛋白，如MADH1(GenBank登錄號NM_005900)，MADH2(GenBank登錄號NM—005901),MADH3(GenBank登錄號NM—005902)，MADH4(GenBank登錄號NMJ)05359)，MADH5(GenBank登錄號AF009678)，MADH6(GenBank登錄號NM—005585)，MADH7(GenBank登錄號NM_005904),MADH9(GenBank登錄號NM—005905),以及轉(zhuǎn)錄蛋白的信號轉(zhuǎn)導物和激活物，如STATl(GenBank登錄號XMJU0893),STAT2(GenBank登錄號NM—005419),STAT3(GenBank登錄號AJ012463)，STAT4(GenBank登錄號NM_003151)，STAT5(GenBank登錄號L41142)和STAT6(GenBank登錄號麗一003153)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，治療性分子是非-人或非-哺乳動物蛋白質(zhì)。例如，優(yōu)選HIVgpl20，HIVTat，其它病毒(如肝炎病毒、皰療病毒、流感病毒、腺病毒和RSV)的表面蛋白，其它HIV組分，寄生蟲表面蛋白，如疾疾抗原，以及細菌表面蛋白。這些非-人蛋白質(zhì)可用作例如抗原，或因其有用的活性而被使用。例如，治療性分子可以是鏈激酶、葡激酶、尿激酶或其它具有有用酶解活性的蛋白質(zhì)。在可替代的實施方案中，治療性分子是具有生物活性的配體-結(jié)合蛋白。所述配體-結(jié)合蛋白可以例如(l)阻斷細胞表面的受體-配體相互作用；或(2)中和血液液相中分子的生物活性，從而防止其到達細胞靶。在一些實施方案中，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白包括與受體的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的經(jīng)修飾運鐵蛋白分子，所述受體選自，但不限于低密度脂蛋白(LDL)受體，乙?；疞DL受體，肺瘤壞死因子a受體，轉(zhuǎn)化生長因子I3受體，細胞因子受體，免疫球蛋白Fc受體，激素受體，葡萄糖受體，糖脂受體和糖胺聚糖受體。在其它實施方案中，配體-結(jié)合蛋白包括CD2(M14362),CD3G(NM—000073)，CD3D(NM000732),CD3E(NM—000733)，CD3Z(J04132)，CD28(NM—006139)，CD4(GenBank登錄號畫—000616),CDlA(GenBank登錄號M28825),CD1B(GenBank登錄號NM—001764),CD1C(GenBank登錄號NM—001765),CDlD(GenBank登錄號NM—001766)，CD80(GenBank登錄號NMJ)05191),GNB3(GenBank登錄號AF501884)，CTLA-4(GenBank登錄號NM_005214)，細胞間粘附分子，如ICAM陽1(NM—000201)，ICAM-2(NM000873),和ICAM-3(NM一002162),肺瘤壞死因子受體，如TNFRSF1A(GenBank登錄號X55313)，TNFR1SFB(GenBank登錄號NMJ)01066)，TNFRSF9(GenBank登錄號NM—001561)，TNFRSF10B(GenBank登錄號NM—003842)，TNFRSFllB(GenBank登錄號NM—002546)和TNFRSF13B(GenBank登錄號NM_006573)，和白細胞介素受體，如IL2RA(GenBank登錄號NM—000417)，IL2RG(GenBank登錄號NM—000206)，IL4R(GenBank登錄號AF421855),IL7R(GenBank登錄號NM—002185),IL9R(GenBank登錄號XM—015989)和IL13R(GenBank登錄號X95302)。優(yōu)選本發(fā)明的Tf-配體-結(jié)合蛋白融合物顯示出配體-結(jié)合蛋白的生物活性。本文所用術(shù)語"癌癥-相關(guān)蛋白"用于描述其表達與癌癥或維持受控細胞生長相關(guān)的蛋白質(zhì)或多肽，例如由腫瘤抑制基因或癌基因編碼的蛋白質(zhì)。癌癥-相關(guān)蛋白可以是pl6(GenBank登錄號AH005371)，p53(GenBank登錄號NM_000546)，p63(GenBank登錄號NM—003722)，p73(GenBank登錄號NM—005427)，BRCAl(GenBank登錄號U14680)，BRCA2(GenBank登錄號NM_000059),CTBP相互作用蛋白(GenBank登錄號U72066),DMBTl(GenBank登錄號NM—004406),HRAS(GenBank登錄號NM—005343),NCYM(GenBank登錄號NM—006316)，F(xiàn)GR(GenBank登錄號NM—005248),myb(GenBank登錄號AF104863)，rafl(GenBank登錄號NM_002880)，erbB2(GenBank登錄號NM—004448)，VAV(GenBank登錄號X16316),c-fos(VGenBank登錄號01512),c-fes(GenBank登錄號X52192)，c-jun(GenBank登錄號NMJ)02228)，MASl(GenBank登錄號M13150)，pim-l(GenBank登錄號M16750),TIFl(GenBank登錄號NM—003852)，c-fms(GenBank登錄號X03663)，EGFR(GenBank登錄號NM—005228),erbA(GenBank登錄號X04707)，c-src酪氨酸激酶(GenBank登錄號XM—044659),c-abl(GenBank登錄號Ml4752)，N-ras(GenBank登錄號X02751),K-ras(GenBank登錄號M54968),jun-B(GenBank登錄號M29039)，c國myc(GenBank登錄號AH001511),RBl(GenBank登錄號M28419)，DCC(GenBank登錄號X76132),APC(GenBank登錄號NM—000038)，NFl(GenBank登錄號M89914)，NF2(GenBank登錄號Y18000)和bcl-2(GenBank登錄號M13994)。本文所用術(shù)語"融合抑制劑肽"用于描述顯示出抗病毒活性，抗-膜融合能力，和/或調(diào)節(jié)細胞內(nèi)過程(如參與巻曲螺旋肽結(jié)構(gòu))之能力的肽?？共《净钚园ǖ幌抻谝种艸IV-1，HIV-2,RSV,SIV,EBV,麻瘆病毒，流感病毒或CMV傳播至非感染細胞。另外，肽的抗融合能力，抗病毒活性或細胞內(nèi)調(diào)節(jié)活性僅需要肽的存在，具體地說，不需要刺激抗所述肽的宿主免疫應答?？谷诤现傅氖窍鄬τ谌狈﹄臅r兩種或多種組成成分之間發(fā)生的膜融合水平而言，所述肽能抑制或降低所述組成成分之間的膜融合事件的水平。組成成分可以是例如細胞膜或病毒結(jié)構(gòu)，如病毒包膜或纖毛。本文所用術(shù)語"抗病毒肽"指的是所述肽能抑制病毒對細胞的感染，或能抑制一些經(jīng)由例如細胞-細胞融合或游離病毒感染的生產(chǎn)性病毒感染和/或病毒病理所需的病毒活性。所述感染可包括發(fā)生于有包膜病毒中的膜融合，或者一些其它的與病毒結(jié)構(gòu)和細胞結(jié)構(gòu)有關(guān)的融合事件。融合抑制劑肽和抗病毒肽常具有得自一種以上病毒蛋白質(zhì)的氨基酸序列(例如得自HIV-1，HIV-2,RSV和SIV的多肽)。融合抑制劑肽和抗病毒肽的例子見于WO94/2820，WO96/19495,WO96/40191，WO01/64013和美國專利6,333,395,6,258,782,6,228,983，6,133,418，6,093,794,6,068,973,6,060,065，6,054,265,6,020,459，6,017,536，6,013,263，5,464,933,5,346,989,5,603,933，5，656，480，5,759,517,6,245,737,6，326,004和6,348，568(皆列入本文作為參考)。在優(yōu)選實施方案中，抗融合肽選自HIVHIVT-1249,RSVT786(VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENVSEQIDNO:5),RSVT1584(AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL,SEQIDNO:6)和RSVT112(VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV,SEQIDNO:7)。其它類型的肽的例子包括本文所述治療性蛋白質(zhì)的片斷，特別是保留了親代分子的至少一種活性的人蛋白質(zhì)片斷。可用于生產(chǎn)本發(fā)明的經(jīng)修飾TF融合蛋白的肽還包括模擬肽和表現(xiàn)出治療性蛋白質(zhì)的生物活性，但序列或三維結(jié)構(gòu)與全長治療性蛋白質(zhì)不同的肽。作為非-限制性的例子，肽包括Johnson等.(2000)TV—ra/.Z)/a/,rra"—W15(9):1274-7,Kuai等.(2000)/尸一.to.56(2):59-62，Barbone等.(1999)TVepW.爆/.rra"—W.14Supp2:80-4，Middleton等.(1999)/祝o/.CTzem.274(20):14163-9，Johnson等.(1998)所oc/^w/W^37(11):3699陽710,Johnson等.(1997)C/zew.12:939-50，Wrighton等,(1997)淑腸tecW.15(12):1261-5,Livnah等.(1996)5W置e273:464-71,和Wrighton等,(1996)5We"ce273:458-64中公開的促紅細胞生成素模擬肽。治療性蛋白質(zhì)還包括過敏原蛋白質(zhì)及其經(jīng)消化的片斷。其包括豚草、黑麥、六月草、果園草、香春(sweetvernal)草、紅頂(redtop)草、梯牧草、黃色闊葉野草、小麥、玉米、蒿屬植物、早熟禾、加利福利亞一年生草、莧、狗牙草、細葉鉀豬毛菜、山雪松、橡樹、羽葉槭、懸鈴木、楓樹、榆樹等的花粉過敏原，塵螨，蜂毒，食物過敏原，動物皮屑和其它昆蟲毒液。其它治療性分子包括微生物疫苗，所述疫苗包括病毒、細菌和原生動物疫苗及其多種組分，如表面抗原。所述疫苗包括含有糖蛋白，蛋白質(zhì)或衍生自這些蛋白質(zhì)的肽的疫苗。所述疫苗制備自金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈J求菌、腦膜炎奈瑟氏^求菌、淋病奈瑟氏^求菌、沙門氏菌、志賀氏菌、大腸桿菌、克雷白氏桿菌、變形菌、霍亂弧菌、彎曲桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、百日咳博德特氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌、嗜肺軍團菌、梅毒密螺旋體、衣原體、破傷風類毒素、白喉類毒素、流感病毒、腺病毒、副粘病毒(腮腺炎病毒，麻滲病毒)、風滲病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、肝炎病毒、皰瘆病毒、狂犬病毒、HIV-1、HIV-2、RSV和乳頭瘤病毒。優(yōu)選的融合分子可含有抗-HIV病毒肽，抗-RSV肽，人生長激素，ot^或(3干擾素，促紅細胞生成素(EPO)，EPO樣肽，粒細胞-集落刺激因子(GCSF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)，胰島素，胰島素-樣生長因子(IGF),血小板生成素，對應于抗體CDR的肽，胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)，降鈣素，制管張素，endostatin，白細胞介素-2，生長激素釋放因子，人曱狀旁腺激素，抗-腫瘤壞死因子(TNF)肽，白細胞介素-l(IL-l)受體和/或單鏈抗體。本發(fā)明的融合蛋白也可被制備成包括得自肽文庫的肽或多肽，以篩選出具有新功能的分子。所述肽文庫包括可商購或能為公眾獲得的肽文庫，例》口AmericanPeptideCo.Inc.,CellSciencesInc.,InvitrogenCorporation,PhoenixPharmaceuticalsInc.,UnitedStatesBiological,以及通過可利用的才支術(shù)產(chǎn)生的肽文庫，如使用標準方法制備的噬菌體和細菌展示文庫。在本發(fā)明的其它實施方案中，可使用本領(lǐng)域已知的治療性蛋白質(zhì)組成成分來制備Tf融合蛋白，由FDA(www.fda.gov/cber/efoi/approve.htm)以及PCT專利公開號WO01/79258,WO01〃7137，WO01〃9442,WO01/79443，WO01/79444和WO01/79480(皆全文列入本文作為參考)最新認可的肽和蛋白質(zhì)即是所述融合蛋白的例子。表l(改編自PCT國際公開號WO01/79444)提供了非窮舉的治療性蛋白質(zhì)列表，所述蛋白質(zhì)對應于本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分。"治療性蛋白質(zhì)X"—欄公開了治療性蛋白質(zhì)分子，其后面的括號中包含學名和商品名，所述分子含有治療性蛋白質(zhì)分子或其片斷或其變體，或由它們組成。本文所用"治療性蛋白質(zhì)X"指的是各個治療性蛋白質(zhì)分子(由得自CAS和Genbank登錄號的氨基酸序列限定)，或指與該欄公開的給定治療性蛋白質(zhì)分子相關(guān)的整組治療性蛋白質(zhì)。"例舉的標識符"一欄提供了ChemicalAbstractsServices(CAS)登錄號(由AmericanChemicalSociety7^開)和/或Genbank登錄號(例如通過網(wǎng)址為www.ncbi.nlm.nih.gov的國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的網(wǎng)頁即可獲得基因座ID，NP-XXXXX(參照序列蛋白質(zhì))，和XP-XXXXX(模型蛋白質(zhì))標識符)，所述登錄號相當于CASRegistry或Genbank數(shù)據(jù)庫的入口，所述數(shù)據(jù)庫含有治療性蛋白質(zhì)分子或其片斷或變體的氨基酸序列。另外，表l還給出GenS叫登錄號和/或期刊出處以鑒定所例舉的一些多肽的氨基酸序列。與所述CAS和Genbank和GenSeq登錄號以及所提及的期刊出版物中的每一個都相關(guān)的摘要頁是可以獲得的(例如PubMedID號(PMID))，其全文列入本文作為參考。PCT/專利參考文獻一欄提供了對應于描述治療性蛋白質(zhì)分子的專利和/或公開的專利申請的美國專利號或PCT國際公開號，它們皆全文列入本文作為參考。生物活性一欄描述了與治療性蛋白質(zhì)分子相關(guān)的生物活性。例舉的活性試驗一欄提供了描述試驗的參考文獻，所述試驗可用于檢測治療性蛋白質(zhì)或含有治療性蛋白質(zhì)X部分的本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白的治療和/或生物活性。這些參考文獻也全文列入本文作為參考。"優(yōu)選適應癥Y"—欄描述了治療性蛋白質(zhì)X或含有治療性蛋白質(zhì)X部分的本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白可以治療、預防、診斷或改善的疾病。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tables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w><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage177</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage178</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage179</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage180</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage183</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage184</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage187</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage188</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage189</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage190</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage191</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage192</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage193</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage194</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage196</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage197</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage198</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage199</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage200</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage201</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage202</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage203</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage204</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage205</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage206</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage207</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage208</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage209</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage210</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage211</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage212</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage213</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage215</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage216</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage217</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage218</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage219</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage220</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage221</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage222</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage223</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage224</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage225</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage226</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage227</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage228</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage229</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage230</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage231</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage232</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage233</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage235</column></row><table>將藥物或治療性蛋白質(zhì)傳遞至細胞內(nèi)部和/或使其穿越血腦屏障(BBB)在本發(fā)明的范圍內(nèi)，經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白可用作載體，用于將與運鐵蛋白的高鐵離子復合的分子或小分子治療劑傳遞至細胞內(nèi)部，或使其穿越血腦屏障。在這些實施方案中，一般需對Tf融合蛋白進行改造或修飾以抑制、防止或消除糖基化，從而延長融合蛋白和/或治療性蛋白質(zhì)部分的血清半壽期。特別希望添加靶向肽或例如單鏈抗體以進一步將Tf融合蛋白耙向至特定的細胞類型，例如癌細胞。在一個實施方案中，將含鐵的抗貧血藥物鐵-山梨醇-檸檬酸鹽復合物負載于本發(fā)明的經(jīng)修飾Tf融合蛋白上。已證實鐵-山梨醇-檸檬酸鹽(FSC)可在體外抑制多種鼠癌細胞的增殖，并能在體內(nèi)導致腫瘤消退，但對非-惡性細胞的增殖卻無任何影響(Poljak-Blazi等，(Jia(i/(9p/zarmacew/,ca/s(美國),15/3:285-293)。在另一個實施方案中，將抗腫瘤藥物阿霉素(Doxombicin)和/或化療藥物博來霉素(已知這兩種藥物能與鐵離子形成復合物)負載于本發(fā)明的Tf融合蛋白上。在其它實施方案中，可以制備藥物的鹽，如檸檬酸鹽或碳酸鹽，將所述鹽與鐵離子復合，然后與Tf結(jié)合。由于腫瘤細胞經(jīng)常顯示出較高的鐵周轉(zhuǎn)率；經(jīng)修飾后攜有至少一種抗-腫瘤劑的運鐵蛋白可使藥劑更多地暴露于腫瘤細胞，或者使腫瘤細胞的藥劑負荷增力口(Demant,(7卯"￡wJ歷oc/e抓"7/(7匿2」,戶a必w^等，(7卵5」J.Biol.Chem.260/13:7820-7823)。藥物配制劑和治療方法可以使用標準的給藥方法給需要治療的患者施用本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白。例如，本發(fā)明的經(jīng)修飾Tf融合蛋白可以單獨施用，也可與調(diào)節(jié)特定生理過程的其它藥劑聯(lián)合或有順序地聯(lián)合施用。在本文中，當同時施用或以使藥劑同時或幾乎同時發(fā)揮作用的方式獨立施用兩種藥劑時，即稱為聯(lián)合施用兩種藥劑?？山?jīng)由非腸道、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮和口腔途經(jīng)施用本發(fā)明的藥劑。例如，可以經(jīng)由微量灌注將藥劑局部施用于受傷位點?；蛘撸蛲瑫r通過口服、吸入、鼻或肺途經(jīng)進行非入侵性給藥。給藥劑量取決于受試者的年齡、健康狀況和體重，同時治療的類型，必要時還取決于治療頻率和所需療效的特性。2本發(fā)明還提供了含有一種或多種本發(fā)明的融合蛋白的組合物。盡管個體需要有差異，但本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定各個成分有效量的最佳范圍。典型的劑量含有約lpg/kg至約100mg/kg體重。全身性給藥的優(yōu)選劑量含有約100ng/kg至約100mg/kg體重或約100-200mg蛋白質(zhì)/劑量。經(jīng)由微量灌注對某個位點直接給藥的優(yōu)選劑量含有約lng/kg至約lmg/kg體重。當經(jīng)由直接注射或微量灌注給藥時，可對本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白進行改造以使其與鐵的結(jié)合降低或不結(jié)合，從而部分防止局部的鐵毒性。除了有藥物學活性的融合蛋白外，本發(fā)明的組合物可含有適當?shù)乃幬锟山邮茌d體，所述載體含有便于將活性化合物加工成可將活性成分傳遞至作用位點的藥用制品的賦形劑和輔劑。非腸道給藥的適當制劑包括水溶形式(如水溶性鹽形式)的活性化合物水溶液。另外，可以施用適當油性注射懸浮液形式的活性化合物懸浮液。適當親脂性溶劑或載體包括脂肪油類，例如，芝麻油或合成的脂肪酸酯，例如乙基油酸酯或甘油三酯。含水注射懸浮液可含有能增加懸浮液粘度的物質(zhì)，包括例如羧曱基纖維素鈉，山梨醇和葡聚糖。任選懸浮液還含有穩(wěn)定劑。也可使用脂質(zhì)體包裹藥劑以傳遞至細月包內(nèi)。可配制本發(fā)明全身性給藥用的藥物制劑以進行腸、非腸道或局部給藥。實際上，可以同時使用這三種類型的制劑以獲得活性成分的全身性給藥?？诜玫倪m當制劑包括硬或軟明膠膠嚢，丸劑，片劑，包括包衣片劑，酏劑，懸浮劑，糖漿或吸入劑及其控釋形式。在實施本發(fā)明的方法時，本發(fā)明的藥劑可以單獨或聯(lián)合用藥，或與其它治療劑或診斷劑聯(lián)合使用。在某些優(yōu)選實施方案中，可以同時施用本發(fā)明的化合物以及根據(jù)普遍被接受的醫(yī)學實踐為這些疾病建議的其它化合物。本發(fā)明的化合物可以在體內(nèi)使用，一般在哺乳動物，如人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠體內(nèi)使用，也可以在體外使用。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白可用于診斷、預測、預防和/或治療與內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的疾病和失調(diào)有關(guān)的疾病和/或失調(diào)，與細胞增殖有關(guān)的疾病和/或失調(diào)，和/或與血液相關(guān)的疾病或失調(diào)。在本發(fā)明的其它實施方案中，經(jīng)修飾的Tf融合蛋白可用于診斷、預測、預防和/或治療疾病和/或失調(diào)，所述疾病和/或失調(diào)與已知與治療性蛋白質(zhì)組成成分相關(guān)或可由這些組成成分治療的疾病和失調(diào)相關(guān)，所述組成成分是本領(lǐng)域公知的，PCT專利公開號WO01〃9258,WO01/77137,WO01/79442，WO01/79443,WO01/79444和WO01/79480(皆全文列入本文作為參考)中例舉了這些組成成分。因此，本發(fā)明包括治療表l"優(yōu)選適應癥Y"—欄中所列疾病或失調(diào)的方法，所述方法包括給需要這種治療、預防或改善的患者施用本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白，其中含有對應于表l"治療性蛋白質(zhì)X，，一欄中公開的治療性蛋白質(zhì)的治療性蛋白質(zhì)部分，其含量足以有效治療、防止或改善疾病或失調(diào)。在某些實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白可用于診斷和/或預測疾病和/或失調(diào)。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預防、診斷和/或預測免疫系統(tǒng)疾病。另外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作特定免疫系統(tǒng)疾病或失調(diào)的標記或4全測劑。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作加強免疫缺陷個體的免疫反應性的藥劑。在具體實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作加強B細胞和/或T細胞免疫缺陷個體的免疫反應性的藥劑。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預防、診斷和/或預測自身免疫病。很多自身免疫病是由免疫細胞將自身不恰當?shù)刈R別為外來物質(zhì)而引起的。這種不恰當?shù)淖R別導致能破壞宿主組織的免疫應答。因此，施用能抑制應答，特別是能抑制T-細胞增殖、分化或趨化性的本發(fā)明融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸是預防自身免疫病的有效療法。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苦酸可用于治療、預防、預測和/或診斷造血細胞疾病。本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加造血細胞，包括多能干細胞的分化和增殖，旨在治療或預防與某些(或多種)類型的造血細胞減少有關(guān)的疾病，所述疾病包括但不限于白細胞減少癥、嗜中性粒細胞減少癥、貧血和血、板減少癥?；蛘?，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于增加造血細胞，包括多能干細胞的分化和增殖，旨在治療或預防與某些(或多種)類型的造血細胞增加有關(guān)的疾病，所述疾病包括但不限于組織細胞增多病。使用本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸還可以治療、預防、診斷和/或預測過敏反應和疾病，如哞喘(特別是過敏性哮喘)或其它呼吸問題。另外，可以使用這些分子治療、預防、預測和/或診斷對抗原分子的過敏性，超敏反應或血型的不相容性。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預防、診斷和/或預測IgE-介導的過敏反應。所述過敏反應包括但不限于哮喘、鼻炎和濕滲。在具體實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)IgE濃度。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預測、預防和/或治療炎癥。例如，由于本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可抑制參與炎癥反應的細胞的活化、增殖和/或分化，因此，這些分子可用于預防和/或治療慢性和急性炎癥。所述炎癥包括但不限于例如與下述因素有關(guān)的炎癥感染(如膿毒性休克、膿毒病或全身性炎癥反應綜合征)，局部缺血-再灌注損傷，內(nèi)毒素致死率，補體-介導的超急性排斥，腎炎，細胞因子或趨化因子誘導的肺損傷，炎性腸病，節(jié)段性回腸炎，細胞因子(如TNF或IL-1)的過量產(chǎn)生，呼吸疾病(如哮喘和過敏癥)；胃腸疾病(如炎性腸病)；癌癥(如胃癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、肝癌和乳腺癌)；CNS疾病(如多發(fā)性硬化)；局部缺血性腦損傷和/或中風，外傷性腦損傷，神經(jīng)變性疾病(如帕金森氏病和Alzheimer病)；與AIDS-相關(guān)的癡呆；和朊病毒病；心血管病(如動脈粥樣硬化、心肌炎、心血管病和心肺旁路并發(fā)癥)；以及多種特征在于炎癥的其它疾病(例如肝炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、痛風、外傷、胰腺炎、肉樣瘤病、皮炎、腎局部缺血性再灌注損傷、突眼性曱狀腺肺、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病和同種異型移植物排斥)。由于炎癥是基本的防御機制，因此炎癥事實上可影響身體的任何組織。因此，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核普酸可用于治療組織-特異性炎癥，包括但不限于腎上腺炎、牙槽炎、膽嚢膽管炎、闌尾炎、龜頭炎、瞼炎、支氣管炎、粘液嚢炎、心炎、蜂窩織炎、子宮頸炎、膽嚢炎、聲帶炎、耳蝸炎、大腸炎、結(jié)膜炎、膀胱炎、皮炎、憩室炎、腦炎、心內(nèi)膜炎、食道炎、咽鼓管炎、纖維組織炎、毛嚢炎、胃炎、腸胃炎、齒齦炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、迷路炎、喉炎、淋巴管炎、乳腺炎、中耳炎、腦膜炎、子宮炎、粘膜炎、心肌炎、肌炎、鼓膜炎、腎炎、神經(jīng)炎、睪丸炎、骨軟骨炎、耳炎、心包炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽炎、靜脈炎、小兒麻痹癥、前列腺炎、牙髓炎、視網(wǎng)膜炎、鼻炎、輸卵管炎、鞏膜炎、鞏膜脈絡(luò)膜炎、陰囊炎、竇炎、脊推炎、脂肪組織炎、口腔炎、滑膜炎、咽鼓管炎、腱炎、扁桃腺炎、尿道炎和陰道炎。在具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預測、預防和/或治療器官移植排斥和移植物-抗-宿主疾病。宿主免疫細胞通過免疫應答破壞移植組織時即會發(fā)生器官排斥。類似地，免疫應答也涉及GVHD，但此時外來的移植免疫細胞會破壞宿主組織。能抑制免疫應答，特別是能抑制T-細胞活化、增殖、分化或趨化性的本發(fā)明多肽、抗體或多核苦酸和/或其激動劑或拮抗劑是預防器官排斥或GVHD的有效療法。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作佐劑以增強抗-病毒免疫應答。使用本發(fā)明的組合物作為佐劑即可增強的抗-病毒免疫應答包括本文所述或本領(lǐng)域已知的病毒和病毒相關(guān)疾病或癥狀。在具體實施方案中，將本發(fā)明的組合物用作佐劑來增強對選自AIDS、腦膜炎、登革熱、EBV和肝炎(如乙型肝炎)的病毒、疾病或癥狀的免疫應答。在另一個具體實施方案中，將本發(fā)明的組合物用作佐劑來增強對選自HIV/AIDS、呼吸道合胞病毒、登革熱、輪狀病毒、乙型日本腦炎、曱型和乙型流感、副流感病毒、麻疹、巨細胞病毒、狂犬病、Junin、切昆貢亞熱、雷付脫谷熱、單純皰滲病毒和黃熱病的病毒、疾病或癥狀的免疫應答。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作佐劑以增強抗-細菌或抗-真菌免疫應答。使用本發(fā)明的組合物作為佐劑即可增強的抗-細菌或抗-真菌免疫應答包括本文所述或本領(lǐng)域已知的細菌或真菌以及細菌或真菌相關(guān)疾病或癥狀。在具體實施方案中，將本發(fā)明的組合物用作佐劑來增強對選自破傷風、白喉、肉毒中毒和乙型腦膜炎的細菌或真菌、疾病或癥狀的免疫應答。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的組合物可用作佐劑以增強對選自霍亂弧菌、麻風分枝桿菌、傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、肺炎鏈球菌、B型鏈球菌、志賀氏菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌和布氏疏螺旋體的細菌或真菌、疾病或癥狀的免疫應答。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作佐劑以增強抗-寄生蟲的免疫應答。使用本發(fā)明的組合物作為佐劑即可增強的抗寄生蟲免疫應答包括本文所述或本領(lǐng)域已知的寄生蟲和寄生蟲相關(guān)疾病或癥狀。在具體實施方案中，將本發(fā)明的組合物用作佐劑來增強對寄生蟲的免疫應答。在另一個具體實施方案中，將本發(fā)明的組合物用作佐劑來增強對疰原蟲(癡疾)或利什曼原蟲的免疫應答。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于通過防止補充和激活單核吞噬細胞來治療感染疾病，所述疾病包括硅肺病、肉樣瘤病和自發(fā)肺纖維化。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作抗原，用于產(chǎn)生抗體以抑制或增強抗本發(fā)明多肽的免疫介導反應。在一個實施方案中，給動物(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠、豬、小型豬、雞、駱駝、山羊、馬、奶牛、綿羊、狗、貓等非人靈長類動物和人，最優(yōu)選人)施用本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸，以促進免疫系統(tǒng)產(chǎn)生增加量的一種或多種抗體(例如IgG，IgA,IgM和IaE)，促使較高親和性抗體的產(chǎn)生和免疫球蛋白類別的轉(zhuǎn)換(例如IgG,IgA,IgM和IaE)，和/或增強免疫應答。在另一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于本文所述的一種或多種應用，例如可用于獸藥。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于阻斷針對外來物或自身物質(zhì)的免疫應答的多個方面。需要阻斷免疫應答的某些方面的疾病包括例如自身免疫病，如狼瘡和關(guān)節(jié)炎以及對皮膚過敏、炎癥、腸病、損傷和病原體相關(guān)疾病/失調(diào)的免疫應答。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作預防與自身免疫病相關(guān)的B細胞增殖和Ig分泌的療法，所述自身免疫病包括例如自發(fā)性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作內(nèi)皮細胞中B和/或T細胞遷移的抑制劑。該活性能^s皮壞組織結(jié)構(gòu)或相關(guān)反應，可用于例如破壞免疫應答和阻斷膿毒病。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作疾病中的慢性血丙球蛋白過多事件的療法，所述疾病包括例如意義不確定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)、瓦爾登斯特倫氏病、相關(guān)的自發(fā)性單克隆丙種球蛋白病和漿細胞瘤。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于例如在一些自身免疫病、慢性炎癥和感染疾病中抑制巨噬細胞及其前體、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、B淋巴細胞和一些T-細胞亞型，如活化的和CD8細胞毒的T細胞以及自然殺傷細胞的多肽趨化性和活化。本文描述了自身免疫病的例子，它包括多.發(fā)性硬化和胰島素依賴型糖尿病。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于通過例如防止單核細胞浸潤至動脈壁中來治療動脈粥樣硬化。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)。2在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于促進創(chuàng)傷和組織修復，促進血管生成，和/或促進血管或淋巴疾病或失調(diào)的修復。另外，可以使用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸促進粘膜表面的再生。在具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預測、治療和/或預防特征在于原發(fā)性或獲得性免疫缺陷、缺損血清免疫球蛋白產(chǎn)生、復發(fā)感染和/或免疫系統(tǒng)機能異常的疾病。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或預防關(guān)節(jié)、骨、皮膚和/或腮腺感染，血液攜帶的感染(如膿毒病、腦膜炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎和/或骨髓炎)，自身免疫病(如本文公開的那些)，炎性疾病和惡性腫瘤，和/或任何與這些感染、疾病、失調(diào)和/或惡性腫瘤相關(guān)的疾病，包括但不限于CVID、其它原發(fā)性免疫缺陷、HIV病、CLL、復發(fā)支氣管炎、竇炎、中耳炎、結(jié)膜炎、肺炎、肝炎、腦膜炎、帶狀皰疹(如重度帶狀皰疹)和/或卡氏肺嚢蟲。可以用本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸預防、診斷、預測和/或治療的其它疾病和失調(diào)包括但不限于HIV感染、HTLV-BLV感染、淋巴細胞減少癥、吞噬細胞殺菌機能異常貧血癥、血小板減少癥和血紅蛋白尿。在具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預測、預防和/或治療癌癥或腫瘤，包括免疫細胞或免疫組織-相關(guān)癌癥或腫瘤?？梢杂帽景l(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核普酸預防、診斷或治療的癌癥或腫瘤的例子包括但不限于急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、何杰金氏病、非-何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴細胞貧血(ALL)、慢性淋巴細胞白血病、漿細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、伯基特氏淋巴瘤、EBV轉(zhuǎn)化疾病和/或本文中被提名為"過度增殖性疾病"的章節(jié)所描述的疾病和失調(diào)。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作降低大B-細胞淋巴瘤的細胞增殖的療法。在具體實施方案中，本發(fā)明的組合物可用作加強B細胞免疫缺損個體的免疫反應性的藥劑，所述個體包括例如遭受了部分或完全脾切除術(shù)的個體。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白增加止血或溶栓活性，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核普酸可用于治療或預防血液凝集疾病(如無纖維蛋白原血癥、因子缺乏、血友病)，血小板疾病(如血小板減少癥)，或由外傷、手術(shù)或其它原因?qū)е碌膭?chuàng)傷。或者，可以使用能降低止血或溶栓活性的本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸來抑制或溶解凝血。在治療或預防心臟病發(fā)作(梗死)、中風或瘢痕形成時，這些分子可能是至關(guān)重要的。在具體實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預防、診斷、預測和/或治療血栓形成、動脈血栓形成、靜脈血栓形成、血栓栓塞、肺栓塞、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、瞬時局部缺血發(fā)作、不穩(wěn)定的絞痛。在具體實施方案中，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預防隱靜脈移植物閉塞；降低可能與血管成形術(shù)過程相伴隨的全程血栓形成的風險；降低心房纖維性顫動患者，包括非風濕性心房纖維性顫動患者中風的風險；降低與人工心臟瓣膜和/或二尖瓣疾病有關(guān)的栓塞風險。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸的其它用途包括但不限于預防外體裝置(如血管內(nèi)小管、血液透析患者體內(nèi)的血管入口分流器、血液透析機和心肺旁路儀)閉塞。在另一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預防、診斷、預測和/或治療與表達本發(fā)明多肽的組織相關(guān)的血液病和/或血液形成器官的疾病。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核香酸可用于調(diào)節(jié)造血活性(形成血細胞)。例如，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核芬酸可用于增加全部血細胞或血細胞亞型的數(shù)量，所述血細胞包括例如紅細胞、淋巴細胞(B或T細胞)、髓細胞(如嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞、巨嗟細胞)和血小板。減少血細胞或血細胞亞型數(shù)量的能力可用于預防、；險測、診斷和/或治療下文所述的貧血和白細胞減少?；蛘撸景l(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于減少全部血細胞或血細胞亞型的數(shù)量，所述血細胞包括例如紅細胞、淋巴細胞(B或T細胞)、髓細胞(如嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞、.巨噬細胞)和血小板。減少血細胞或血細胞亞型數(shù)量的能力可用于預防、檢測、診斷和/或治療白細胞增多，例如嗜酸性粒細胞增多。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于預防、治療或診斷血質(zhì)不調(diào)。貧血是紅細胞數(shù)目或其中的血紅蛋白的量低于正常水平的疾病。大量出血、紅細胞產(chǎn)量減少或紅細胞破壞量增加(如溶血)會導致貧血。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苦酸可用于治療、預防和/或診斷貧血?？捎杀景l(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預防或診斷的貧血包括缺鐵性貧血、血紅蛋白過少的貧血、小紅細胞貧血、萎黃病貧血、遺傳性成鐵粒紅細胞貧血、自發(fā)獲得性成鐵粒紅細胞貧血、紅細胞發(fā)育不全、巨成紅細胞貧血(如惡性貧血(維生素B12缺乏)和葉酸缺乏性貧血)、發(fā)育不全性貧血、溶血性貧血(如自身免疫性溶血性貧血、；微血管病性溶血性貧血和夜間發(fā)作的血紅蛋白尿)。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預防和/或診斷與下述疾病相關(guān)的貧血，所述疾病包括但不限于與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、癌癥、淋巴瘤、慢性腎病和脾腫大相關(guān)的貧血。本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預防和/或診斷由藥物治療引起的貧血，例如與曱基多巴、達普宋和/或磺胺藥物有關(guān)的貧血。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苦酸可用于治療、預防和/或診斷與紅細胞結(jié)構(gòu)異常相關(guān)的貧血，包括但不限于遺傳性球形紅細胞癥、遺傳性橢圓形紅細胞癥、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷和鐮狀細胞貧血。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預防和/或診斷血紅蛋白異常(例如與鐮狀細胞貧血、血紅蛋白C病、血紅蛋白S-C病和血紅蛋白E病有關(guān)的異常)。另外，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核香酸可用于診斷、預防、預測和/或治療地中海貧血，包括但不限于主要和次要形式的Ot-地中海貧血和(3-地中海貧血。在另一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預測、預防和/或治療出血病，包括但不限于血小板減少(如自發(fā)性血小板減少性紫癜和形成血栓的血小板減少性紫癜)、遺傳性假血友病、遺傳性血小板病(如儲存庫疾病，如Chediak-Higashi和Hermansky-Pudlak綜合征、血栓烷A2機能異常、血小板機能不全和Bernard-Soulier綜合征)、溶血性尿毒癥綜合征、血友病(如A型血友病或V-11因子缺乏和B型血友病或IX因子缺乏)、遺傳出血性毛細管擴張(也稱Rendu-Osler-Webe綜合征)、過敏性紫癜(HenochSchonleinpurpura)和彌漫性血管內(nèi)凝血。在其它實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用作增加細胞因子產(chǎn)量的藥劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或檢測過度增殖性疾病，包括腫瘤。本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可通過直接或間接相互作用來抑制疾病的增殖?；蛘?，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可增殖其它能抑制過度增殖性疾病的細胞。例如，通過增強免疫應答，特別是增加過度增殖性疾病的抗原量，或通過增殖、分化或轉(zhuǎn)移T-細胞，即可治療過度增殖性疾病。通過增強現(xiàn)有的免疫應答，或通過起始新的免疫應答，即可增強免疫應答?；蛘撸瑴p弱免疫應答也不失為一種治療過度增殖性疾病的方法，例如化療藥劑。通過本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核香酸可以治療或檢測的過度增殖性疾病的例子包括但不限于下述部位的腫瘤結(jié)腸、腹部、骨、乳腺、消化系統(tǒng)、肝臟、胰腺、腹膜、內(nèi)分泌腺(腎上腺、曱狀旁腺、腦垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭和頸、神經(jīng)(中樞和周圍)、淋巴系統(tǒng)、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸和泌尿生殖道。類似地，通過本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合>蛋白的多核香酸也可以治療或檢測其它過度增殖性疾病。所述過度增殖性疾病的例子包括但不限于兒童急性成淋巴細胞白血病、急性成淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、成人(原發(fā)性)肝細胞癌、成人(原發(fā)性)肝癌、成人急性淋巴細胞白血病、成人急性骨髓性白血病、成人何杰金氏病、成人何杰金氏'淋巴瘤、成人淋巴細胞白血病、成人非-何杰金氏淋巴瘤、成人原發(fā)性肝癌、成人軟組織肉瘤、與AIDS有關(guān)的淋巴瘤、與AIDS有關(guān)的惡性腫瘤、肛門癌、星形細胞瘤、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦瘤、乳腺癌、腎盂和輸尿管癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(原發(fā)性)淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤、頸癌、兒童(原發(fā)性)肝細胞癌、兒童(原發(fā)性)肝癌、兒童急性成淋巴細胞白血病、兒童急性骨髓性白血病、兒童腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童小腦星形細胞瘤、兒童大腦星形細胞瘤、兒童顱外生殖細胞瘤、兒童何杰金氏病、兒童何杰金氏淋巴瘤、兒童下丘腦和;f見覺，各徑神經(jīng)膠質(zhì)瘤、兒童成淋巴細胞白血病、兒童成神經(jīng)管細胞瘤、兒童非-何杰金氏淋巴瘤、兒童松果體和幕上初級神經(jīng)外胚層瘤、兒童原發(fā)性肝癌、兒童橫紋肌肉瘤、兒童軟組織肉瘤、兒童視覺路徑和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓細胞性白血病、結(jié)腸癌、皮T-細胞淋巴瘤、內(nèi)分泌胰島細胞癌、子宮內(nèi)膜癌、室管膜細胞瘤、上皮癌、食管癌、尤因氏肉瘤和相關(guān)腫瘤、外分泌胰腺癌、Extraeranial生殖細胞瘤、性腺外的生殖細胞瘤、肝外的膽管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇氏病、膽嚢癌、胃癌、胃腸類癌瘤、胃腸瘤、生殖細胞瘤、妊娠滋養(yǎng)層瘤、多毛細胞白血病、頭頸癌、肝細胞癌、何杰金氏病、何杰金氏淋巴瘤、丙球蛋白過多、咽下部癌、腸癌、眼內(nèi)黑素瘤、小島細胞癌、胰島細胞癌、卡波濟氏肉瘤、腎癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增殖性疾病、巨球蛋白血癥、男性乳腺癌、惡性間皮瘤、惡性胸腺瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、黑素瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移的潛隱性原發(fā)鱗狀頸癌、轉(zhuǎn)移的原發(fā)鱗狀頸癌、轉(zhuǎn)移的鱗狀頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤/漿細胞瘤、脊髓發(fā)育不良綜合征、髓細胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增殖性疾病、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細胞瘤、妊娠過程中的非-何杰金氏淋巴瘤、非-黑素瘤皮膚癌、非-小細胞肺癌、潛隱原發(fā)性轉(zhuǎn)移的鱗狀頸癌、口咽癌、骨/惡性纖維性肉瘤、骨肉瘤/惡性纖維性組織細胞瘤、骨肉瘤/骨惡性纖維性組織細胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、卵巢低惡性潛在肺瘤、胰腺癌、異型蛋白血癥、紫癜、曱狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細胞瘤、腦垂體瘤、漿細胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、原發(fā)性肝癌、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂和輸尿管癌、成視網(wǎng)膜細胞瘤、4黃紋月幾肉瘤、唾液腺癌、肉樣瘤病肉瘤、Sezary綜合征、皮膚癌、小細^J市癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀頸癌、胃癌、幕上初級神經(jīng)外胚層和^^果體瘤、T-細胞淋巴瘤、睪丸癌、胸腺瘤、曱狀腺癌、腎盂和輸尿管的移行細胞癌、移行腎盂和輸尿管癌、滋養(yǎng)層瘤、輸尿管和腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、；f見覺路徑和下丘腦神經(jīng)M^質(zhì)瘤、外陰癌、Waldenstroin氏巨球蛋白血癥、腎胚細胞瘤，和除腫瘤外，位于上述器官系統(tǒng)中的任何其它過度增殖性疾病。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、預測、預防和/或治療惡性前期疾病并防止它們發(fā)展成腫瘤或惡性腫瘤狀態(tài)，所述疾病包括但不限于上述疾病。所述用途的適應癥為已知或懷疑正往腫瘤或癌癥方向發(fā)展的疾病，特別是非-腫瘤細胞生長由增生、組織轉(zhuǎn)化組成，或最特別地是出現(xiàn)發(fā)育異常的疾病(有關(guān)異常生長疾病的綜述可參見Robbins.andAngell，1976，BasicPathology,2dEd.W.B.SaundersCo.，Philadelphia,pp.68-79)。增生是一種受控制的細胞增殖形式，包括組織或器官中的細胞數(shù)目增加，但結(jié)構(gòu)或功能無顯著改變。本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可診斷、預測和/或治療的增生疾病包括但不限于血管濾泡縱隔淋巴結(jié)增生、伴有嗜酸性粒細胞增多的血管淋巴增生、非典型性黑素細胞增生、基底細胞增生、良性大淋巴結(jié)增生、牙骨質(zhì)增生、先天性腎上腺增生、先天性皮脂增生、嚢增生、乳腺嚢增生、牙列增生、管增生、子宮內(nèi)膜增生、纖維肌性增生、灶性上皮增生、齦增生、炎性纖維性增生、炎性乳頭狀增生、血管內(nèi)乳頭狀內(nèi)皮增生、前列腺小結(jié)狀增生、小結(jié)狀再生增生、假上皮瘤增生、老年皮脂增生和疣增生。在另一個實施方案中，如本文所述與毒素或放射性同位素偶聯(lián)的、本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療包括但不限于本文所述的那些癌癥和腫瘤。在另一個優(yōu)選實施方案中，如本文所述與毒素或放射性同位素偶聯(lián)的、本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療急性fi細月包性白血病。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可影響細胞凋亡，因此可用于治療多種與增加的細胞存活或細胞凋亡抑制有關(guān)的疾病。例如，能通過本發(fā)明的多核苷酸、多肽和/或激動劑或拮抗劑診斷、預測、預防和/或治療的、與增加的細胞存活或細胞凋亡抑制有關(guān)的疾病包括癌癥(如濾泡-淋巴瘤、伴有p53突變的癌癥和激素-依賴型腫瘤，包括但不限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑素瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、成神經(jīng)細胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、內(nèi)皮瘤、成骨細胞瘤、石皮骨細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波濟氏肉瘤和卵巢癌)；自身免疫病，如多發(fā)性硬化、斯耶格倫氏綜合征、橋本氏甲狀腺炎、膽汁性肝硬變、貝切特氏病、節(jié)段性回腸炎、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫-相關(guān)腎小球腎炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎)和病毒感染(如皰滲病毒、痘病毒和腺病毒)、炎癥、移植物抗宿主疾病、急性移植物排斥和慢性移植物排斥。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制癌癥，特別是上述癌癥的生長、進行和/或轉(zhuǎn)移。其它能通過本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預測、預防和/或治療的、與增加的細胞存活有關(guān)的疾病包括但不限于惡性腫瘤和相關(guān)疾病的進行和/或轉(zhuǎn)移，所述疾病如白血病(包括急性白血病(如急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞性白血病(包括成髓細月包、前髓細胞、骨髓單核細胞、單核細胞和紅白血病))和慢性白血病(如慢性髓細胞(粒細胞)白血病和慢性淋巴細胞白血病))、真性紅細胞增多淋巴瘤(如何杰金氏病和非-何杰金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、重鏈病、和實體瘤，包括但不限于肉瘤和癌癥，如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、>精原細胞瘤、胚胎癌、腎胚細胞瘤、子宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜細胞瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、menangioma、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和成^L網(wǎng)膜細胞瘤。能通過本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸診斷、預測、預防和/或治療的、與增加的細胞凋亡有關(guān)的疾病包括AIDS;神經(jīng)變性疾病(如Alzheimer病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、大腦變性和腦瘤或在此之前的相關(guān)疾病)；自身免疫病(如多發(fā)性硬化、斯耶格倫氏綜合征、橋本氏曱狀腺炎、膽汁性肝硬變、貝切特氏病、節(jié)段性回腸炎、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫-相關(guān)腎小球腎炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎)脊髓發(fā)育不良綜合征(如再生障礙性貧血)，移植物抗宿主疾病，局部缺血性損傷(如由心肌梗塞、中風和消腫損傷造成的損傷)，肝損傷(如與肝炎有關(guān)的肝損傷，局部缺血/再灌注損傷，膽汁淤積(膽管損傷)和肝癌)；毒素-誘導的肝病(如由乙醇導致的肝病)，膿毒性休克，惡病質(zhì)和厭食癥。另一個優(yōu)選實施方案利用編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸，通過使用本發(fā)明的基因治療和/或其蛋白質(zhì)融合物或片段來抑制異常細胞分裂。因此，本發(fā)明提供了通過在異常增殖的細胞中插入編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療細胞增殖性疾病的方法，其中所述多核苷酸能抑制所述表達。本發(fā)明的另一個實施方案提供了治療個體的細胞增殖性疾病的方法，所述方法包括給一個或多個異常增殖細胞施用一個或多個本發(fā)明的活性基因拷貝。通過使用用于將注射針頭直接導向患病位點的顯像裝置，可將本發(fā)明的多核苦酸直接傳遞至內(nèi)部器官、體腔等的細胞增殖性疾病患病位點。也可以在進行外科手術(shù)干預時將本發(fā)明的多核苷酸施用至患病位點。細胞增殖性疾病指的是任何會影響到器官、體腔或身體的一部分中的任何一個或其任意組合的人或動物疾病或失調(diào)，其特征在于單發(fā)或多發(fā)的局部細胞、細胞群或組織的異常增殖，所述增殖可以是良性的，也可以是惡性的?？梢允┯萌我饬康谋景l(fā)明的多核香酸，只要它對名欠治療細胞的增殖具有生物抑制作用即可。另夕卜，可以給相同位點同時施用一種以上本發(fā)明的多核苷酸。"生物抑制，，指的是部分或全部的生長抑制作用以及細胞增殖或生長速率的降低。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苦酸可用于抑制增殖細胞或組織的轉(zhuǎn)移。抑制作用可作為施用這些運鐵蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的直接結(jié)果而發(fā)生，也可以作為例如激活已知可抑制轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)(如OC整聯(lián)蛋白)的表達的間接結(jié)果而發(fā)生(參見例如CurrTopMirobiolImmunol1998;231:141,列入本文作為參考)。本發(fā)明的這種療效可以獨立獲得，也可以與小分子藥物或佐劑聯(lián)合獲得。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了將組合物傳遞至表達多肽的靶向細胞的方法，所述組合物含有本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸，所述多肽與本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白結(jié)合。本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白可經(jīng)由疏水、親水、離子和/或共價作用與異源多肽、異源核酸、毒素或前藥結(jié)合。本發(fā)明的組合物可以診斷、預測、預防和/或治療的腎病包括但不限于急性腎衰竭、慢性腎衰竭、動脈栓塞性腎衰竭、晚期腎衰竭、腎的炎性疾病(如急性腎小球腎炎、感染后的腎小球腎炎、快速進行的腎小球腎炎、腎炎綜合征、膜腎小球腎炎、家族性腎炎綜合征、膜增殖性腎小球腎炎和系膜增殖性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、急性管狀間質(zhì)腎炎、慢性管狀間質(zhì)腎炎、急性鏈球菌性腎小球腎炎(PSGN)、腎盂炎、狼瘡性腎炎、慢性腎炎、間質(zhì)腎炎和鏈球菌性腎小球腎炎)、腎血管病(如腎梗塞、動脈栓塞性腎病、皮質(zhì)壞死、惡性腎硬化、腎靜脈血栓形成、接受灌注的腎、腎視網(wǎng)膜病、腎局部缺血性再灌注、腎動脈栓塞和腎動脈狹窄)、和由尿道病引起的腎病(如腎盂炎、腎盂積水、尿石病(腎結(jié)石、腎石病)、回流性腎病、尿道感染、尿潴留和急性或慢性單側(cè)梗塞性尿路病)。另外，可以使用本發(fā)明的組合物診斷、預測、預防和/或治療腎的代謝和先天性疾病(如尿毒癥、淀粉樣變性、腎病性骨營養(yǎng)不良、腎小管酸中毒、腎糖尿、腎性尿崩癥、胱氨酸尿癥、范康尼氏綜合征、腎性纖維嚢狀骨生成(腎病性佝僂病)、哈特奈樸病、Bartter氏綜合征、利德爾綜合征、多嚢腎病、髓嚢性疾病、髓質(zhì)海綿腎、奧爾波特綜合征、指曱髕骨綜合征、先天性腎炎綜合征、CRUSH綜合征、馬蹄形腎、糖尿病腎病、腎性尿崩癥、鎮(zhèn)痛劑腎病、腎結(jié)石和膜性腎病)以及腎的自身免疫病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、Goodpasture綜合征、IgA腎病和ICFM系膜增生性腎小球腎炎)。本發(fā)明的組合物也可用于診斷、預測、預防和/或治療腎的硬化或lecrotic疾病(如腎小球硬化、糖尿病腎病、facaFsegmental腎小球硬化(FSGS)、麻醉導致的腎小球腎炎和腎乳頭壞死)，腎的癌癥(如腎癌、腎上腺樣癌、腎胚細胞瘤、腎細胞癌、移行細胞癌、腎腺癌、鱗狀細胞癌和腎胚細胞瘤)和電解質(zhì)失調(diào)(如腎鈣沉著癥、膿尿、水腫、腎盂積水、蛋白尿、血鈉過少、血氮過多、血鉀過少、血鉀過高、血鈞過少、血鉤過高、血磷酸鹽過少和血磷酸鹽過多)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法施用本發(fā)明的組合物，所述方法包括但不限于直接用針頭注射至傳遞位點、靜脈內(nèi)注射、局部給藥、導管輸注、biolistic注射器、微粒加速器、凝膠泡沫海綿長效藥劑、其它可商購的儲存材料、滲透泵、口服或栓劑固體藥物制劑、手術(shù)過程中的傾注或局部應用、氣霧劑傳遞。所述方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的組合物也可以作為治療劑的一部分被施用，這一點將在下文詳細描述?？梢允褂帽景l(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸來治療、預防、診斷和/或預測心血管病，包括但不限于外周動脈病，如肢體局部缺血。心血管病包括但不限于心血管異常，如動脈瘺、動靜脈瘺、大腦動靜脈畸形、先天性心臟缺損、肺動脈瓣閉鎖和彎刀綜合征。先天性心臟缺損包括但不限于主動脈縮窄、三房心、冠狀血管異常、十字形心臟、右位心、動脈導管未閉、Ebstein異常、艾森曼格爾復征、左心發(fā)育不全綜合征、左位心、法洛四聯(lián)癥、主動^l永肺動脈一睹位、右心室雙出口、三尖瓣閉鎖、持續(xù)性動脈干、和心臟中隔缺損，如主動脈肺動脈中隔缺損、心內(nèi)膜墊缺損、盧特包阿舍爾綜合征、法洛三聯(lián)癥、室心中隔缺損。心血管病還包括但不限于心臟病，如心4聿失常、類癌心臟病、高心輸出量、低心輸出量、心臟填塞、心內(nèi)膜炎(包括細菌)、心動脈瘤、心動停止、充血性心力衰竭、充血性心肌病、陣發(fā)性呼吸困難、心源性水腫、心臟肥大、充血性心肌病、左心室肥大、右心室肥大、梗塞形成后的心臟破裂、室中隔石皮裂、心瓣膜疾病、心月幾疾病、心月幾局部缺血、心包積液、心包炎(包括縮窄的和結(jié)核性的)、心包積氣、心包切開術(shù)后的綜合征、肺心臟病、風濕性心臟病、室機能不良、充血、心血管妊娠并發(fā)癥、彎刀綜合征、心血管梅毒和心血管結(jié)核病。心律失常包括但不限于竇性心律失常、房性纖顫、房性樸動、心博徐緩、期前收縮、阿-斯綜合征、束支傳導阻滯、竇房傳導阻滯、QT延長綜合征、并行收縮、勞-甘-萊綜合征、Mahaim-型預激綜合征、沃-佩-懷綜合征、病竇綜合征、心動過速和心室顫動。心動過速包括陣發(fā)性心動過速、室上心動過速、加速性心室自主心4聿、房室結(jié)節(jié)折返心動過速、異位房性心動過速、異位接合心動過速、竇房結(jié)節(jié)折返心動過速、竇性心動過速、4a轉(zhuǎn)峰值和室性心動過速。心瓣膜疾病包括^^不限于主動脈瓣閉鎖不全、主動脈瓣狹窄、心臟雜音、主動脈瓣脫出、中性瓣脫出、三尖瓣脫出、二尖瓣閉鎖不全、二尖瓣狹窄、肺動脈瓣閉鎖、肺動脈瓣閉鎖不全、肺動脈瓣狹窄、三尖瓣閉鎖、三尖瓣閉鎖不全和三尖瓣狹窄。心肌病包括但不限于酒精心肌病、充血性心肌病、月巴大性心肌病、主動脈瓣膜下狹窄、肺瓣膜下狹窄、受限心肌病、恰加斯氏心肌病、心內(nèi)膜彈力纖維增生癥、心肌內(nèi)膜纖維化、Kearns綜合征、心肌再灌注損傷和心肌炎。心肌局部缺血包括但不限于冠狀疾病，如心絞痛、冠狀動脈瘤、冠狀動脈硬化、冠狀動脈血栓形成、冠狀血管痙攣、心M4更塞和心肌擊昏(stiming)。心血管病還包括血管病，如動脈瘤、血管發(fā)育不良、血管瘤病、桿菌性血管瘤病、Hippel-Lindau病、KlippelTrenaunayWeber綜合征、SturgeWeber綜合征、血管神經(jīng)病水胂、主動脈病、Takayasu氏關(guān)節(jié)炎、主動脈炎、Leriche綜合征、動脈閉塞病、關(guān)節(jié)炎、杵臼關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、腦血管病、糖尿病性血管病、糖尿病性碎見網(wǎng)膜病、4全塞、血栓形成、紅斑性月支痛病、痔瘡、肝靜脈閉塞性疾病、高血壓、低血壓、局部缺血、外周血管病、靜脈炎、肺靜脈閉塞性疾病、雷諾氏病、CREST綜合征、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、彎刀綜合征、上腔靜脈綜合征、毛細管擴張、運動失調(diào)性毛細管擴張、遺傳性出血性毛細管擴張、靜脈節(jié)瘤、靜脈曲張、靜脈曲張性潰瘍、脈管炎和靜脈不足。腦血管疾病包括^旦不限于心臟-動樂jc疾病和呼吸疾病?？梢?吏用本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預防、i貪斷和/或預測呼吸系統(tǒng)的疾病和/或失調(diào)。呼吸系統(tǒng)的疾病和失調(diào)包括但不限于鼻前庭炎、非過敏性鼻炎(如急性鼻炎、慢性鼻炎、萎縮性鼻炎、血管收縮性鼻炎)、鼻息肉和竇炎、幼年性血管纖維瘤、鼻癌和幼年性乳頭狀瘤、聲帶息肉、節(jié)結(jié)(歌唱家結(jié)節(jié))、接觸性潰瘍、聲帶麻痹、喉膨出、咽炎(如病毒和細菌的)、扁桃體炎、扁桃體蜂窩織炎、副咽膿腫、喉炎、喉膨出和咽喉癌(如鼻咽癌、扁桃體癌、喉癌)、肺癌(如鱗狀細胞癌、小細胞(燕麥形細胞)癌、大細胞癌和腺癌)、過壽l性疾病(嗜酸性粒細胞肺炎、過敏性肺炎(如外源性過敏性肺泡炎、過敏性間質(zhì)肺炎、有機粉末肺塵埃沉著病、過敏性支氣管肺曲霉病、哮喘、Wegener肉芽肺(肉芽腫性脈管炎)、Goodpasture綜合征))、肺炎(如細菌性肺炎(如肺炎鏈球菌(肺球菌性肺炎)、金黃色葡萄球菌(葡萄球菌性肺炎)、革蘭氏陰性細菌肺炎(由例如克雷伯氏菌和假單胞菌導致的肺炎)、肺炎支原體肺炎、流感嗜血桿菌肺炎、嗜肺軍團菌(軍團病)和鸚鵡熱衣原體(鸚鵡熱))和病毒性肺炎(如流感病毒、雞痘病毒(水痘))。呼吸系統(tǒng)的其它疾病和失調(diào)包括但不限于細支氣管炎、脊髓灰質(zhì)炎(小兒麻痹癥)、哮吼、呼吸道合胞病毒感染、流行性腮腺炎、傳染性紅斑(第五病)、玫瑰滲、進行性風滲全腦炎)、風滲和亞急性硬化性全腦炎、真菌性肺炎(如組織胞漿菌病、球孢子菌病、芽生菌病、免疫系統(tǒng)嚴重受抑制的患者中的真菌感染(如由新生隱球菌導致的隱球菌?。挥汕箤е碌那共?；由念珠菌導致的念珠菌病；和毛霉菌病))、卡氏肺嚢蟲(肺炎肺嚢蟲)、非典型性肺炎(如支原體和衣原體)、機會性感染肺炎、院內(nèi)獲得性肺炎、化學性肺炎和吸入性肺炎、胸膜病(如胸膜炎、胸膜滲漏和氣胸(如單純自發(fā)性氣胸、并發(fā)的自發(fā)性氣胸、張力性氣胸))、梗阻性導氣管病(如哮喘、慢性梗阻性肺病(COPID)、肺氣腫、慢性或急性支氣管炎)、職業(yè)性肺病(如矽肺、黑肺(采煤工人肺塵埃沉著病)、石棉沉著病、鈹中毒、職業(yè)性哮喘、棉屑肺和良性肺塵埃沉著病)、滲透性肺病(如肺纖維化(如纖維化肺泡炎、普通的間質(zhì)性肺炎)、自發(fā)性肺纖維化、脫屑性間質(zhì)性肺炎、淋巴樣間質(zhì)性肺炎、組織細胞增多癥(如萊特勒-西韋病、Hand-Schiiller-Christian病、嗜酸性粒細胞肉芽肺)、自發(fā)性肺含鐵血黃素沉著癥、結(jié)節(jié)病和肺肺泡蛋白沉積癥)、急性呼吸窘迫綜合征(也稱為成人呼吸窘迫綜合征)、水腫、肺栓塞、支氣管炎(如病毒、細菌)、支氣管擴張、肺膨脹不全、肺膿腫(由金黃色葡萄球菌或嗜肺軍團菌導致)和嚢性纖維化?？捎帽景l(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苦酸治療的癌癥包括但不限于實體瘤，包括前列腺、肺、乳腺、卵巢、胃、胰腺、喉、食道、lesteg、肝臟、耳下腺、膽道、結(jié)腸、直腸、子宮頸、子宮、子宮內(nèi)膜、腎、膀胱、曱狀腺癌；原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移；黑素瘤；成膠質(zhì)細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；平滑肌肉瘤；非-小細胞肺癌；結(jié)腸直腸癌；晚期惡性腫瘤；和血液腫瘤，如白血病。例如，可以局部傳遞本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸，以治療諸如皮膚癌、頭頸癌、乳A泉癌和卡波濟氏肉瘤的癌癥。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療除癌癥外的其它疾病，所述疾病與血管生成有關(guān)。所述疾病包括但不限于良性腫瘤，如血管瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼和生膿性肉芽腫；動脈粥樣硬化性斑塊；眼血管生成疾病，如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟視網(wǎng)膜病、斑點退化、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、晶體后纖維增生癥、潮紅、成視網(wǎng)膜細胞瘤、眼色素層炎和眼翼狀胬肉異常血管生長；類風濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；創(chuàng)傷治愈延遲；子宮內(nèi)膜異位；血管發(fā)生；肉芽發(fā)生；肥厚性瘢痕(瘢痕瘤)；不連接性骨折；硬皮??；沙眼；血管粘連；心肌血管生成；冠狀側(cè)突；大腦側(cè)突；動靜脈畸形；局部缺血性肢體血管生成；Osier-Webber綜合征；斑塊腫瘤血管形成；毛細管擴張；血友病關(guān)節(jié)；血管纖維瘤；纖維肌性發(fā)育不良；創(chuàng)傷肉芽形成；節(jié)段性回腸炎；和動脈粥樣硬化。因此，一方面，本發(fā)明的方法"R供了治療眼新生血管病的方法。另外，可用本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸治療的疾病包括但不限于血管瘤、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、血管纖維瘤、動脈粥樣硬化性斑塊、創(chuàng)傷治愈延遲、肉芽發(fā)生、血友病關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、不連接性骨折、Osier-Webber綜合征、生膿性肉芽腫、硬皮病、沙眼和血管粘連。另外，可用本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苦酸治療的病癥和/或狀態(tài)包括但不限于實體瘤，血液瘤，如白血病，腫瘤轉(zhuǎn)移，卡波濟氏肉瘤，良性腫瘤，例如血管瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、沙眼和生膿性肉芽腫、類風濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、眼血管生成疾病，如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟視網(wǎng)膜病、斑點退化、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、晶體后纖維增生癥、潮紅、成視網(wǎng)膜細胞瘤和眼色素層炎、創(chuàng)傷治愈延遲、子宮內(nèi)膜異位、血管發(fā)生、肉芽發(fā)生、肥厚性瘢痕(瘢痕瘤)、不連接性骨折、硬皮病、沙眼、血管粘連、心肌血管生成、冠狀側(cè)突、大腦側(cè)突、動靜脈畸形、局部缺血性肢體血管生成、Osier-Webber綜合征、斑塊腫瘤血管形成、毛細管擴張、血友病關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、纖維肌性發(fā)育不良、創(chuàng)傷肉芽形成、節(jié)段性回腸炎、動脈粥樣硬化、防止胚胎所需血管形成的節(jié)育藥劑、控制月經(jīng)的植入、以血管生成為病理結(jié)果的疾病，如貓4爪病(Rochelenunaliaquintosa)、潰瘍(幽門螺斥于菌)、巴爾通體病和桿菌性的血管瘤病。在節(jié)育方法的一個方面，在發(fā)生性交和受精之前或之后，施用足夠量的組合物，所述量應能阻斷胚胎植入，從而提供有效的節(jié)育方法，有可能是"房事后進行的"方法。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸也可用于控制月經(jīng)，或者在治療子宮內(nèi)膜異位癥時作為腹膜灌洗液或腹膜植入物施用。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于多種外科手術(shù)方法。使用本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治療、預防、診斷和/或預測的、與增加的細J包存活或細胞凋亡抑制有關(guān)的疾病包括癌癥(如濾泡淋巴瘤、伴有突變的癌癥和激素-依賴型腫瘤，包括^旦不限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑素瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、成神經(jīng)細胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、內(nèi)皮瘤、成骨細胞瘤、破骨細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波濟氏肉瘤和卵巢癌)；自身免疫病，如多發(fā)性硬化、斯耶格倫氏綜合征、橋本氏甲狀腺炎、膽汁性肝硬變、貝切特氏病、節(jié)段性回腸炎、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫-相關(guān)腎小球腎炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎)和病毒感染(如皰疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎癥、移植物抗宿主疾病、急性移植物排斥和慢性移植物排斥。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于抑制癌癥，特別是上述癌癥的生長、進行和/或轉(zhuǎn)移。其它能通過本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的、與增加的細胞存活有關(guān)的疾病包括但不限于惡性肺瘤和相關(guān)疾病的進行和/或轉(zhuǎn)移，所述疾病如白血病(包括急性白血病(如急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞性白血病(包括成髓細胞、前髓細胞、骨髓單核細胞、單核細胞和紅白血病))和慢性白血病(如慢性髓細胞(粒細胞)白血病和慢性淋巴細胞白血病))、真性紅細胞增多淋巴瘤(如何杰金氏病和非-何杰金氏病)、多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、重鏈病、和實體瘤，包括但不限于肉瘤和癌癥，如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、腎胚細胞瘤、頸癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜細胞瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)力交質(zhì)細胞瘤、menangioma、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和成纟見網(wǎng)膜細胞瘤。能通過本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核普酸治療、預防、診斷和/或預測的、與增加的細胞凋亡有關(guān)的疾病包括但不限于AIDS;神經(jīng)變性疾病(如Alzheimer病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、小腦變性和腦瘤或在此之前的相關(guān)疾病)；自身免疫病(如多發(fā)性硬化、斯耶格倫氏綜合征、橋本氏曱狀腺炎、膽汁性肝硬變、貝切特氏病、節(jié)段性回腸炎、多肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫-相關(guān)腎小球腎炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎)脊髓發(fā)育不良綜合征(如再生障礙性貧血)，移植物抗宿主疾病，局部缺血性損傷(如由心肌梗塞、中風和再灌注損傷造成的損傷)，肝損傷(如與肝炎有關(guān)的肝損傷，局部缺血/再灌注損傷，膽汁淤積(膽管損傷)和肝癌)；毒素-誘導的肝病(如由乙醇導致的肝病)，膿毒性休克，惡病質(zhì)和厭食癥。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核香酸可用于治療或預防糖尿病的發(fā)生。在剛剛被診斷為I和II型糖尿病的、尚保留有一些胰島細胞功能的患者中，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于維持胰島功能，從而減輕、延遲或預防該病的長期臨床表現(xiàn)。另外，本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可在胰島細胞移植中用作輔助劑以改善或促進胰島細胞的功能。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷和/或治療腦和/或神經(jīng)系統(tǒng)的疾病、失調(diào)、損害或損傷?？梢杂帽景l(fā)明的組合物(例如本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸)治療的、局限于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)包括但不限于會導致軸突斷開、神經(jīng)元減少或變性或脫髓鞘作用的損傷和疾病或失調(diào)?？筛鶕?jù)本發(fā)明的方法治療的、患者(包括人和非人哺乳動物患者)的神經(jīng)系統(tǒng)損害包括但不限于下述中樞(包括脊髓、腦)或外周神經(jīng)系統(tǒng)的損害(l)局部缺血性損害，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)缺氧導致神經(jīng)元損傷或死亡，包括腦梗塞或局部缺血，或脊髓梗塞或局部缺血；(2)外傷性損害，包括由軀體損傷導致的損害或與手術(shù)相關(guān)的損害，例如，斷開部分神經(jīng)系統(tǒng)的損害或擠壓性損傷；(3)惡性損害，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)被惡性組織破壞或傷害，所述惡性組織是與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的惡性腫瘤，或是衍生自神經(jīng)系統(tǒng)組織的惡性腫瘤；(4)感染性損害，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)因感染的后果，例如膿腫而被破壞或傷害，或者與人免疫缺損病毒、帶狀皰疹病毒或單純皰疹病毒或萊姆病、結(jié)核病或梅毒的感染有關(guān)；(5)退行性損害，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)因退行性過程的結(jié)果而被破壞或傷害，所述退行性過程包括但不限于與帕金森氏病、Alzheimer病、亨廷頓舞蹈病或肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)有關(guān)的退化；(6)與營養(yǎng)病或失調(diào)有關(guān)的損害，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)因代謝的營養(yǎng)病或失調(diào)的結(jié)果而被破壞或傷害，所述疾病或失調(diào)包括但不限于維生素B12缺乏癥、葉酸缺乏癥、韋尼克病、煙草-酒精性弱視、Marchiafava-Blanami病(原發(fā)性胼胝體變性)、和酒精性腦變性；(7)與全身性疾病有關(guān)的神經(jīng)損害，所述疾病包括但不限于糖尿病(糖尿病性神經(jīng)病、貝爾氏麻痹)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、癌或結(jié)節(jié)病；(8)由包括酒精、鉛、或特別是神經(jīng)毒素的毒性物質(zhì)導致的損害；和(9)脫髓鞘損害，其中部分神經(jīng)系統(tǒng)被脫髓鞘疾病破壞或傷害，所述疾病包括但不限于多發(fā)性硬化、人免疫缺損病毒-相關(guān)的脊髓病、橫貫性脊髓病或多種病因、進行性多灶性白質(zhì)腦病和腦橋中央髓鞘溶解。在一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于保護神經(jīng)細胞免受缺氧的損害作用。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于保護神經(jīng)細胞免受腦缺氧的損害作用。在具體實施方案中，本發(fā)明可以治療的運動神經(jīng)元疾病包括但不限于諸如梗塞、感染、暴露于毒素、創(chuàng)傷、手術(shù)損害、變性疾病或可影響運動神經(jīng)元以及神經(jīng)系統(tǒng)其它組分的惡性腫瘤的疾病，以及選擇性影響神經(jīng)元的疾病，如肌萎縮側(cè)索硬化，包括但不限于進行性脊髓性肌萎縮、進行性延髓性麻痹、原發(fā)性側(cè)索硬化、嬰幼兒肌肉萎縮、兒童進行性延髓性麻痹(Fazio-Londe綜合征)、脊髓灰質(zhì)炎和脊髓灰質(zhì)炎后綜合征、以及遺傳性運動感覺神經(jīng)病(夏-馬-圖三氏病)。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核普酸可在神經(jīng)元存活；突觸形成；傳導；神經(jīng)分化等中起作用。因此，本發(fā)明的組合物(包括本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸)可用于診斷和/或治療或預防與這些作用有關(guān)的疾病或失調(diào)，包括但不限于學習和/或認知疾病。本發(fā)明的組合物也可用于治療或預防神經(jīng)變性疾病狀態(tài)和/或行為失調(diào)。所述神經(jīng)變性疾病狀態(tài)和/或行為失調(diào)包括但不限于Alzheimer病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、抽動-穢語綜合征、精神分裂癥、躁狂癥、癡呆、偏執(zhí)狂、強制性障礙、極度焦慮、學習能力缺失、ALS、精神病、孤獨癥和行為改變，包括飲食、睡眠模式、平衡和感覺疾病。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治療或檢測的神經(jīng)病的例子包括腦病，如代謝性腦病，其包括苯丙酮尿癥，如母體苯丙酮尿癥，丙酮酸鹽羧化酶缺乏，丙酮酸鹽脫氫酶復合物缺乏，Wernicke's腦病，腦水腫，腦腫瘤，如小腦腫瘤，包括幕下腫瘤，腦室肺瘤，如脈絡(luò)叢腫瘤，下丘腦腫瘤，幕上腫瘤，腦海綿變性，小腦病，如小腦性共濟失調(diào)，包括脊髓小腦變性，如毛細管擴張失調(diào)癥，小腦協(xié)同失調(diào)，F(xiàn)riederich共濟失調(diào),馬-約病，橄欖體腦橋小腦萎縮，小腦月中瘤，如幕下肺瘤，彌漫性腦硬化，如腦炎periaxialis,球狀體細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良和亞急性硬化性全腦炎。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治療或檢測的其它神經(jīng)病包括腦血管疾病(如頸動脈病，包括頸動脈血^f全形成、頸動脈狹窄和煙霧病)、大腦淀粉樣血管病、大腦頸內(nèi)動脈-后交通動脈動爿永瘤、腦^:氧、大腦動"永》更化、大腦動靜&K畸形、大腦動"永病、腦栓塞和血栓形成，如頸動脈iM全形成、竇血栓形成和Wallenberg綜合征、腦出血，如表皮血腫、硬膜下血腫和蜘蛛膜下腔出血、腦梗塞、腦缺血，如瞬時腦缺血、鎖骨下動脈盜血綜合征和推基底動脈供血不足、血管性癡呆，如多發(fā)性腦梗塞性癡呆、室周腦白質(zhì)軟化、血管性頭痛，如叢集性頭痛和偏頭痛。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治療或^r測的其它神經(jīng)病包括癡呆，如AIDS癡呆復征，早老性癡呆，^口Alzheimer病和Creutzf61dt-Jakob綜合4正，老年疾口呆，長口Alzheimer病禾口進行性核上性麻痹，血管性癡呆，如多發(fā)性腦梗塞性癡呆，腦炎，包括腦炎periaxialis,病毒性腦炎，如流行性腦炎，日本腦炎，St.Louis腦炎、蟀傳腦炎和西尼羅河熱，急性播散性腦脊髓炎，腦膜腦炎，如眼色素層腦膜腦炎綜合征，腦膜炎后帕金森氏病和亞急性硬化性全腦炎，腦軟化，如室周腦白質(zhì)軟化，癲癇，如全身性癲癇，包括嬰兒痙攣，失神性癲癇，肌陣攣性癲癇，包括MERRF綜合征，強直-陣攣性癲癇，部分癲癇，如復雜的部分癲癇，額葉癲癇和顳葉癲癇，創(chuàng)傷后癲癇，持續(xù)性癲癇，如持續(xù)性不全癲癇和哈-施綜合征。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治療或檢測的其它神經(jīng)病包括腦積水，如Dandy-Walker綜合征和常壓性腦積水，下丘腦病，如下丘腦腫瘤，腦型疰，發(fā)作性睡病，包括猝倒癥，球脊髓灰質(zhì)炎，腦假瘤，Rett綜合征，Reye綜合征，丘腦病，大腦弓形體病，顱內(nèi)結(jié)核瘤和澤韋^f各綜合征，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，如AIDS,癡呆復征，腦膿胂，硬膜下積膿，腦脊髓炎，如馬腦脊髓炎，委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎，引起壞死的出血性腦脊髓炎，綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎和腦型瘧。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治療或檢測的其它神經(jīng)病包括腦膜炎，如蛛網(wǎng)膜炎，無菌性腦膜炎，如病毒性腦膜炎，包括淋巴細胞慢性腦膜炎，細菌性腦膜炎，包括嗜血桿菌腦膜炎，李斯特桿菌腦膜炎，腦膜炎球菌性腦膜炎，如Waterhouse-Fridericlisen綜合征，肺炎球菌性腦膜炎和腦膜結(jié)核病，真菌性腦膜炎，如隱球菌性腦膜炎，硬腦膜下積液，腦膜腦炎，如眼色素層腦膜腦炎綜合征，脊髓炎，如橫貫性脊髓炎，神經(jīng)梅毒，如脊髓癆，脊髓灰質(zhì)炎，包括球脊髓灰質(zhì)炎和脊髓灰質(zhì)炎后綜合征，朊病毒病(如Creutzfeldt-Jakob綜合征，牛海綿狀腦病，Gerstmann-Straussler綜合征，庫魯病，瘙癢病)和大腦弓形體病。本發(fā)明的經(jīng)修飾融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可以治療或檢測的其它神經(jīng)病包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，如腦腫瘤，包括小腦腫瘤，如幕下腫瘤，腦室腫瘤，如脈絡(luò)叢腫瘤，下丘腦腫瘤和幕上腫瘤，腦脊膜胂瘤，脊髓腫瘤，包括硬膜外腫瘤，脫髓鞘病，如腦海綿變性，彌散性大腦sculleries,包括sadreno腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，腦炎periaxialis,J求狀體細胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，泛化性腦硬化癥，如異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，過敏性腦脊髓炎，引起壞死的出血性腦脊髓炎，進行性多灶性白質(zhì)腦病，多發(fā)性硬化，腦橋中央髓鞘溶解，橫貫性脊髓炎，視神經(jīng)脊髓炎，瘙癢病，搖擺病，慢性疲勞綜合征，綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎，高壓神經(jīng)綜合征，假性腦脊膜炎，脊髓病，如先天性肌弛緩，肌萎縮性側(cè)索硬化，脊髓性肌萎縮，如韋德尼希-霍夫曼綜合征，脊髓受壓，脊髓腫瘤，如硬膜外腫瘤，脊髓空洞癥，脊髓癆，強直人綜合征，智力低下，如Angelman綜合征，貓叫綜合征，德朗熱綜合征，唐氏綜合征，神經(jīng)節(jié)苷脂病，如G型神經(jīng)節(jié)苷脂病(MI),桑德霍夫病，泰-薩克斯病，哈特奈樸病，高胱氨酸尿癥，Laurence-Moon-Bied綜合征，Lesch-Nylian綜合征，才風糖尿病，粘膜脂質(zhì)沉積癥，如巖藻糖苦貝i積病，神經(jīng)元臘樣質(zhì)fipofuscinosis，眼腦腎綜合征，苯丙酮尿癥，如母體苯丙酮尿癥，普-威綜合征，Rett綜合征，Rubinstein-Taybi綜合征，結(jié)節(jié)性硬化癥，WAGR綜合征，神經(jīng)系統(tǒng)異常，如前腦無裂畸形，神經(jīng)管缺陷，如無腦畸胎，包括積水性無腦畸形，Amold-Chairi畸形，腦膨出，腦膜膨出，脊膜脊髓膨出，脊柱閉合不全，如嚢性脊柱裂和隱性脊柱裂。內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失調(diào)和/或疾病包括子宮能動性疾病，包括但不限于妊娠和分娩并發(fā)癥(如提前分娩，過月妊娠，自然流產(chǎn)以及分泌緩慢和停止)；和月經(jīng)周期失調(diào)和/或疾病(如痛經(jīng)和子宮內(nèi)膜異位癥)。內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失調(diào)和/或疾病包括胰腺失調(diào)和/或疾病，例如，糖尿病，尿崩癥，先天性胰腺發(fā)育不全，嗜鉻細胞瘤胰島細胞瘤綜合征；腎上腺失調(diào)和/或疾病，例如，Addison病，類皮質(zhì)酮缺乏，男性化疾病，多毛癥，庫欣綜合征，醛甾酮過多癥，嗜鉻細胞瘤；腦垂體失調(diào)和/或疾病，例如，垂體功能尤進，垂體功能減退，垂體性侏儒癥，垂體腺瘤，全垂體功能減退，肢端肥大癥，巨人癥；曱狀腺失調(diào)和/或疾病，包括但不限于甲狀腺功能亢進，曱狀腺功能減退，普魯默病，突眼性曱狀腺腫(毒性彌漫性曱狀腺肺)，毒性結(jié)節(jié)性曱狀腺腫，曱狀腺炎(橋本氏曱狀腺炎，亞急性肉芽肺性曱狀腺炎和休止的淋巴細胞性曱狀腺炎)，PendreWs綜合征，粘液性水腫，呆小病，曱狀腺毒癥，曱狀腺激素偶聯(lián)缺陷，胸腺發(fā)育不全，甲狀腺的胡特勒細胞瘤，曱狀腺癌，曱狀腺癌，甲狀腺髓樣癌；曱狀旁腺失調(diào)和/或疾病，例如曱狀旁腺功能亢進，曱狀旁腺功能減退；下丘腦失調(diào)和/或疾病。另外，內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失調(diào)和/或疾病還包括睪丸或卵巢失調(diào)和/或疾病，包括癌癥。其它睪丸或卵巢失調(diào)和/或疾病還包括例如卵巢癌，多嚢卯巢綜合征，細精管發(fā)育障礙癥，睪丸消失綜合征(雙側(cè)無睪癥)，先天性萊迪希細胞缺乏癥，隱睪癥，努南綜合征，強直性肌營養(yǎng)不良，睪丸毛細管血管瘤(良性)，睪丸和新生睪丸瘤形成。另外，內(nèi)分泌系統(tǒng)和/或激素失調(diào)和/或疾病還包括如下失調(diào)和/或疾病多腺缺乏綜合征，嗜鉻細胞瘤，成神經(jīng)細胞瘤，多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病以及內(nèi)分泌組織失調(diào)和/或癌癥。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、治療或預防生殖系統(tǒng)疾病和/或失調(diào)。本發(fā)明的組合物可以治療的生殖系統(tǒng)疾病包括但不限于生殖系統(tǒng)損傷，感染，腫瘤疾病，先天性缺損，所述疾病或失調(diào)會導致不育、妊娠或分娩并發(fā)癥以及產(chǎn)后困難。生殖系統(tǒng)失調(diào)和/或疾病包括睪丸疾病和/或失調(diào)，包括睪丸萎縮，睪丸女性化，隱睪病(單側(cè)和雙側(cè))，無睪癥，異位睪丸，附睪炎和睪丸炎(一般是由如下感染引起的淋病，腮腺炎，結(jié)核病和梅毒)，睪丸扭轉(zhuǎn)，輸精管炎結(jié)節(jié)，生殖細胞腫瘤(如精原細胞瘤，胚胎細胞瘤，畸胎瘤，絨毛膜癌，卵黃嚢瘤和畸胎瘤)，基質(zhì)腫瘤(如萊迪希細胞瘤)，陰嚢積水，鞘膜積血，精系靜脈瘤，精液嚢腫，腹股溝疝和精子產(chǎn)生的疾病(如纖毛不能移動綜合征，精子，精子無活力，精子缺乏，精子減少癥和畸形精子癥)。生殖系統(tǒng)疾病還包括前列腺疾病，例如急性非-細菌性前列腺炎，慢性非-細菌性前列腺炎，急性細菌性前列腺炎，慢性細菌性前列腺炎，前列腺張力失常，前列腺病，肉芽腫性前列腺炎，軟化斑，良性前列腺肥大或增生，和前列腺肺瘤疾病，包括腺癌，移行細胞癌，導管癌和鱗狀細胞癌。另外，本發(fā)明的組合物可用于診斷、治療和/或預防陰莖和尿道疾病，包括炎性疾病，例如陰莖頭包皮炎，干燥性龜頭炎，包莖，嵌頓包莖，梅毒，單純皰滲病毒，淋病，非-淋菌性尿道炎，衣原體，支原體，毛滴蟲，HIV,AIDS，Reiter綜合征，尖銳濕疣，扁平濕疣和珍J朱狀陰莖丘療，尿道異常，如尿道下裂，尿道上裂和包莖，惡變前損害，包括凱臘增殖性紅扭王，逢包恩病，鮑恩病才羊丘滲病，Buscke-Lowenstein的criant濕祝和祝^l犬癌；陰莖癌，包括鱗狀細胞癌，原位癌，疣狀癌和彌散性陰莖癌；尿道腫瘤疾病，包括陰莖尿道癌，尿道球膜癌和前列腺尿道癌；和勃起疾病，如陰莖異常勃起，Peyronie病，勃起機能障礙和陽萎。另外，輸精管疾病和/或病癥包括輸精管炎和CBAVD(先天性雙側(cè)輸精管缺失)；另外，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、治療和/或預防精嚢疾病和/或病癥，包括棘球蚴病，先天性chioride腹瀉和多嚢腎病。其它男性生殖系統(tǒng)失調(diào)和/或疾病包括例如克蘭費爾特綜合征、Young綜合征、早泄、糖尿病、嚢性纖維化、Kartagener綜合征、高熱、多發(fā)性硬化和男子乳腺發(fā)育。另外，本發(fā)明的多核苷酸、經(jīng)修飾的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、治療和/或預防陰道和外陰疾病和/或病癥，包括細菌性陰道炎、念珠菌性陰道炎、單純皰疹病毒、軟下疳、腹股溝肉芽肺、性病淋巴肉芽腫、疥瘡、人乳頭瘤病毒、陰道創(chuàng)傷、外陰創(chuàng)傷、腺病、衣原體性陰道炎、淋病、滴蟲性陰道炎、尖銳濕疣、梅毒、觸染性軟疣、萎縮性陰道炎、Paaet病、苔癬硬結(jié)、扁平苔癬、外陰痛、中毒性休克綜合征、陰道痙攣、外陰陰道炎、外陰前庭炎和腫瘤疾病，例如鱗狀細胞增生、明細胞癌、基底細胞癌、黑素瘤、Bartholin腺癌和外陰intraepaelial瘤形成。子宮病癥和/或疾病包括痛經(jīng)、子宮后傾、子宮內(nèi)膜異位癥、纖維瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、無排卵出血、無月經(jīng)、Cushiner綜合征、葡萄胎、子宮腔粘連綜合征、早發(fā)絕經(jīng)、青春期早熟、子宮息肉、功能障礙性子宮出血(例如由異常激素信號引起的子宮出血)和腫瘤疾病，例如腺癌、平滑肌肉瘤和肉瘤。另外，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于診斷、治療和/或預防如下所述的先天性子宮異常，并可用作這些疾病的標記或檢測劑，所述疾病包括例如雙角子宮、有隔子宮、單純的單角子宮、具有非-腔性未成熟角的單角子宮、具有非-通腔性未成熟角的單角子宮、具有通腔性角的單角子宮、弓形子宮、雙子宮和T-形子宮。卵巢疾病和/或病癥包括排卵、多嚢卵巢綜合征(Stein-Leventhal綜合征)、卵巢嚢腫、卵巢功能減退、卵巢對促性腺激素類不敏感、卵巢過量產(chǎn)生雄激素、右卵巢靜脈綜合征、無月經(jīng)、多毛癥和卵巢癌(包括但不限于原發(fā)性和繼發(fā)性癌生長、Sertoli-Leydig腫瘤、卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、卵巢乳頭狀漿液性腺癌、卵巢粘液腺癌和卵巢克魯肯貝格瘤)。子宮頸疾病和/或病癥包括宮頸炎、慢性宮頸炎、粘液膿性宮頸炎和宮頸發(fā)育異常、宮頸息肉、Naboth嚢腫、宮頸糜爛、宮頸功能不全和宮頸腫瘤(包括例如宮頸癌、鱗狀上皮化生、鱗狀細胞癌、腺鱗狀細胞瘤形成和柱狀細胞瘤形成)。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療或檢測感染因子。例如，通過增強免疫應答，特別是增強B和/或T細胞的增殖和分化，即可治療感染性疾病。通過增強現(xiàn)有的免疫應答，或通過本發(fā)明的融合蛋白和/或起始新的免疫應答，即可增強免疫應答?；蛘?，編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸也可直接抑制感染因子，而不必引發(fā)免疫應答。病毒是可導致疾病或癥狀的感染因子的一個例子，本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可治療或^^測所述疾病或癥狀。病毒的例子包括但不限于下述DNA和RNA病毒和病毒科蟲i某病毒、A泉病毒一+、沙4立病毒-+、Arterivirus、Bimaviridae、布尼病毒牙牛、嵌杯狀病毒科、Circoviridae、冠狀病毒科、登革病毒、EBV、HIV、黃病毒科、嗜肝DNA病毒科、肝炎病毒、皰疹病毒科(例如巨細胞病毒、單純皰滲病毒、帶卄夫皰滲)、Mononegavims(io葛'J粘病毒牙牛、麻滲病毒、彈4夫病毒科)、正粘病毒科(如曱型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒)、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒科、細小病毒科、小RNA病毒科、痘病毒科(如小痘病毒或痘苗病毒)、呼腸病毒科(如輪狀病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(HTLV-I，HTLV-ll，慢病毒)和披膜病毒科(如風疹病毒)。類似地，可導致能被本發(fā)明的運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸治療或檢測的疾病或癥狀的細菌和真菌因子包括但不限于下述革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌、細菌科和真菌放線菌(如Norcardia)、不動桿菌、新生隱球菌、曲霉、芽孢桿菌科(如炭疽芽孢桿菌)、擬桿菌(如脆弱擬桿菌)、芽生菌、博德特氏菌、疏螺旋體(如布氏疏螺旋體)、布魯氏菌、念珠菌、彎曲桿菌、衣原體、梭菌(如肉毒梭菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風梭菌)、球孢子菌、棒狀桿菌(如白喉棒狀桿菌)，隱球菌、皮膚真菌、大腸桿菌(如腸產(chǎn)毒性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌)、腸桿菌(如產(chǎn)氣腸桿菌)、腸桿菌科(克雷伯氏菌、沙門氏菌(如傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌)、沙雷氏菌、耶爾森氏菌、志賀氏菌)、丹毒絲菌、嗜血桿菌(如乙型流感嗜血桿菌)、螺桿菌、軍團菌(如嗜肺軍團菌)、鉤端螺旋體、李斯特氏菌(如單核細胞增生李斯特氏菌)、支原體、分支桿菌(如麻風分支桿菌和結(jié)核分支桿菌)、弧菌(如霍亂弧菌)、奈瑟氏球菌(如淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌)、巴斯德氏菌科、變形菌、假單胞菌(如銅綠色假單胞菌)、立克次氏體科、螺旋體(如密螺旋體、鉤端螺旋體、疏螺旋體)、志賀氏菌、葡萄球菌(如金黃色葡萄球菌)、腦膜炎球菌、肺炎球菌和鏈球菌(如肺炎鏈球菌和A、B和C組鏈球菌)以及脲原體。另外，可導致能被本發(fā)明的融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預防和/或診斷的疾病或癥狀的寄生蟲因子包括但不限于下述科或綱阿米巴蟲、巴貝西蟲、球蟲、隱孢子蟲、雙核阿米巴蟲、馬類推蟲、外寄生蟲、賈第蟲、蠕蟲、利什曼原蟲、血吸蟲、泰累爾氏梨漿蟲、弓形體、錐蟲以及滴蟲和孢子蟲(如間日瘧原蟲、日發(fā)惡性瘧原蟲、三曰癡原蟲和卵形瘧原蟲)。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于分化、增殖和吸引細胞，導致組織再生(參見Science276:59-87(1997))。組織再生可用于修復、替代或保護被先天性缺損、創(chuàng)傷(傷口、燒傷、切口或潰瘍)、年齡、疾病(如骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、牙周疾病、肝衰竭)、手術(shù)(包括美容整形外科手術(shù))、纖維癥、再灌注損傷或全身性細胞因子損害而損害的組織。使用本發(fā)明可以再生的組織包括器官(如胰腺、肝臟、腸、腎臟、皮膚、內(nèi)皮)、肌肉(平滑肌、骨骼肌或心肌)、脈管系統(tǒng)(包括血管和淋巴管)、神經(jīng)、造血和骨骼(骨、軟骨、跟腱和韌帶)組織。優(yōu)選發(fā)生再生時不結(jié)?；蛏俳Y(jié)瘢。再生也可包括血管生成。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可用于治療、預防、診斷和/或預測胃腸道病癥，包括炎性疾病和/或狀態(tài)、感染、癌癥(如腸癌(小腸類癌瘤、小腸非-何杰金氏淋巴瘤、小腸淋巴瘤))和潰瘍，如消化性潰瘍。胃腸病癥包括吞咽困難、吞咽痛、食管炎癥、消化食管炎、胃逆流、粘膜下纖維化和結(jié)構(gòu)、Mallory-Weiss損害、平滑肌瘤、脂肪瘤、上皮癌、腺癌、胃潴留病、腸胃炎、胃萎縮、胃癌、胃息肉、自身免疫病(如惡性貧血)、幽門狹窄、胃炎(細菌性、病毒性、嗜酸性粒細胞性、緊張-誘發(fā)的、慢性侵蝕性、萎縮性、漿細胞性和Menetrier胃炎)和腹膜病(如乳糜性水腹、腹腔積血、腸系膜嚢腫、腸系膜淋巴結(jié)炎、腸系膜血管阻塞、脂膜炎、腫瘤、腹膜炎、氣腹、bubphrenic膿腫。胃腸病癥還包括與小腸有關(guān)的病癥，如吸收不良綜合征、膨脹、腸道易激綜合征、糖不耐受、乳糜瀉病、十二指腸潰瘍、十二指腸炎、熱帶口炎性腹瀉、惠普爾病、腸淋巴管擴張、節(jié)段性回腸炎、闌尾炎、回腸梗阻、美克耳氏憩室、多憩室、小腸和大腸完全旋轉(zhuǎn)障礙、淋巴瘤以及細菌和寄生蟲疾病(如旅行者腹瀉，傷寒和副傷寒，以及霍亂、蛔蟲(AscariasisItimbricoides)、4勾蟲(Anclostomaduodenale)、纟戔蟲(Enterobiusvermicularis)、絳蟲jaeniasaginata、細粒棘球絳蟲、裂頭絳蟲和T.SOHUM的感染)。肝臟疾病和/或病癥包括肝內(nèi)膽汁淤積(Alagille綜合征、膽汁性肝硬化)、脂肪肝(酒精性脂肪肝、萊耶綜合征)、肝靜脈血栓形成、肝豆狀核變性、肝大、肝肺綜合征、肝腎綜合征、門靜脈高壓(食管和胃靜脈曲張)、肝膿腫(阿米巴性肝膿腫)、肝硬化(酒精性、膽和實驗性肝硬化)、酒精性肝病(月旨肪肝、肝炎、肝硬化)、寄生蟲性肝病(肝棘球蚴病、片形吸蟲病、阿米巴性肝膿腫)、黃疸(;容血、肝細胞和膽汁淤積型黃疸)、膽汁淤積、門靜脈高壓、肝腫大、腹水、肝炎(酒精性肝炎、aniffial肝炎、慢性肝炎(自身免疫性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、藥物-誘發(fā)的肝炎)、中毒性肝炎、病毒性人類肝炎(曱型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎)、Wilson病、肉芽腫性肝炎、繼發(fā)性膽汁性肝硬化、肝性腦病、門靜脈高壓、血管曲張、肝性腦病、原發(fā)性膽血管瘤、膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝細胞腺瘤、肝結(jié)石、肝衰竭(肝性腦病、急性肝衰竭)和肝腫瘤(血管肌脂瘤、鈣化肝轉(zhuǎn)移、嚢性肝轉(zhuǎn)移、上皮腫瘤、纖維層肝癌、灶性結(jié)節(jié)狀增生、肝腺瘤、肝膽嚢^^瘤、肝胚細胞瘤、肝細胞癌、肝細胞癌、肝癌、肝血管內(nèi)皮瘤、間葉性錯構(gòu)瘤、肝間質(zhì)瘤、結(jié)節(jié)再生性增生、良性肝腫瘤(肝嚢肺、單純性嚢肺、多嚢肝病、肝膽嚢腺瘤、膽總管嚢腫、間質(zhì)腫瘤、間葉性錯構(gòu)瘤、嬰兒血管內(nèi)皮瘤、血管瘤、紫癜性肝炎、脂肪瘤、炎性假腫瘤、各種上皮腫瘤、膽管上皮(膽管錯構(gòu)瘤、膽管腺瘤)、肝細胞(腺瘤、灶性結(jié)節(jié)狀增生、結(jié)節(jié)再生性增生)、惡性肝腫瘤(肝細胞、肝胚細胞瘤、肝細胞瘤、膽管細胞、膽管癌、嚢腺癌、血管腫瘤、血管肉瘤、卡波濟氏肉瘤、血管內(nèi)皮瘤、其它腫瘤、胚胎肉瘤、纖維肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、癌肉瘤、畸胎瘤、類癌瘤、鱗狀癌、原發(fā)性淋巴瘤))、肝紫癜、紅肝卟p林癥、肝吟啉癥(急性間歇性卟啉癥、遲發(fā)性皮膚卟啉癥)、ZelliNeger綜合征)。胰腺疾病和/或病癥包括急性胰腺炎、慢性胰腺炎(急性壞死性胰腺炎、酒精性胰腺炎)、腫瘤(胰腺腺癌、嚢腺癌、胰島瘤、胃泌素瘤和glucacronoma、cysticcitmeoplasms、胰島細胞瘤、胰胚細胞瘤)以及其它胰腺疾病(如嚢性纖維化、嚢腫(胰腺假嚢腫、胰腺瘺、胰腺不足))。膽嚢病包括膽結(jié)石(膽石病和膽總管結(jié)石病)、膽嚢切除術(shù)的術(shù)后綜合征、膽嚢憩室病、急性膽嚢炎、慢性膽嚢炎、膽管腫瘤和粘液嚢腫。大腸疾病和/或病癥包括與抗生素相關(guān)的結(jié)腸炎、憩室炎、潰瘍性結(jié)腸炎、獲得性巨結(jié)腸、膿腫、真菌和細菌感染、肛門直腸病(如肛裂、痔瘡)、結(jié)腸病(大腸炎、結(jié)腸腫瘤、結(jié)腸癌、腺瘤性結(jié)腸息肉(如絨毛狀腺瘤)、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸憩室炎、結(jié)腸憩室病、巨結(jié)腸、希爾施普龍病、中毒性巨結(jié)腸、乙狀結(jié)腸病、直腸結(jié)腸炎、乙狀結(jié)腸肺瘤、便秘、節(jié)段性回腸炎、腹渴(嬰兒腹瀉、痢疾)、十二指腸病(十二指腸腫瘤、十二指腸梗阻、十二指腸潰瘍、十二指腸炎)、小腸炎(小腸結(jié)腸炎)、HIV小腸病、回腸病(回腸腫瘤、回腸炎)、免疫增殖性小腸病、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎)、腸閉鎖、寄生蟲病(異尖線蟲病、小袋纖毛蟲病、酵母菌感染、隱孢子蟲病、雙核阿米巴蟲病、阿米巴痢疾、賈第蟲病)、腸瘺(直腸瘺)、腸腫瘤(盲腸腫瘤、結(jié)腸腫瘤、十二指腸腫瘤、回腸腫瘤、腸息肉、空腸腫瘤、直腸腫瘤)、腸梗阻(輸入袢綜合征、十二指腸梗阻、大便嵌塞、腸假梗阻、盲腸扭轉(zhuǎn)、腸套疊)、腸穿孔、腸息肉(結(jié)腸息肉、加德納綜合征、Peutz-jeghers綜合征)、空腸病、空腸腫瘤)、養(yǎng)料吸收障礙綜合征(盲袢綜合征、乳糜瀉、乳糖不耐受、短腸綜合征、熱帶口炎性腹瀉、惠普爾病)、腸系膜血管阻塞、腸壁嚢樣積氣、損失蛋白質(zhì)的小腸病(腸淋巴管擴張)、直腸病(肛門病、大便失禁、痔瘡、直腸炎、直腸痿、直腸脫垂、直腸膨出)、消化性潰瘍(十二指腸潰瘍、消化食管炎、出血、穿孔、胃潰瘍、佐-埃綜合征)、胃切除術(shù)后綜合征(傾倒綜合征)、胃病(如無胃酸、十二指腸胃反流(膽汁反流)、胃竇血管擴張、胃瘺、胃出口阻塞、胃炎(萎縮性或肥大性胃炎)、胃輕癱、胃膨脹、胃憩室、胃胂瘤(胃癌、胃息肉、胃腺癌、增生性胃息肉)、胃破裂、胃潰瘍、胃扭轉(zhuǎn))、結(jié)核病、內(nèi)臟下垂、嘔吐(如吐血、妊娠期強烈嘔吐、術(shù)后惡心和嘔吐)以及出血性大腸炎。其它胃腸系統(tǒng)疾病和/或病癥包括膽道疾病，如腹裂畸形、瘺(如膽管瘺、食管瘺、胃痿、腸瘺、胰腺瘺)、腫瘤(如膽道腫瘤，食管腫瘤，如食管腺癌，食管鱗狀細胞癌，胃腸腫瘤，胰腺腫瘤，如胰腺腺癌、胰腺粘液嚢腫瘤、胰腺嚢腫瘤、胰胚細胞瘤和腹膜腫瘤)、食管病(如大皰病、念珠菌病、glycoaenie棘皮癥、潰瘍、巴雷特食管血管曲張、閉鎖、嚢腫、憩室(如Zenker憩室)、痿(如氣管食管瘺)、動力病(如CREST綜合征、吞咽病、失弛緩癥、痙攣、胃食管反流)、腫瘤、穿孔(如Boerhaave綜合征、馬-韋綜合征)、狹窄、食管炎、膈疝(如裂孔疝)；胃腸病，如胃腸炎(如霍亂疾病、諾瓦克病毒感染)、出血(如嘔血、黑糞、消化性潰瘍出血)、胃腫瘤(胃癌、胃息肉、胃腺癌、胃癌))、疝(如先天性膈疝、股疝、腹股溝疝、閉孔疝、臍疝、腹病)以及腸病(如盲腸病(闌尾炎、盲腸腫瘤))。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可具有趨化活性。趨化分子將細胞(如單核細胞、成纖維細胞、嗜中性粒細胞、T-細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、上皮細胞和/或內(nèi)皮細胞)吸引或移動至身體內(nèi)的特定位點，如炎癥、感染或過度增殖的位點。然后，被移動的細胞可以戰(zhàn)勝和/或痊愈特定的創(chuàng)傷或異常。本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合蛋白和/或編碼本發(fā)明運鐵蛋白融合蛋白的多核苷酸可增加特定細胞的趨化活性。然后通過使靶向身體特定位置的細胞的數(shù)目增加，將這些趨化分子用于治療炎癥、感染、過度增殖性疾病，或任何免疫系統(tǒng)疾病。轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明的一個實施方案希望產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非-人動物，所述動物含有本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合構(gòu)建體，其具有增加的血清半壽期、增加的血清穩(wěn)定性或增加的生物可用性。在一些實施方案中，可將乳鐵蛋白用作融合蛋白的Tf部分，從而使融合蛋白產(chǎn)生并分泌至乳汁中。很多專利和出版物，如美國專利6,291，740(2001年9月18日公開)、美國專利6,281,408(2001年8月28日公開)和美國專利6,271,436(2001年8月7日公開)(其內(nèi)容皆列入本文作為參考)中已描述了轉(zhuǎn)基因非人動物的成功產(chǎn)生。改變動物，如家畜類哺乳動物(包括奶牛、豬、山羊、馬、牛和綿羊)的基因組成的能力具有多種商業(yè)用途。這些用途包括產(chǎn)生能以易于獲得的方式(如表達至乳汁或血液中)表達大量外源蛋白質(zhì)的動物，產(chǎn)生具有增加的體重、飼喂效率、軀體組成、乳汁產(chǎn)生或含量、疾病抗性和對特定微生物感染的抗性的動物，以及產(chǎn)生生長速率提高或繁殖特性增強的動物?；蚪M中含有外源性DNA序列的動物被稱為轉(zhuǎn)基因動物。使用最廣泛的、產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法是將DNA微量注射至受精胚胎的前核(Wall等，J.Cell.Biochem.49:113[1992])。其它產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法包括用逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注射胚胎。已有人報道過用野生型或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染植入前和植入后小鼠胚胎(Janenich,Proc.Natl.Acad.Sci.USA73:1260[1976];Janenich等，Cell24:519[1981];Stuhlmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:7151[1984];Jahner等，Proc.Natl.AcadSci.USA82:6927[1985];VanderPutten等，Proc.Natl.AcadSci.USA82:6148-6152[1985];Stewart等，EMBOJ.6:383-388[1987])。另一種用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎的方法是將病毒或病毒-生產(chǎn)細胞注射至小鼠胚胎的嚢胚腔(Jahner，D.等，Nature298:623[1982])。有人報道過使用微生境小鼠胚胎的子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因?qū)胄∈蠓N系(Jahner等，文獻同上[1982])。也有人報道過用逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染牛和綿羊胚胎以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。這些方法包括將逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；蚰芘懦瞿孓D(zhuǎn)錄病毒顆粒的生長停滯細胞(即經(jīng)絲裂霉素C-處理過的細胞)微量注射至受精卵或早期胚胎的卵周隙(PCT國際申請WO90/08832[1990];HaskellandBowen,Mol.Reprod.Dev.,40:386[1995])。PCT國際申請WO90/08832描述了將野生型豬白血病病毒B注射至2至8細胞期綿羊胚胎的卵周隙。已證實得自經(jīng)注射胚胎的胎兒含有多個整合位點。美國專利6,291,740(2001年9月18日公開)描述了通過使用轉(zhuǎn)導分裂細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(如衍生自鼠白血病病毒[MLV]的載體)，將外源性DNA導入成熟前的卵母細胞和成熟的未受精卵母細胞(即受精前的卵母細胞)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。該專利還描述了巨細胞病毒啟動子驅(qū)動以及小鼠乳腺腫瘤LTR表達多種重組蛋白質(zhì)所用的方法和組合物。美國專利6,281，408(2001年8月28日公開)描述了使用胚胎干細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法。簡單地說，在與桑椹胚的混合細胞共-培養(yǎng)物中使用胚胎干細胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。在共培養(yǎng)之前通過例如電穿孔、微量注射或逆轉(zhuǎn)錄病毒傳遞將外源遺傳物質(zhì)導入胚胎干細胞。經(jīng)由選擇標記，如新霉素選擇按照此方式轉(zhuǎn)染的ES細胞用于整合基因。美國專利6,271,436(2001年8月7日公開)描述了使用下述方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，所述方法包括分離原生殖細胞，培養(yǎng)這些細胞以產(chǎn)生衍生自原生殖細胞的細胞系，轉(zhuǎn)化原生殖細胞和經(jīng)培養(yǎng)的細胞系，使用這些經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞和細胞系產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的效率大大提高，籍此可以使用同源重組來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的非-嚙齒類動物?；蛑委煴景l(fā)明的一個實施方案希望使用經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合構(gòu)建體進行基因治療，其中經(jīng)修飾的運鐵蛋白或運鐵蛋白結(jié)構(gòu)域與治療性蛋白質(zhì)或肽相連接。具有增加的血清半壽期或血清穩(wěn)定性的本發(fā)明的經(jīng)修飾運鐵蛋白融合構(gòu)建體非常適合基因治療。已有人描述過成功使用基因治療表達出可溶性融合蛋白。簡單地說，最近，Ijima等，(June10，2001)HumanGeneTherapy(美國)12/9:1063-774皮露了經(jīng)由注射腺病毒載體而進行的基因治療，所述載體含有編碼可溶性融合蛋白的基因，所述融合蛋白由細胞毒淋巴細胞抗原4(CTLA4)和人免疫球蛋白Gl的Fc部分組成。在該基因治療應用中，通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射載體成功治療了由II型膠原引發(fā)的關(guān)節(jié)炎鼠模型?；蛑委熞裁枋鲇诙嗥绹鴮＠?，包括美國專利6，225,290(2001年5月1日公開)；美國專利6,187,305(2001年2月13日公開)；和美國專利6，140,111(2000年10月31日公開)。美國專利6,225,290提供了方法和構(gòu)建體，籍此可對哺乳動物受試者的腸上皮細胞進行基因改變，從而可操作地摻入能表達出具有所需療效的蛋白質(zhì)的基因。通過施用主要由棵DNA組成的制劑即可完成腸細胞轉(zhuǎn)化，也可以口服DNA。口服或其它胃腸內(nèi)給藥途徑提供了筒單的給藥方法，而使用棵核酸能避免與使用病毒載體完成基因治療有關(guān)的并發(fā)癥。表達出的蛋白質(zhì)直接分泌至胃腸道和/或血流中以獲得蛋白質(zhì)的治療性血液水平，籍此治療需要所述蛋白質(zhì)的患者。通過過量表達蛋白質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)化的腸上皮細胞為與特定蛋白質(zhì)缺乏有關(guān)或能適應該治療的疾病提供了短期或長期的療法。美國專利6,187,305提供了在脊推動物，特別是哺乳動物來源的細胞中進行基因或DNA耙向的方法。簡單地說，通過同源重組或使已導入至原代或次級細胞基因組DNA的DNA靶向至預先選擇的位點，將DNA導入脊推動物來源的原代或次級細胞。美國專利6，140,111(2000年10月31日公開)描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體。公開的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括所需基因的插入位點，并能在多種轉(zhuǎn)染細胞類型中高水平表達衍生自所需基因的蛋白質(zhì)。該專利還公開了一類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述載體缺乏選擇標記，因此適于人類基因治療，無需共-表達標記產(chǎn)物，如抗生素即可治療多種疾病狀態(tài)。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體尤其適用于某些包裝細胞系。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體插入哺乳動物細胞基因組的能力使得它們成為特別有希望的人類和動物遺傳病基因治療的候選藥物?；蛑委熞话惆?l)在體內(nèi)將新的遺傳物質(zhì)添加至親代細胞中，或(2)從體內(nèi)除去親代細胞，在細胞中添加新的遺傳物質(zhì)并將它們重新導入體內(nèi)，即體外基因治療。有關(guān)如何使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在多種細胞中進行基因治療的討論可參見例如1989年9月19日公開的美國專利4,868,116和1990年12月25曰公開的美國專利4,980，286(上皮細胞)，1989年8月10日公開的WO89/07136(肝細胞)，1990年7月25日公開的EP378,576(成纖維細胞)以及1989年6月15日公開的WO89/05345和1990年6月28日公開的WO/90/06997(內(nèi)皮細胞)，所述專利的內(nèi)容皆列入本文作為參考。無需繼續(xù)描述，就可以相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用上文的描述和下文例舉的實施例制備和利用本發(fā)明，并且實踐所要求的方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測定本發(fā)明融合蛋白構(gòu)建體與其處于非融合狀態(tài)的治療性組成成分類似活性相比較的體外和體內(nèi)生物活性。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測定本發(fā)明構(gòu)建體的血清半壽期和血清穩(wěn)定性。因此，下文的工作實施例具體指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但不能將這些實施例理解為對其余內(nèi)容的限制。實施例實施例l通過融合一個或多個拷貝的編碼抗融合HIV-1肽(T-20)的核苷酸序列與TF的核苦酸序列，制備出含該序列的經(jīng)修飾Tf和所述肽的融合蛋白，所產(chǎn)生的融合蛋白具有與Tf的N-或C-末端融合的肽。在一個實施方案中，融合蛋白的Tf部分被改造，使得當在酵母中生產(chǎn)時不會糖基化。如上所述，人運鐵蛋白在大約N413和大約N611處有兩個N-聯(lián)糖基化位點。N-聯(lián)糖基化位點含有序列N-X-S/T。在一個實施方案中，N(Asn)變?yōu)镼(Gln);也可以進行其它改變，例如Asn變?yōu)锳la或Ser變?yōu)槿魏纹渌被?。具體地說，通過使用dut-和ung-法進行寡核苷酸定點誘變，將N413和N611密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)镚AT和GAC。參見Kunkel等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82:488-492。合成致突變的寡核苷酸5'-GCAGAAAACTACGATAAGAGCGATAAT-3，(SEQIDNO:9)和5，-CTATTTGGAAGCGACGTAACTGACTGC-3，(SEQIDNO:IO)，使用這些寡核苷酸，根據(jù)Funk等(美國專利5，986,067)的方法誘變N413和N611密碼子。然后通過突變下述鐵和/或碳酸根離子結(jié)合殘基來破壞受體結(jié)合和/或鐵或碳酸鹽結(jié)合鐵結(jié)合N結(jié)構(gòu)域C結(jié)構(gòu)域Asp63(SEQIDNO:2的Asp82)Asp392(SEQIDNO:2的Asp411)Tyr95(SEQIDNO:2的Tyr114)Tyr188(SEQIDNO:2的Tyr207)His249(SEQIDNO:2的His268)Tyr426(SEQIDNO:2的Tyr445)Tyr514或517(SEQIDNO:2的Tyr533或Tyr536)His585(SEQIDNO:2的His604)碳酸根離子結(jié)合N結(jié)構(gòu)域C結(jié)構(gòu)域Thr120(SEQIDNO:2的Thr139)Arg124(SEQIDNO:2的Arg143)Ala126(SEQIDNO:2的Ala145)Gly127(SEQIDNO:2的Gly146)Thr452(SEQIDNO:2的Thr471)Arg456(SEQIDNO:2的Arg475)Ala458(SEQIDNO:2的Ala477)Gly459(SEQIDNO:2的Gly478)通過多種技術(shù)可以完成鐵結(jié)合缺損突變體的制備。參見美國專利5,986,067。使用Nelson,R.M.andLong,G.L.(1989)Analyt.Biochem.180:147-151的方法制備D63S取代。簡單地說，將hTF/2N編碼序列5，末端的Hpall/BamHI片段亞克隆至pUC18，然后用作模板以進行基于兩步PCR的誘變程序。通過XbaI和BamHI消化從雙鏈形式的測序載體中釋放出片段，將所述片段與原先的人Tf構(gòu)建體的BamHI/Hindlll片段連接，產(chǎn)生全長的D63S-編碼序列，通過限制性消化分析證實剪接的保真性。為了在畢赤氏酵母中表達，可以使用RCT/Invitrogen的系統(tǒng)。可以獲得三種適于多拷貝表達的載體pPIC9K,pPIC3.5K和pA0815。例如，可以使用允許分泌至生長培養(yǎng)基中的pPIC9K載體。通過重疊PCR誘變來改變運鐵蛋白cDNA的末端，從而將經(jīng)修飾的運鐵蛋白序列克隆至pPIC9K載體，產(chǎn)生載體pREX0010。從載體和編碼序列內(nèi)除去或在其中添加多個限制性位點以有助于后面的克隆步驟(圖5)。HIV抗-融合肽DP-178的序列也已知為T-20。該肽提供自身與運鐵蛋白的N-或C-末端融合，因為該肽需要自由移動以滿足其功能。DP-178序列YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQIDNO:4)當反向翻譯成DNA(使用最適于酵母的密碼子)時，獲得下列序列(SEQIDNO:13和14):ttggaattagataaatgggc5Lagtttgtggaaittggtttleldkwaslwnwf為了插入上述序列，用限制性酶XbaI/KpnI消化具有經(jīng)修飾運鐵蛋白cDNA的載體pREX0010以在5，末端插入，用SalI/HindIII消化所述載體以在3,末端插入。為了在5，末端插入，合成兩個在上文所述DP-178序列的5，末端形成XbaI突出端和在所述序列的3，末端形成KpnI突出端的重疊寡核苷酸。然后使這些寡核苷酸一起退火(見下文)，連接至經(jīng)Xba1/KpnI消化的pREX0010載體。ctagagaaaaggtacactagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaatttctttt:ccatgtgatcgaattatgtgaggaattaact:tcttagcgttttggtcgttcttttcttacttgttcttaaattggaattagataaa仁gggcaagtttgtggaattggtttgtactsaccttastctstttscccgttcasacsccttsaccassSEQIDNOS:15和16插入退火的寡核苷酸導致插入后丟失了KpnI位點。導致產(chǎn)生載體pREX0011(圖6)。為了在C-末端插入，通過在5，末端添加SalI位點，在3，末端添加Hindl11位點而采取類似的方法(圖7)。然后，按照InvitrogenPichiaExpression試劑盒4喿作手冊所述進行轉(zhuǎn)化、選擇和表達。實施例2使用反向翻譯的人INGAP氨基酸序列制備INGAP融合物。蛋白質(zhì)序列如下sp|Q92778|PBCG—HUMANHumanINGAPQKSGFQKWRDFNCENELPYICKFKV(SEQIDNO:17)反向翻譯成DNA(最適于酵母的密碼子)給出如下序列(SEQIDNO:18和19)。1atgatgttgccaatgactttgtgtagaatgtct仁ggatgttgttgtcttgtttgatgtttmmlpmtlcrmswmlisclmf61ttgtcttgggttgasggtga3ga3tctcaaa3aaa_3ttgccatcttctagaattacttgtlswvegeesqkk1pssrite121ccacaaggttctgttgcttatggttcttattgttattctttgattttgattccacaaactpqgsvaygsycyslilipqt181tggtctaatgctgaattgtcttgtcaaatgcatttttctggtcatttggcttttttgttgwsnaeiscqtnhfsghlafll241tctactggtgaaattacttttgtttcttctttggttaaaaattctttgactgcttatcaastgeitfvsslvknsltayq301tat[atttggattggtttgcatgatccatctcatggtactttgccaaatggttct]ggttggyiwiglhdpshgtlpngsgw361aaatggtcttcttctaatgttttgactttttataattgggaaagaaatccatetattgetkwsssnvltfynwernpsia421gctgatagaggttattgtgctgttttgtctcaaaaatctggttttcaaaaatggagagatadrgycavisqks9"fqkwrd481tttaattgtgaaaatgaattgecatatatttgtaaatttaaagttfnceneipyickfkv最可能的前導序列裂解位點是上述下劃線序列末端的KK。一個可用于產(chǎn)生表達與運鐵蛋白N-或C-末端融合的INGAP的構(gòu)建體的方法學是合成一系列設(shè)計自上述序列(減去下劃線的前導序列)的重疊寡核苷酸。退火這些引物可產(chǎn)生INGAPcDNA。使用為5，和3，末端設(shè)計的不同寡核苦酸，可將退火的cDNA連接至pREX0010中運鐵蛋白的5，或3，末端。括號中的序列是用于誘導INGAP活性的肽。因此，在全序列和這一最短必需序列之間的某些位點處，序列可以配對。N-末端融合對于N-末端而言，它應具有能在5，末端形成XbaI位點的突出端和能與3，末端的KpnI位點相容，但會導致KpnI位點被破壞的突出端。1ggttgccatcttccagaattacttgtccacaaggttctgttgcttatggttcttttccaacggtagaaggtcttaatgaacaggtgttccaagacaacgaatacca1ekir1pssritcpqgsvayg61tcttattgttattctttgattttgattccacaaacttggtetaatgetgaattgtcttgtagaataacaataagaaactaaaactaaggtgt-ttgaaccagattacgacttaacsgaacasycys1i1ipqtwsn3s1sc121caaatgcatttttctggtcatttggcttttttgttgtctactggtgaaattacttttgttgtttacgtaaaaagsccagtgaccactttaatga_aaacaaqmhfsgh1aflistgeitfV181tcttctttggttaaaaattctttgactgcttatcaatatatttggattggtttgestgataatttttaagatagttatataaaegtsctass1vkris1taygyiwig1hd241ccatctcatggtactttgccaaatggttctggttggaaatggtcttcttctaatgttttgggtagagtaccatgaaacggtttaccaagaccaacctttaccagaagaagattacaaaacpshgtlpngsgwkwsssnvl301actttttacaattgggaaagaaatccatctattgctgctgatagaggttattgtgctgtttgaaaaatgttaaccctttctttaggtagataacgacgactatctccaataacacgacaatfynwernpsiaadrgycav3S1421ttgtctcaaaaatctggttttcaaaaatggagagattttaattgtgaaaatgaattgccaaacagagtttttagaccaaaagtttttacctctctaaaattaacacttttacttaacggtlsqksgfqkwrdfncenelptatatttgtayicttaaatttcakfktgtacSEQIDNOS:20和21用Xbal和Kpnl消化pREX0010，連接上述序列產(chǎn)生載體pREX0013(圖8)。C-末端融合對于C-末端而言，5，末端會形成SalI位點，而3，末端具有終止密碼子加上HindIII位點。Sail61121181241301361tcgscctttgccatcttccagaattacttgtccacaaggttctgttgcttstggttcttaggaaacggtagaaggtcttaatgaacaggtgttccaagacaacgaataccaagaatrplpssritcpqgsvaygsttgttattctttgattttgattccacasacttggtctaatgctgssttgtcttgtcaaataacaataagaaactaaaactaaggtgtttgaaccagattacgacttaacagaacagtttaycyslilipqtwsnaelscqgcatttttctggtcatttggcttttttgttgtctactggtgaaattacttttgtttcttccgtaaaasgaccagtaaaccgaaaaaacaacagatgaccactttaatgaasacaaagaagmhfsghlafllstgeitfvstttggttaaaaattctttgactgcttatcaatatatttggattggtttgcatgatccatcaaaccaatttttaagaaactgacgaatagtta仁ataaacctaaccaaacgtactaggtagslvknsltayqyiwiglhdptcatggtactttgccaaatggttctggttggaaatggtcttcttctaatgttttgactttagtaccatgaaacggtttaccaagaccaacctttaccagaa_gaa_gatta_ca_a_aactga_aashgtlpngsgwkwsssnvltttacaattgggaaagaaatccatctattgctgctgatagaggttattgtgctgttttgtcaatgttaaccctttctttaggtagataacgacgactatctccastaacacgacaaaacagfynwernpsiaadrgycavltcaaaaatctagtttttagssqksggttttcaaaccaaaagtttgfqttacctctctkwrttttaattgtdfncgaasiatgaatcttttacttatgccstatstacggtatata1pyHindiII421ttgtaaatttaaagtttaata33cattt3aaickftttcaaattattcgakv-SEQIDNOS22和23用SalI和HindlII消化pREX0010，連接上述序列產(chǎn)生載體pREX0014(圖9)。然后，按照InvitrogenPichiaExpression試劑盒操作手冊所述進行轉(zhuǎn)化、選擇和表達。實施例3已證實下文給出的肽可通過導致EPO受體的二聚體化來模擬EPO活性。環(huán)形的所述肽與EPO沒有同源性。為了活性，所述肽不得不與另一種肽(即作為二聚體)一同起作用，.使得兩拷貝的受體靠得足夠近以形成活性復合物。對很多種肽來說，肽二聚體僅有短暫的半壽期，它可以從與運鐵蛋白的融合中獲利得到延長的半壽期。在此實施例中，兩個肽被添加至運鐵蛋白骨架中。1ggtggtacttactcttgtcattttggtccattgacttgggtttgtaagccacaaggtggtggtyschfgpltwvckpqggSEQIDNO:24和25。如Ali等人的詳細描述，可以在運鐵蛋白的His289和Gly290之間成功添加肽。運鐵蛋白分子固有的重復(兩個結(jié)構(gòu)域互相反映)意味著可以將肽插入C結(jié)構(gòu)域重復區(qū)域的Glu625和Thr626之間。<image>imageseeoriginaldocumentpage277</image>SEQIDNO:26和27。每個插入需合成兩個重疊的致突變引物(見下文)。使用pREX0010作為模板，用每個致突變引物和得自TfcDNA5，或3，末端的外部引物進行反應。然后混合這兩個反應的產(chǎn)物，用外部引物進行進一步反應以將兩個產(chǎn)物連接在一起。用XbaI和HpaI消化His289-Gly290插入物PCR產(chǎn)物以連接至經(jīng)Xbal/Hpal消化的pREX0010。然后用Hpal和SalI消化所得載體以連4妄至經(jīng)Hpal/Sall消化的Glu625-Thr626插入物PCR產(chǎn)物。His289-Gly290插入物(SEQIDNO:28)(<image>imageseeoriginaldocumentpage277</image>>....................................Tf....................................>>.................................Ndomain.................................>Gki625'Thr626插入物(SEQIDNO:29)?！?------------3081cctatttggaagcaacgtaactgactgctc[gggcaacttttgtttgttccggtcggaaggtggtacttacggataaaccttcgttgcattgactgacgagcccgttgaaaacaaacaaggccagccttccaccatgaat[g>>...EPOm...>>.................................Cdomain.................................>>....................................Tf....................................>Kpnl3151tcttgtcattttggtccattgacttgggtttgtaagccac]aaggtggtaccaaggaccttctgttcagagagaacagtaaaaccaggtaactgaacccaaacattcggtgttccaccatggttcctggaagacaagtctc-----------》>......................ElPOm.......................>>>.................................Cdomain.................................>>....................................Tf....................................>3221atgacacagtatgtttggccasacttcatgacagaaacacatatgaaaaatacttaggagaagaatatgttactgtgtca]tacaaaccggtttgaagtactgi:ctttgtgtatactttttatgaatcctcttcttataca>.................................Cdomain.................................>>....................................Tf....................................>如此獲得質(zhì)粒pREX0015(圖10)。按照InvitrogenPichiaExpression試劑盒操作手冊所述進行轉(zhuǎn)化、選擇和表達。其它可替代的能插入EPO模擬肽或任何其它肽的位點是運鐵蛋白C結(jié)構(gòu)域上的兩個lt基化位點N413和N611。該位點的優(yōu)點是在一個和相同的事件中可獲得插入，同時能通過破壞N-X-S/T序列防止糖基化。實施例4通過融合抗RSV融合抑制劑肽序列與Tf的N-或C-末端，或通過將所述序列插入Tf環(huán)中，即可制備出Tf和所述肽之間的融合蛋白，其中已對Tf進行過修飾使其不能結(jié)合鐵和/或Tf經(jīng)修飾后能防止糖基化。RSV肽可包括T786:VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV(SEQIDNO:5)和/或T1584:AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL(SEQIDNO:6)。T786肽具有RK二肽，它可用作酵母蛋白酶Kex2p的裂解位點。這可導致產(chǎn)生截短的肽。因此，該肽可由RK修飾成RE。比T786更強的另一種形式的T786肽T112(VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLHNV,SEQIDNO:7)的非融合形式存在溶解性問題。因此，還需制備出由RK修飾為RE的T112形式，以產(chǎn)生與Tf融合的肽形式。為了產(chǎn)生基因構(gòu)建體，適當時可使用人、酵母或任何其它生物體的密碼子偏好性將肽序列反向翻i,成DNA。實施例5多種細胞因子可與Tf的N-、C-或N-和C-末端融合。使用經(jīng)修飾運鐵蛋白的不同部分或結(jié)構(gòu)域，如N結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域，也可構(gòu)建這些融合物?？芍苯尤诤系鞍踪|(zhì)，或使用不同長度的接頭肽融合蛋白質(zhì)。也可以在運鐵蛋白骨架內(nèi)融合全部或部分活性細胞因子?？赏ㄟ^多種方法，例如通過RT-PCR由mRNA、從cDNA文庫中分離所需細胞因子，如EPO的cDNA，通過由重疊寡核苷酸合成構(gòu)建所述cDNA，通過PCR或其它本領(lǐng)域已知的方法分離得到所述cDNA(所有方法都使用標準方法)。所有這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列在例如美國專利4,703,008，4,810,643和5,908,763以及公共數(shù)據(jù)庫，如GenBank中都是已知的和可以獲得的?？蓪DNA的5，和3，末端進行修飾以產(chǎn)生限制性位點，使得可以使用寡核苷酸接頭將該cDNA克隆至含有運鐵蛋白cDNA的載體中。細胞因子cDNA可以位于運鐵蛋白序列的N-或C-末端，可以使用或不使用間隔序列，或者可將細胞因子的cDNA插入運鐵蛋白的cDNA中。將細胞因子，如EPO和TfcDNA克隆至載體中，然后從載體中切下完整的表達盒，插入表達載體以在酵母(或任何其它適當?shù)谋磉_系統(tǒng))中表達融合蛋白。然后從培養(yǎng)基中收集和純化酵母分泌的融合蛋白并檢測其生物活性。為了在哺乳動物細胞系中表達，可采用類似的方法，不同之處在于所用表達盒使用的是哺乳動物啟動子、前導序列和終止子。然后切下表達盒，插入適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞系的質(zhì)粒中。實施例6多種干擾素可與經(jīng)修飾運鐵蛋白的N-、C-或N-和C-末端融合。使用運鐵蛋白的不同部分或結(jié)構(gòu)域，如N結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域，也可構(gòu)建這些融合物?？芍苯尤诤系鞍踪|(zhì)，或使用不同長度的接頭肽融合蛋白質(zhì)。也可以在運鐵蛋白骨架內(nèi)融合全部或部分干擾素?？膳cTf融合的干擾素的具體例子是干擾素-(3。可通過多種方法，例如通過RT-PCR由mRNA或cDNA、從cDNA文庫中分離所需干擾素，如千擾素(3的cDNA，通過由重疊寡核苷酸合成構(gòu)建所述cDNA,通過PCR或其它本領(lǐng)域已知的方法分離得到所述cDNA(所有方法都使用標準方法)。干擾素，如IFNa，IFN(3和IFNy的核苷酸序列在例如美國專利5,326,859、4,588,585和EP32134以及^〉共翁:據(jù)庫，如GenBank中都是已知的和可以2獲得的?？蓪DNA的5，和3，末端進行修飾以產(chǎn)生限制性位點，使得可以使用寡核苷酸接頭將該cDNA克隆至含有經(jīng)修飾運鐵蛋白cDNA的載體中。干擾素cDNA可以位于運鐵蛋白序列的N-、C-或N-和C-末端，可以使用或不使用間隔序列。將IFNp(或其它干擾素)cDNA克隆至載體中，然后從載體中切下完整的表達盒，插入表達載體以在酵母中表達融合蛋白。然后從培養(yǎng)基中收集和純化酵母分泌的融合蛋白并檢測其生物活性。為了在哺乳動物細胞系中表達，可采用類似的方法，不同之處在于所用表達盒使用的是哺乳動物啟動子、前導序列和終止子。然后切下表達盒，插入適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞系的質(zhì)粒中。與運鐵蛋白融合的IFN具有更長的半壽期，因此，融合蛋白的治療劑量比IFN少得多。因此，融合干擾素效果更好而毒性卻更低。實施例7起初發(fā)明多種單鏈抗體(SCA)是為了簡化抗體選擇和生產(chǎn)。然而，已證實由于它們太小以及體內(nèi)半壽期短，因此療效有限或根本無療效。在SCA中添加運鐵蛋白能顯著延長SCA的體內(nèi)半壽期。SCA可與經(jīng)修飾運鐵蛋白的N-、C-或N-和C-末端融合。使用運鐵蛋白的不同部分或結(jié)構(gòu)域，如N結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域，也可進行所述融合?？芍苯尤诤系鞍踪|(zhì)，或使用不同長度的接頭肽融合蛋白質(zhì)。也可以在運鐵蛋白骨架內(nèi)融合全部或部分活性SCA。在這種情況下，通過將SCA的cDNA插入運鐵蛋白的cDNA中來制備融合蛋白，從而在細胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)?？膳c運鐵蛋白融合的SCA的具體例子是抗-TNF(腫瘤壞死因子)。已使用抗-TNF治療多種炎癥和自身免疫病。TNF-SCA可與經(jīng)修飾運鐵蛋白的N-或C-末端融合，融合方式可以是TNF-SCA的編碼N-末端與運鐵蛋白C-末端氨基酸直接結(jié)合，或者是TNF-SCA的C-末端氨基酸與運鐵蛋白N-末端氨基酸直接結(jié)合?；蛘?，可在運鐵蛋白和TNF-SCA之間插入肽接頭以提供更大的間距，并使兩個融合蛋白質(zhì)的空間移動性更大。圖4A-4B中顯示了TNF-SCA的幾個例子。通過幾種方法可以產(chǎn)生單鏈抗體，所述方法包括但不限于從噬菌體文庫中選擇，通過克隆抗體的cDNA并使用側(cè)翼恒定區(qū)作為引物克隆可變區(qū)，或通過合成對應于任何特定抗體的可變區(qū)的寡核苷酸來克隆特定抗體的可變區(qū)?？蓪DNA的5，和3'末端進行修飾以產(chǎn)生限制性位點，使得可以使用寡核苷酸接頭將該cDNA克隆至含有運鐵蛋白cDNA的載體中。SCAcDNA可以位于運鐵蛋白序列的N-或C-末端或N-和C-末端，可以使用或不使用間隔序列。將SCA分子cDNA克隆至載體中，然后從載體中切下完整的表達盒，插入表達載體以在酵母中表達融合蛋白。然后從培養(yǎng)基中收集和純化酵母分泌的融合蛋白并檢測其生物活性。為了在哺乳動物細胞系中表達，可采用類似的方法，不同之處在于所用表達盒使用的是哺乳動物啟動子、前導序列和終止子。然后切下表達盒，插入適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞系的質(zhì)粒中。從培養(yǎng)基中純化按照此方式產(chǎn)生的抗體，使用標準的免疫化學方法檢測其與其抗原結(jié)合的能力。實施例8CDR是與抗原相互作用的抗體可變區(qū)。它通常由相對較短的一段肽序列組成?？贵w重鏈和輕鏈一般各有3個CDR。一個或多個可與抗原相互作用的抗體CDR可與經(jīng)修飾運鐵蛋白融合以賦予運鐵蛋白分子與抗原結(jié)合的活性。CDR可與運鐵蛋白的N-，C-，N-和C-末端融合，或被插入運鐵蛋白的內(nèi)部骨架中。抗-TNF抗體的CDR序列的例子示于TNF-SCA(圖4A-4B)。對應于一個或多個CDR的cDNA可與經(jīng)修飾運鐵蛋白融合以賦予運鐵蛋白與TNF結(jié)合的活性。實施例9也可以使用運鐵蛋白融合技術(shù)改善在多個系統(tǒng)，如噬菌體展示文庫和肽文庫中發(fā)現(xiàn)的肽的治療特性。這些肽中有很多具有生物活性，但與天然蛋白質(zhì)或肽無任何同源性。由于這些肽的體內(nèi)半壽期短，因此是與經(jīng)修飾運鐵蛋白融合的良好候選者。由于它們很小，因此可與運鐵蛋白分子的多個區(qū)域融合。除了N-和C-末端外，可將它們插入運鐵蛋白內(nèi)的多個區(qū)域，包括但不限于胱氨酸環(huán)。按照此方式，運鐵蛋白內(nèi)的肽三維結(jié)構(gòu)表現(xiàn)得相對剛性。1拷貝以上的各種肽和一種以上的肽可與經(jīng)修飾運鐵蛋白融合。另外，可以使用肽序列替代運鐵蛋白部分以賦予運鐵蛋白治療活性。由于大多數(shù)肽較短，可以合成所述肽的具有適當限制性位點的cDNA以插入經(jīng)修飾運鐵蛋白cDNA。然后可將cDNA插入含有運4失蛋白cDNA的載體中，使得肽被表達為運鐵蛋白的一部分或與運鐵蛋白分子融合的融合蛋白?；蛘撸铣蒔CR引物，所述引物含有所需肽和適當?shù)倪\鐵蛋白片斷。使用這些引物擴增運鐵蛋白cDNA，導致肽與運鐵蛋白上的選定位點融合。所述肽的例子是EPO才莫擬肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQIDNO:11);DREGCRRGWVGQCKA曹N(SEQIDNO:12);和QRVEILEGRTECVLSNLRGRTRY(SEQIDNO:30)，它們與天然EPO沒有同源性，但具有類似的生物活性，因為它們能激活用作激動劑的EPO受體。這些肽也需要具有特殊的構(gòu)象來滿足其最佳活性?？蓪PO模擬肽插入(或替代)運鐵蛋白的一個或多個胱氨酸環(huán)中。按照此方式，運鐵蛋白可獲得EPO活性?？膳c運鐵蛋白融合的其它肽是具有與抗體類似的結(jié)合活性的肽。這些肽可以相對高的親和性與蛋白質(zhì)結(jié)合，并提供與抗體相同的生物學功能，但它們的體內(nèi)半壽期非常短。將這些肽與運鐵蛋白融合可賦予這些肽更長的半壽期，而不會破壞它們的結(jié)合活性。這些肽可與運鐵蛋白分子的N-或C-末端或兩端或內(nèi)部融合。所述肽也可以取代部分運鐵蛋白。另外，l拷貝以上的肽或幾種不同的肽可與單個運鐵蛋白分子結(jié)合。所述分子的例子是可結(jié)合TNF的肽。該肽與運鐵蛋白的結(jié)合賦予運鐵蛋白結(jié)合TNF并按照類似于抗-TNF抗體的方式起作用的能力。按照此方式，可以用更筒單和經(jīng)濟的制備方法制備出抗體樣分子。實施例10耙向Tf融合蛋白同時具有兩種或多種與經(jīng)修飾運鐵蛋白融合的蛋白質(zhì)或肽以用作雙功能分子。此時，經(jīng)修飾運鐵蛋白與一種蛋白質(zhì)或肽融合以具有新的生物活性，與另一種蛋白質(zhì)或肽融合以進行靶向。所述蛋白質(zhì)的例子是含有抑制性蛋白質(zhì)如endostatin和靶向肽，如SCA或可識別腫瘤的結(jié)合肽的運鐵蛋白。按照此方式，抑制性分子被靶向需要該分子的腫瘤。所需蛋白質(zhì)的cDNA可分離自cDNA文庫，或可使用標準的分子生物學方法，用幾個重疊寡核苷酸引物合成制備所述cDNA?？稍赾DNA中導入適當?shù)暮丝嗨嵋孕纬煞奖愕南拗菩晕稽c，并可以按照與形成其它融合蛋白類似的方法，使蛋白質(zhì)的cDNA與運鐵蛋白的cDNA結(jié)合。另外，靶向蛋白質(zhì)或肽cDNA，如單鏈抗體或可以介導蛋白質(zhì)進入細胞內(nèi)部的肽，如核定位信號可以與運鐵蛋白的另一端或其內(nèi)部融合。將所需蛋白質(zhì)和靶向肽克隆至允許與運鐵蛋白cDNA融合的載體中。按照此方式，蛋白質(zhì)/肽都可以與經(jīng)修飾運鐵蛋白融合。然后切下融合的cDNA,插入表達載體以在酵母中表達融合蛋白。和純化酵母分泌出的融合蛋白，并使用適當?shù)纳锘瘜W和生物學試驗檢測其生物學活性及其靶向活性。也可以在其它系統(tǒng)，如哺乳動物組織培養(yǎng)物中使用適當載體和轉(zhuǎn)染方法制備這些蛋白質(zhì)。實施例ll可通過多種方法，例如通過RT-PCR由mRNA、從cDNA文庫中分離所需酶的cDNA，通過由重疊寡核苦酸合成構(gòu)建所述cDNA,通過PCR或其它本領(lǐng)域已知的方法分離得到所述cDNA(所有方法都使用標準方法)?？蓪DNA的5，和3，末端進行修飾以產(chǎn)生限制性位點，使得可以使用寡核苷酸接頭將該cDNA克隆至含有經(jīng)修飾運鐵蛋白cDNA的載體中。酶cDNA可以位于運鐵蛋白序列的N-或C-末端，可以使用或不使用間隔序列。將酶cDNA克隆至載體中，然后從載體中切下完整的表達盒，插入表達載體以在酵母中表達融合蛋白。然后從培養(yǎng)基中收集和純化酵母分泌的融合蛋白并檢測其生物活性。為了在哺乳動物細胞系中表達，可采用類似的方法，不同之處在于所用表達盒使用的是哺乳動物啟動子、前導序列和終止子。然后切下表達盒，插入適于轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞系的質(zhì)粒中。實施例12使用噬菌體展示，分離出例如特異于腫瘤細胞表面特定細胞標記的肽。然后將所述肽與經(jīng)修飾運鐵蛋白的N-,C-或N-和C-末端融合以將融合蛋白靶向至特定的細胞類型。然后，使運鐵蛋白融合蛋白荷載金屬離子，所述離子的運鐵蛋白結(jié)合特性類似于鐵，但卻具有細胞毒性，例如鎵或放射性離子。通過此機理，鎵或放射性離子被靶向該細胞類型。盡管參照上述實施例詳細描述了本發(fā)明，但應理解可在不背離本發(fā)明精神的情況下對本發(fā)明進行多種修飾。因此，本發(fā)明僅受下述權(quán)利要求書的限制。本申請中提及的所有專利、專利申請和出版物都全文列入本文作為參考。序列表<110〉克里斯托弗.普賴爾(Prior,ChristopherP.)<120>經(jīng)修飾的運鐵蛋白融合蛋白<130>MLBRef.54710-5001-CN<140〉中國申請?zhí)?lt;141〉2002-08-30<150>US60/315,745<151〉2001-08-30<150>US60/334，059<151〉2001-11-30<150〉PCT/US02/27637<151>2002-08-30<160>30<170>PatentlnVer.2.1<210>1.<211>2318<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(51)..(2147)<223>GenBank編號NM—001063,運鐵蛋白基因和蛋白<220><221>sig_peptide<222>(51)..(107)<400>1gcacagaagcgagtccgactgtgctcgctgctcagcgccgcacccggaagatgagg56MetArg1etcgccgtgggagccctgctggtctgcgccgtcctggggctgtgtctg104LeuAlaValGlyAlaLeuLeuValCysAlaValLeuGlyLeuCysLeu51015getgtccctgataaaactgtgagatggtgtgcagtgteggagcatgag152AlaValProAspLysThrValArgTrpCysAlaValSerGluHisGlu202530gccactaagtgccagagtUccgcgaccatatgaaaagegtcattcca200AlaThrLysCysGinSerPheArgAspHisMetLysSerVal'liePro35404550tecgatggtcccagtgttgettgtgtgaagaaagcctectaccttgat248SerAspGlyProSerValAlaCysValLysLysAlaSerTyrLeuAsp556065tgcateagggccattgcggcaaacgaagcggatgetgtgacactggat296CyslieArgAlalieAlaAlaAsnGluAlaAspAlaValThrLeuAsp707580gcaggtUggtgtatgatgettacctggetccca"aacctgaagcct344AlaGlyLeuValTyrAspAlaTyrLeuAlaProAsnAsnLeuLysPro859095284gtggtggcagagttctatgggteaaaagaggatccacagactttctat392ValValAlaGluPheTyrGlySerLysGluAspProGinThrPheTyr100105110Utgetgttgetgtggtgaagaaggatagtggcttccagatgaaccsg440TyrAlaValAlaValValLysLysAspSerGlyPheGinMetAsnGin115120125130cttcgaggcaagaagtectgccacacgggtcUggcaggtecgetggg488LeuArgGlyLysLysSerCysHisThrGlyLeuGlyArgSerAlaGly135140145tggaacatecccataggcttacttUctgtgactucctgagccacgt536TrpAsnlieProlieGlyLeuLeuTyrCysAspLeuProGluProArg150155160aaacctcttgagaaagcagtggccaatttcttctegggcagetgtgcc584LysProLeuGluLysAlaValAlaAsnPhePheSerGlySerCysAU165170175ccttgtgcggatgggacggacttcccccagctgtgtcaactgtgtcca632ProCysAlaAspGlyThrAspPheProGinLeuCysGinLeuCysPro180185190gggtgtggctgctecacccttaaccaaUcttcggctactegggagcc680GlyCysGlyCysSerThrLeuAsnGinTyrPheGlyTyrSerGlyAla195200205210ttcaagtgtctgaaggatggtgetggggatgtggccUtgtcaagcac728PheLysCysLysAspGlyAlaGlyAspValAlaPheValLysHis215220225tegactatatttgagaacUggcaaacaaggetgacagggaccagtat776SerThrliePheGluAsnLeuAlaAsnLysAlaAspArgAspGinTyr230235240gagctgctttgcctggacaacacceggaagccggtagatgaaUcaag824GluLeuLeuCysLeuAspAsnThrArgLysProValAspGluTyrLys245250255gactgccacUggcccaggtcccttctcataccgtcgtggcccgaagt872AspCysHisLeuAlaGinValProSerHisThrValValAlaArgSer260265270atgggcggcaaggaggacUgatetgggagcttetcaaccaggcccag920MetGlyGlyLysGluAspLeulieTrpGluLeuLeuAsnGinAlaGin275280285290gaacattttggcaaagacaaateaaaagaattccaaetattcagetct968GluHisPheGlyLysAspLysSerLysGluPheGinLeuPheSerSer295300305cctcatgggaaggacctgctgtttaaggactctgcccacgggttttta1016ProHisGlyLysAspLeuLeuPheLysAspSerAlaHisGlyPheLeu310315320aaagtcccccccaggatggatgccaagatgtacctgggctatgagtat1064LysValProProArgMetAspAlaLysMetTyrLeuGlyTyrGluTyr325"0335gtcactgccateeggaatcUegggaaggcacatgcccagaagcccca1112ValThrAlalieArgAsnLeuArgGluGlyThrCysProGluAlaPro340345350acag"gaatgcaagcctgtgaagtggtgtgcgctgagecaccacgag1160ThrAspGluCysLysProValLysTrpCysAlaLeuSerHisHisGlu355360365370aggetcaagtgtgatgagtggagtgttaacagtgUgggaaaatagagArgLeuLysCysAspGluTrpSerValAsnSerValGlyLyslieGlu3753803851208tgtgtateagcagagaccaccgaagactgcategccaagateatgaatCysValSerAlaGluThrThrGluAspCyslieAlaLyslieMetAsn3903954001256ggagaagetgatgccatgagettggatggagggtttgtcUcaUgcgGlyGluAlaAspAlaMetSerLeuAspGlyGlyPheValTyrlieAla4054104151304ggcaagtgtggtctggtgcctgtcUggcagaaaactacaataagageGlyLysCysGlyLeuValProValLeuAlaGluAsnTyrAsnLysSer4204254301352gataattgtgaggatacaccagaggcagggtattttgetgUgcagtgAspAsnCysGluAspThrProGluAlaGlyTyrPheAlaValAlaVal4354404454501400gtgaagaaateagettctgacetcacctgggacaatctgaaaggcaagValLysLysSerAlaSerAspLeuThrTrpAspAsnLeuLysGlyLys4554604651448aagtectgccatacggcagUggcagaaccgetggctggaacatecccLysSerCysHisThrAlaValGlyArgThrAlaGlyTrpAsnliePro4704754801496atgggcctgetctacaataagateaaccactgcagatttgatgaatttMetGlyLeuLeuTyrAsnLyslieAsnHisCysArgPheAspGluPhe4854904951544UcagtgaaggttgtgcccctgggtctaagaaagactecagtetctgtPheSerGluGlyCysAlaProGlySerLysLysAspSerSerLeuCys5005055101592aagctgtgtatgggcteaggcetaaacctgtgtgaacccaacaacaaaLysLeuCysMetGlySerGlyLeuAsnLeuCysGluProAsnAsnLys5155205255301640gagggaUctacggctacacaggcgetUcaggtgtctggUgagaagGluGlyTyrTyrGlyTyrThrGlyAlaPheArgCysLeuValGluLys5355405451688ggagatgtggcctttgtgaaacaccagactgtcccacagaacactgggGlyAspValAlaPheValLysHisGinThrValProGinAsnThrGly5505555601736ggaaaaaaccctgatccatgggetaagaatctgaatgaaaaagactatGlyLysAsnProAspProTrpAlaLysAsnLeuAsnGluLysAspTyr5655705751784gagUgctgtgccttgatggtaccaggaaacctgtggaggagUtgcgGLuLeuLeuCysLeuAspGlyThrArgLysProValGluGluTyrAla5805855901832aactgccacctggccagagccccgaatcacgetgtggtcacaeggaaaAsnCysHisLeuAlaArgAlaProAsnHisAlaValValThrArgLys5956006056101880gataaggaagettgcgtccacaagatattacgtcaacagcagcaceta1928AspLysGluAlaCysValHisLyslieLeuArgGinGinGinHisLeu615620625tttggaageaacgta'actgactgctegggcaacttttgtttgUcegg1976PheGlySerAsnValThrAspCysSerGlyAsnPheCysLeuPheArg630635640tcggaaSerGluaaacttLysLeu660gtcaagValLys675gaagccGluAlaaccThr645c"HisgetAlatgcCysaagLysgacAspgttValactThrgacAspagaArgggtGlyUcPhe695cttLeuaacAsn33CAsn680cgtArgctgLeuThr665ctgLeuagaArgUcPhe650tatTyragaArgcctProagaArggaaGluaaaLysAspaaaLystgcCysgacAspTyrtecSer685ThrtuLeu670accThrgtaVal655ggaGlyteaSertgtCysgaaGluteaSerttg!>eugaaGluetcLeugccAlatatTyrctgLeu690taaaatctcagaggtagggctgc2024207221202167caccaaggtgaagatgggaacgcagatgatccatgagtttgccctggtttcactggccca2227agtggtttgtgctaaccacgtctgtcttcacagctctgtgUgccatgtgtgctgaacaa2287aaaaUaaaattattattgaUttataUtc2318<210〉2<211〉698<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2MetArgLeuAlaValGlyAlaLeuLeuValCysAlaValLeuGlyLeu151015CysLeuAlaValProAspLysThrValArgTrpCysAlaValSerGlu202530HisGluAlaThrLysCysGinSerPheArgAspHisMetLysSerVal354045lieProSerAspGlyProSerValAlaCysValLysLysAlaSerTyr505560IxuAspCyslieArgAlalieAlaAlaAsnGluAlaAspAlaValThr65707580LeuAspAlaGlyLeuValTyrAspAlaTyrLeuAlaProAsnAsnLeu859095LysProValValAlaGluPheTyrGlySerLysGluAspProGinThr100105110PheTyrTyrAlaValAlaValValLysLysAspSerGlyPheGinMet115120125AsnGinLeuArgGlyLysLysSerCysHisThrGlyLeuGlyArgSer130135140AlaGlyTrpAsnlieProlieGlyLeuLeuTyrCysAspLeuProGlu145150155160ProArgLysProLeuGluLysAlaValAlaAsnPhePheSerGlySer165170175CysAlaProCysAlaAspGlyThrAspPheProGinLeuCysGinLeu180185190CysProGlyCysGlyCysSerThrLeuAsnGinTyrPheGlyTyrSer195200205GlyAlaPheLysCysLeuLysAspGlyAlaGlyAspValAlaPheVal210215220LysHisSerThrliePheGluAsnLeuAlaAsmLysAlaAspArgAsp225230235240GinTyrGluLeuLeuCysLeuAspAsnThrArgLysProValAspGlu245250255TyrLysAspCysHisLeuAlaGinValProSerHisThrValValAla260265270ArgSerMetGlyGlyLysGluAspLeulieTrpGluLeuLeuAsnGin275280285AlaGinGluHisPheGlyLysAspLysSerLysGluPheGinLeuPhe290295300SerSerProHisGlyLysAspLeuLeuPheLysAspSerAiaHisGly305310315320PheLeuLysValProProArgMetAspAlaLysMetTyrLeuGlyTyr325330335GluTyrValThrAlalieArgAsnLeuArgGluGlyThrCysProGlu340345350AlaProThrAspGluCysLysProValLysTrpCysAlaLeuSerHis355360365HisGluArgLeuLysCysAspGluTrpSerValAsnSerValGlyLys370375380lieGluCysValSerAlaGluThrThrGluAspCyslieAlaLyslie385390395400MetAsnGlyGluAlaAspAlaMetSerLeuAspGlyGlyPheValTyr405410415lieAlaGlyLysCysGlyLeuValProValLeuAlaGluAsnTyrAsn420425430LysSerAspAsnCysGluAspThrProGluAlaGlyTyrPheAlaVal435440445AlaValValLysLysSerAlaSerAspLeuThrTrpAspAsnLeuLys450455460GlyLysLysSerCysHisThrAlaValGlyArgThrAlaGlyTrpAsn465470475480lieProMetGlyLeuLeuTyrAsnLyslieAsnHisCysArgPheAsp485490495GluPhePheSerGluGlyCysAlaProGlySerLysLysAspSerSer500505510LeuCysLysLeuCysMetGlySerGlyLeuAsnLeuCysGluProAsn515520525AsnLysGluGlyTyrTyrGlyTyr丁hrGlyAlaPheArgCysLeuVal530535540288GluLys545ThrGlyAspTyrTyrAlaArgLys610HisLeu625PheArgLeuAlaGluTyrLeuLeu690GlyAspValAlaPheValLys550GlyLysAsnProAspProTrp565GluLeuLeuCysLeuAspGly580585AsnCysHisLeuAlaArgAla595600AspLysGluAlaCysValHis615PheGlySerAsnValThrAsp630SerGluThrLysAspLeuLeu645LysLeuHisAspArgAsnThr660665ValLysAlaValGlyAsnLeu675680GluAlaCysThrPheArgArg695HisGinThrValProGinAsn555560AlaLysAsnLeuAsnGluLys570575ThrArgLysProValGluGlu590ProAsnHisAlaValValThr605LyslieLeuArgGinGinGin620CysSerGlyAsnPheCysLeu635640PheArgAspAspThrValCys6506"TyrGluLysTyrLeuGlyGlu670ArgLysCysSerThrSerSer685Pro<210>3<211>679<212>PRT<213>人(Homosapiens)<220><223>成熟運鐵蛋白<400>3ValProAspLysThrVaiArgTrpCys15ThrLysCysGinSerPheArgAspHis2025AspGlyProSerValAlaCysValLys3540lieArgAlalieAlaAlaAsnGluAla5055GlyI>euValTyrAspAlaTyrLeuAla6570ValAlaGluPheTyrGlySerLysGlu85AlaValAlaValValLysLysAspSer100105ArgGlyLysLysSerCysHisThrGly115120AsnlieProlieGlyLeuLeuTyrCys130135AlaValSerGluHisGluAla1015MetLysSerVallieProSer30LysAlaSerTyrLeuAspCys45AspAlaValThrLeuAspAla60ProAsnAsnLeuLysProVal7580AspProGinThrPheTyrTyr9095GlyPheGinMetAsnGinLeu110LeuGlyArgSerAlaGlyTrp125AspLeuProGluProArgLys140ProLeuGluLysAlaValAlaAsnPhePheSerGlySerCysAlaPro145150155160CysAlaAspGlyThrAspPheProGinILeuCysGinLeuCysProGly165170175CysGlyCysSerThrLeuAsnGinTyrPheGlyTyrSerGlyAlaPhe180185190LysCysLeuLysAspGlyAlaGlyAspValAlaPheValLysHisSer195200205ThrliePheGluAsnLeuAlaAsnLysAlaAspArgAspGinTyrGlu210215220LeuLeuCysLeuAspAsnThrArgLysProValAspGluTyrLysAsp225230235240CysHisLeuAlaGinValProSerHisThrValValAlaArgSerMet245250255GlyGlyLysGluAspLeulieTrpGluI>euLeuAsnGinAlaGinGlu260265270HisPheGlyLysAspLysSerLysGluPheGinLeuPheSerSerPro275280285HisGlyLysAspLeuLeuPheLysAspSerAlaHisGlyPheLeuLys290295300ValProProArgMetAspAlaLysMetTyrLeuGlyTyrGluTyrVal305310315320ThrAlalieArgAsnLeuArgGluGlyThrCysProGluAlaProThr325330335AspGluCysLysProValLysTrpCysAlaLeuSerHisHisGluArg340345350LeuLysCysAspGluTrpSerValAsnSerValGlyLyslieGluCys355360365ValSerAlaGluThrThrGluAspCyslieAlaLyslieMetAsnGly370375380GluAlaAspAlaMetSerLeuAspGlyGlyPheValTyrlieAlaGly385390395400LysCysGlyLeuValProValLeuAlaGluAsnTyrAsnLysSerAsp405410415AsnCysGluAspThrProGluAlaGlyTyrPheAlaValAlaValVal420425430LysLysSerAlaSerAspLeuThrTrpAspAsnLeuLysGlyLysLys435440445SerCysHisThrAlaValGlyArgThrAlaGlyTrpAsnlieProMet450455460GlyLeuLeuTyrAsnLyslieAsnHisCysArgPheAspGluPhePhe465470475480SerGluGlyCysAlaProGlySerLysLysAspSerSerLeuCysLys485490495LeuCysMetGlySerGlyLeuAsnLeuCysGluProAsnAsnLysGlu290GlyAspLys545LeuCysLysGlyGlu625LeuLysAlaTyrVal530AsnLeuHisGluSer610ThrHisAlaCysTyr515AlaProCysLeuAla595AsnLysAspValThr675500505510GlyTyrThrGlyAlaPheArgCysLeuValGluLysGly520525PheValLysHisGinThrValProGinAsnThrGlyGly535540AspProTrpAlaLysAsnLeuAsnGluLysAspTyrGlu550555560LeuAspGlyThrArgLysProValGluGluTyrAlaAsn565570575AlaArgAlaProAsnHisAlaValValThrArgLysAsp580585590CysValHisLyslieLeuArgGinGinGinHisLeuPhe600605ValThrAspCysSerGlyAsnPheCysLeuPheArgSer615620AspLeuLeuPheArgAspAspThrValCysLeuAlaLys630635640ArgAsnThrTyrGluLysTyrLeuGlyGluGluTyrVal645650655Gly660AsnPheArgArgProLeuArgLysCysSerThrSerSerLeuLeuGlu665670<210><211><212〉<213><220><223>436PRT人免疫缺陷病毒<400>4PheTrpGluAsnLeuSer抗融合肽AsnTrpLysThr35Glu20TyrLeuSerAlaTrpLysAspLeuGluLeuLeuGluGin51015GinGinAsnGinSerGluGlulieLeuSerHislie2530<210〉<211><212><213〉<220><223>35PRT人呼吸道合胞病毒抗融合肽<400>5ValTyrProSerAspGluTyrAspAlaSerlieSerGinValAsnGlu151015GlulieAsnGinAlaLeuAlaTyrlieArgLysAlaAspGluLeuLeu202530GluAsnVal35<210>6<211>51<212>PRT<213>人呼吸道合胞病毒<220〉<223>抗融合肽<400>6AlaValSerLysValIxuHisIxuGluGlyGluValAsnLyslieLys151015SerAlaLeuLeuSerThrAsnLysAlaValValSerLeuSerAsnGly202530ValSerValLeuThrSerLysValLeuAspLeu!>ysAsnTyrlieAsp354045LysGinLeu50<210>7<211>35<212>PRT<213>人呼吸道合胞病毒<220〉<223>抗融合肽<400〉7ValPheProSerAspGluPheAspAlaSerlieSerGinValAsnGlu151015LyslieAsnGinSerLeuAlaPhelieArgGluSerAspGluLeuLeu202530HisAsnVal35<210>8<211>12<212>PRT<213〉人(Homosapiens)<220〉<223>乳鐵蛋白剪接變體序列<400〉8GluAspCyslieAlaLeuLysGlyGluAlaAspAla1510<210><211><212><213>人工序列<220><223〉人工序列的描述用于誘變的寡核普酸<400>9gcagaaaactacgataagagcgataat27<210〉10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述用于談變的寡核苷酸<400>10ctatttggaagcgacgtaactgactgc27<210>11<211〉20<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述EP0模擬肽<400>11GlyGlyThr1TyrSerCysHisPheGlyProLeuThrTrpValCysLys51015ProGinGlyGly20<210>12<211>18<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述EPO模擬肽<400〉12AspArgGluGlyCysArgArgGlyTrpValGlyGinCysLysAlaTrp151015PheAsn<210〉13<211>108<212〉DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HIV抗融合序列<220><221>CDS<222>(1)..(108)<400〉13tacacaageUaatacactecttaattgaagaategcaaaaccagcaa48TyrThrSerLeulieHisSerLeulieGluGluSerGinAsnGinGin151015gaaaagg汪acaa名aattattggaattagataaatgggcattgGluLysAsnGluGinGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeu202530tggaattggtuTrpAsnTrpPhe3596108<210><211><212><213>1436PRT人工序列<220><223>人工序列的描述HIV抗融合序列<400>14TyrThrSer1GluLysAsnLeuGlu20lieHisSerLeulieGluGluSerGinAsnGinGin51015GinGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeu2530TrpAsnTrp35Phe<210〉<211><212><213>15124DNA人工序列<220><223>人工序列的描述:HIV融合蛋白的抗融合序列<220><221〉CDS<222>(1).<400>15etagagaaaLeuGluLys1(123)aggtacactagettaataArgTyrThrSerLeulie5cactecUaattgaagaateg48HisSerLeulieGluGluSer1015caaaaccagcaagaaaaga"gaacaagaattattggaattagataaaGinAsnGinGinGluLysAsnGluGinGluLeuLeuGluLeuAspLys20253096tgggcaagtttgtggaattggtttgtacTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPheVal3540124<210〉<211><212><213〉1641PRT人工序列<220><223>人工序列的描述HIV融合蛋白的抗融合序列<400>16LeuGluLysArgTyrThrSerLeulieHisSerLeulieGluGluSer151015<formula>formulaseeoriginaldocumentpage295</formula>tgtttgatgtttttgtcttgggUgaaggtgaagaatctcaaaaaaaa96CysLeuMetPheLeuSerTrpValGluGlyGluGluSerGinLysLys202530UgccatcttctagaattacttgtccacaaggttctgUgettatggt144LeuProSerSerArglieThrCysProGinGlySerValAlaTyrGly354045tcttattgttattctttg"tUgattccacaaacttggtctaatget192SerTyrCysTyrSerLeulieLeulieProGinThrTrpSerAsnAla505560gaaUgtcttgtcaaatgcatttttctggtcatttggettttttgttg240GluLeuSerCysGinMetHisPheSerGlyHisLeuAlaPheLeuLeu65707580tctactggtgaaattactmgUtcttctttggttaaaaattctUg288SerThrGlyGlulieThrPheValSerSerLeuValLysAsnSerUu859095actgettatcaatatatttggattggtttgcatgatccatctcatggt336ThrAlaTyrGinTyrlieTrplieGlyLeuHisAspProSerHisGly100105110actUgccaaatggttctggttggaaatggtcttcttctaatgttUg384ThrLeuProAsnGlySerGlyTrpLysTrpSerSerSerAsnValLeu115120125actttttataattgggaaagaaatccatctattgetgetgatagaggt432ThrPheTyrAsnTrpGluArgAsnProSerlieAlaAlaAspArgGly130135140tattgtgetgUUgtctcaaaaatctggttttcaaaaatggagagat480TyrCysAlaValLeuSerGinLysSerGlyPheGinLysTrpArgAsp145150155160tttaattgtgaaaatgaaUgccatatatttgtaaatttaaagtt525PheAsnCysGluAsnGluLeuProTyrlieCysLysPheLysVal165170175<210>19<211〉175<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述INGAP序列<400>19MetMetLeuProMetThrLeuCysArg15CysLeuMetPhe20LeuProSerSer35SerTyrCysTyr50GluLeuSerCys65MetLeuArgSerGinSerTrpValGlu25lieThrCysPro40LeulieLeulie55MetHisPheSer70MetSerTrp10GlyGluGluGinGlySerProGinThr60GlyHisLeu75MetLeuLeuSer15SerGinLysLys30ValAlaTyrGly45TrpSerAsnAlaAlaPheLeuLeu80SerThrGlyGlulieThrPheValSerSerLeuValLysAsnSerLeu859095ThrAlaTyrGinTyrlieTrplieGlyLeuHisAspProSerHisGly100105110ThrLeuProAsnGlySerGlyTrpLysTrpSerSerSerAsnValLeu115120125ThrPheTyrAsnTrpGluArgAsnProSerlieAlaAlaAspArgGly130135140TyrCysAlaValLeuSerGinLysSerGlyPheGinLysTrpArgAsp145150155160PheAsnCysGluAsnGluLeuProTyrlieCysLysPheLysVal165170175<210〉20<211〉445<212>DM<213>人工序列<220><223>人工序列的描述融合蛋白的INGAP序列<220〉<221>CDS<222>(1)..(444)<400>20etagagaaaaggttgccatcttecagaattacttgtccacaaggttct48LeuGluLysArgLeuProSerSerArglieThrCysProGinGlySer151015gttgettatggttcttattgttattctttgattttgattccacaaact96ValAlaTyrGlySerTyrCysTyrSerLeulieLeulieProGinThr202530tggtctaatgetgaaUgtcttgtcaaatgcatUttctggtcatttg144TrpSerAsnAlaGluLeuSerCysGinMetHisPheSerGlyHisLeu354045gettttUgUgtctactggtgaaattacttttgtttcttctUggtt192AlaPheLeuLeuSerThrGlyGlulieThrPheValSerSerLeuVal505560aaaa"tctttgactgettatcaatatatttggattggtUgcatgat240LysAsnSerLeuThrAlaTyrGinTyrlieTrplieGlyLeuHisAsp65707580ccatctcatggtactUgccaaatggttctggttggaaatggtcttct288ProSerHisGlyThrLeuProAsnGlySerGlyTrpLysTrpSerSer859095tctaatgttUgactUttacaattgggaaagaaatccatctattget336SerAsnValLeuThrPheTyrAsnTrpGluArgAsnProSerlieAla100105110getgatagaggttattgtgetgttttgtctcaaaaatctggttttcaa384AlaAspArgGlyTyrCysAlaValLeuSerGinLysSerGlyPheGin115120125aaatggagagatUtaattgtgaaa"gaaUgccatatatttgtaaa432LysTrpArgAspPheAsnCysGluAsnGluLeuProTyrlieCysLys130135140UtaaagUgtacPheLysValVal145445<210><211><212><213><220〉<223〉21148PRT人工序列人工序列的描述融合蛋白的INGAP序列<400>21LeuGluLys1ValArgTrpAlaLys65ProSerAlaLysPhe145AlaSerPhe50AsnSerAsnAspTrp130LysTyrAsn35LeuSerHisValArg115ArgValGly20AlaLeuLeuGlyLeu100GlyAspValLeu5SerGluSerThrThrS5ThrTyrPheProTyrLeuThrAla70LeuPheCysAsnSerCysSerGly55TyrProTyrAlaCys135SerTyrCys40GluGinAsnAsnArgSer25GinlieTyrGlyTrp105LeuGluAsnVal120lie10LeuMetThrlieSer90GluSerGluThrCysProGinlieLeuliePro30HisPheSerGly45PheValSerSer60TrplieGlyLeu75GlyTrpLysTrpArgAsnProSer110GinLysSerGly125LeuProTyrlie140Gly15GinHisI>euHisSer95liePheCysSerThrLeuValAsp80SerAlaGinLys<210〉22<211>441<212>DM<213〉人工序列<220〉<223>人工序列的描述融合蛋白的INGAP序列<220〉<221〉CDS<222〉(2)..(436)<400>22tcgacctttgccatcttecagaattacttgtccacaaggttctgttArgProLeuProSerSerArglieThrCysProGinGlySerVal151015tatggttctUttgtUttctUgattttgattccacaaacttggtct97TyrGlySerTyrCysTyrSerLeulieLeulieProGinThrTrpSer202530aatgetgaattgtcttgtcaaatgcatttttctggtcatUggetUt145AsnAlaGluLeuSerCysGinMetHisPheSerGlyHisLeuAlaPhe354045UgttgtctactggtgaaattactUtgtttcttctttggtt雄aat193LeuLeuSerThrGlyGlulieThrPheValSerSerLeuValLysAsn505560tctttgactgettatcaaUtatttggattggtUgcatgatccatct241SerLeuThrAlaTyrGinTyrlieTrplieGlyLeuHisAspProSer65707580catggtactUgccaaatggttctggttggaaatggtcttcttctaat289HisGlyThrLeuProAsnGlySerGlyTrpLysTrpSerSerSerAsn859095gttttgactUttacaattggg'aaagaaatccatctattgetgetgat337ValLeuThrPheTyrAsnTrpGluArgAsnProSerlieAlaAlaAsp100105110agaggttattgtgetgttttgtctcaaaaatctggtUtcaaaaatgg385ArgGlyTyrCysAlaValUuSerGinLysSerGlyPheGinLysTrp115120125agagatUtaattgtgaaaatgaaUgccatatatttgtaaaUtaaa433ArgAspPheAsnCysGluAsnGluLeuProTyrlieCysLysPheLys130135140gtttaata441Val145<210>23<211>145<212>PRT<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述融合蛋白的INGAP序列<400>23ArgProLeuProSerSerArglieThrCysProGinGlySerValAla151015TyrGlySerTyrCysTyrSerLeulieLeulieProGinThrTrpSer202530AsnAlaGluLeuSerCysGinMetHisPheSerGlyHisLeuAlaPhe354045LeuLeuSerThrGlyGlulieThrPheValSerSerLeuValLysAsn505560SerLeuThrAlaTyrGinTyrlie丁rplieGlyLeuHisAspProSer65707580HisGlyThrLeuProAsnGlySerGlyTrpLysTrpSerSerSerAsn859095ValLeuThrPheTyrAsnTrpGluArgAsnProSerlieAlaAlaAsp100105110ArgGlyTyrCysAlaValLeuSerGinLysSerGlyPheGinLysTrp115120125ArgAspPheAsnCysGluAsnGluLeuProTyrlieCysLysPheLys130135140Val145<210><211〉<212〉<213>2460DNA人工序列<220〉<223〉人工序列的描述:EPO模擬序列<220〉<221〉CDS<222〉(1).,(60)<400>24ggtggtactGlyGlyThr1tactcttgtcattttggtccattgacttgggtttgtaag48TyrSerCysHisPheGlyProLeuThrTrpValCysLys51015cc3caaggtggtProGinGlyGly2060<210〉25<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:EPO模擬序列<400>25GlyGlyThrTyrSerCysHisPheGlyProLeuThrTrpValCysLys151015ProGinGlyGly20<210>26<211>47<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述運鐵蛋白肽插入?yún)^(qū)<400>26AspLysSerLysGluPheGinLeuPheSerSerProHisGlyLysAsp51015LeuLeuPheLysAspSerAlaHisGlyPheLeuLysValProProArg202530MetAspAlaLysMetTyrUuGlyTyrGluTyrValThrAlalie354045<210>27<211>49<212〉PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述運鐵蛋白肽插入?yún)^(qū)<400>27AsnValThrAspCysSerGlyAsnPheCysLeuPheArgSerGluThr151015LysAspLeuLeuPheArgAspAspThrValCysLeuAlaLysLeuHis202530AspArgAsnThrTyrGluLysTyrLeuGlyGluGluTyrValLysAla354045Val<210>28<211〉140<212>DM<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述運鐵蛋白肽插入?yún)^(qū)的DNA序列<400>28agacaaatcaaaagaatttcaactattcagctctcctcatggtggtacUactcttgtca60ttttggtccattgacttgggtttgtaagccacaaggtggtgggaaggacctgctgUUa120ggactctgcccacgggtttt140<210〉29<211>210<212>DM<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述運鐵蛋白肽插入?yún)^(qū)的DNA序列<400>29cctatttggaagcaacgtaactgactgctcgggcaacttttgtttgttccggtcggaagg60tggtactUctcttgtcattUggtccattgacttgggtttgtaagccacaaggtggtac120caaggaccttctgttcagagatgacacagtatgUtggccaaacttcatgacagaaacac180atatgaaaaatacttaggagaagaatatgt210<210>30<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述EPO模擬肽<400>30GinArgValGlulieLeuGluGlyArgThrGluCysValLeuSerAsn151015LeuArgGlyArgThrArgTyr20權(quán)利要求1.含有與至少一種治療性蛋白質(zhì)或肽融合的運鐵蛋白(Tf)蛋白質(zhì)的融合蛋白，所述運鐵蛋白表現(xiàn)出降低的糖基化。2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽的血清半壽期高于治療性蛋白質(zhì)或肽在非融合狀態(tài)的血清半壽期。3.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf的C-末端融合。4.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽與Tf的N-末端融合。5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被插入Tf的至少一個環(huán)中。6.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白對TfR的親和性降低。7.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白對鐵的親和性降低。8.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有至少一個能防止糖基化的突變。9.權(quán)利要求1的融合蛋白，它在衣霉素的存在下表達。10.權(quán)利要求l的融合蛋白，其中所述Tf蛋白含有Tf蛋白N結(jié)構(gòu)域的一部分、橋連肽和Tf蛋白C結(jié)構(gòu)域的一部分。全文摘要本發(fā)明公開了運鐵蛋白和治療性蛋白質(zhì)或肽的經(jīng)修飾的融合蛋白，其血清半壽期延長或血清穩(wěn)定性增加。優(yōu)選的融合蛋白包括經(jīng)過修飾使運鐵蛋白組分不顯示或顯示降低的糖基化、與鐵的結(jié)合和/或與運鐵蛋白受體的結(jié)合的那些融合蛋白。文檔編號C07K19/00GK101519449SQ200810185278公開日2009年9月2日申請日期2002年8月30日優(yōu)先權(quán)日2001年8月30日發(fā)明者克里斯托弗·P·普賴爾申請人:比奧雷克西斯藥物公司