專利名稱：血清中pcdh10的trfia法檢測(cè)用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血清中P⑶HlO的TRFIA法檢測(cè)用試劑盒，涉及rcDHIO蛋白C-端和N-端的特異性多肽片段的兩種特異抗體的制備，并利用所制備的雙抗體，采用時(shí)間分辨熒光免疫法(TRFIA)檢測(cè)血清樣品中PCDHlO方法。屬于PCDHlO蛋白的抗體制備和時(shí)間分辨熒光免疫(TRFIA)分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
P⑶HlO是一個(gè)新的腫瘤抑制基因，P⑶HlO蛋白在血清中的顯著降低對(duì)一些腫瘤 (如大腸癌等)有提示作用。PCDHlO是屬于Ca2+依賴性鈣粘蛋白家族的一員，具有6個(gè)重復(fù)串聯(lián)的胞外區(qū)和I個(gè)獨(dú)特的胞內(nèi)區(qū)。浙江大學(xué)朱永良等人在對(duì)原代腫瘤干細(xì)胞基因表達(dá)譜時(shí)用病毒文庫技術(shù)篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)pcdhlO+細(xì)胞易游出和穿過“Transwell”的半透膜，而 pcdhl0+/+的細(xì)胞遷移性較弱。通過生物信息學(xué)分析,進(jìn)一步克隆了 pcdhlO的全長cDNA序列并構(gòu)建了表達(dá)pcdhlO的真核細(xì)胞表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞、SW480大腸癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)P⑶HlO抑制了這些細(xì)胞在體外的增殖，并增加了細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)對(duì)這些細(xì)進(jìn)行無血清饑餓和添加化療藥物等處理后PCDHlO表達(dá)水平隨時(shí)間和濃度的增加而增加，提示PCDHlO參與了細(xì)胞凋亡，可能是一個(gè)腫瘤抑制基因。然對(duì)其參與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不明了。浙江大學(xué)朱永良等人的發(fā)明專利“針對(duì)PCDH10C-端蛋白片段分子的特異性抗體的制備方法”(專利號(hào)為ZL200810060201)中，利用了 PCR技術(shù)從體外培養(yǎng)細(xì)胞中克隆了 P⑶HlO蛋白的C-端DNA序列并轉(zhuǎn)化入原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，獲得了純化的P⑶HlOC-端多肽,并免疫大白兔,收集并純化大白兔的抗血清,純化后獲得了 PCDHlO蛋白C-端多肽的抗體。但尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)PCDHlO蛋白N-端多肽的特異性抗體。所述針對(duì)PCDH10C端蛋白片段分子的特異性抗體的制備方法的具體步驟是“1)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10C 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建PCDH10C端融合蛋白的原核細(xì)胞PCDH10C/pET15b表達(dá)載體；2)將PCDH10C/pET15b表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21 DE3pLysS大腸桿菌，建立P⑶HlOC端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯和樹脂純化P⑶HlOC端融合蛋白，用Thrombin酶切除P⑶HlOC端融合蛋白N端的His_tag標(biāo)簽，得到P⑶HlOC端融合蛋白；3)用己切除標(biāo)簽的PCDH10C端融合蛋白作為抗原免疫大白兔，產(chǎn)生抗PCDH10C端抗體，收集抗血清，用硫酸銨沉淀、透析、Protein A-Sepharose親和柱純化兔抗P03H10C端抗體。”目前市面上尚未有商品試劑盒用于檢測(cè)該蛋白，所以發(fā)明一種簡單而高靈敏度的方法來測(cè)定血清中P⑶HlO蛋白含量以評(píng)價(jià)患癌癥的幾率，意義非常重大。時(shí)間分辨熒光免疫分析是自上個(gè)世紀(jì)70年代末80年代初，新發(fā)展起來的一項(xiàng)免疫分析方法，它克服了利用熒光素進(jìn)行熒光免疫分析時(shí)背景干擾嚴(yán)重的影響。TRFIA原理是利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，一般采用BHHCT(4，4' -二(I"，1"，1"，2"，2"， 3"，3"-七氟-4"，6"-己二酮-6"-?；?_氯磺化鄰三聯(lián)苯)，其一端與鑭系元素結(jié)合，另一端與抗體(蛋白質(zhì))分子中的自由氨基結(jié)合，制成鑭系元素標(biāo)記的(一般用Eu3+標(biāo)記)抗體。它與待定抗原結(jié)合為免疫復(fù)合物。理想情況下，測(cè)定復(fù)合物中Eu3+的熒光強(qiáng)度就能確定樣品中抗原的量，但是實(shí)際上這種復(fù)合物種鑭系元素的熒光強(qiáng)度非常弱，只有加入一種增強(qiáng)液，使鑭系元素從復(fù)合物中解離下來，并與增強(qiáng)液中所含的萘甲酰三氟丙酮(β-ΝΑΤ)重新形成微膠囊，在紫外等光的激發(fā)下發(fā)射很強(qiáng)的熒光，增強(qiáng)效果上百萬倍。 用時(shí)光分辨熒光儀測(cè)定熒光強(qiáng)度cps，即可確定樣品抗原中的量。近年來以利用銪絡(luò)合物為代表的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)方法，因其操作方便、環(huán)保和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)正逐漸替代傳統(tǒng)的ELISA測(cè)定方法，用于臨床上。游離的、形成了絡(luò)合物的銪離子(Eu3+)的放射波為615nm，不會(huì)受到激發(fā)波長(340nm)或某種蛋白質(zhì)造成的短壽命背景熒光(350nm 600nm)的影響，所以很適合。BHHCT-Eu3+絡(luò)合物作為標(biāo)記化合物， 可與蛋白質(zhì)直接結(jié)合，通過時(shí)間分辨型熒光測(cè)定可以進(jìn)行高靈敏度分析。BHHCT具有β -二酮結(jié)構(gòu)，與Eu3+結(jié)合的穩(wěn)定系數(shù)高達(dá)IOkiM'文獻(xiàn)報(bào)道，BHHCT-Eu3+絡(luò)合物已經(jīng)用于檢測(cè)人血漿中腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白和免疫球蛋白E(IgE)的含量。但是，還沒有應(yīng)用上述Eu3+絡(luò)合物及P⑶HlO雙抗體檢測(cè)血清中P⑶HlO蛋白方法。如上所述，開發(fā)一種正確定量、操作簡單、穩(wěn)定而靈敏的檢測(cè)血清樣品中P⑶HlO 蛋白的方法，將對(duì)臨床診斷和科研研究起到極為重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種血清中P⑶HlO的TRFIA法檢測(cè)用試劑盒，同時(shí)提出 PCDHlO蛋白N-端肽鏈的制備及其特異性抗體的制備方法，并結(jié)合浙江大學(xué)PCDHlO蛋白 C-端肽鏈特異性抗體制備的方法，以利用這兩種方法制備出來的抗體為材料，用時(shí)間分辨熒光免疫分析方法測(cè)定血清中P⑶HlO蛋白的含量。該血清中P⑶HlO的TRFIA法檢測(cè)用試劑盒簡便可行、靈敏度高。本發(fā)明的一種血清中P⑶HlO的TRFIA法檢測(cè)用試劑盒，具有能與P⑶HlOC-端融合蛋白結(jié)合并被Eu3+絡(luò)合物標(biāo)記的第二抗體凍干品；該第二抗體凍干品是經(jīng)I)以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將PCDH10C 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建PCDH10C端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)載體；2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立rcDHlOC端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯和樹脂純化P⑶HlOC端融合蛋白，用Thrombin酶切除P⑶HlOC端融合蛋白N端的His-tag標(biāo)簽，得到P⑶HlOC端融合蛋白；3)用己切除標(biāo)簽的P⑶HlOC端融合蛋白作為抗原免疫大白兔，產(chǎn)生抗PCDH10C端抗體，收集抗血清，用硫酸銨沉淀、透析、 Protein A-Sepharose親和柱純化所得；還有包被有具有固相結(jié)合部分及能與PCDHION-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體的多孔型微量滴度板。P⑶HlO蛋白檢測(cè)試劑盒的具體制作方法包括如下步驟(一)P⑶HlON-端片段蛋白質(zhì)的制備及能與P⑶HlON-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體的制備。a)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10N 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶HlON-端融合蛋白的原核細(xì)胞P⑶H10N/PET32a表達(dá)載體。所述的采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10N3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶HlON-端融合蛋白的方法是將表達(dá)P⑶HlO的IX IO5 IO7人白血病K562細(xì)胞離心沉淀，加入O. 5 I. 5ml Trizol充分混勻，提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄RNA至cDNA ;然后設(shè)計(jì)上游引物包含BamH I內(nèi)切酶位點(diǎn)GGATCC和下游引物包含Hind III內(nèi)切酶位點(diǎn)AAGCTT，通過PCR的方法直接將P⑶HlON-端DNA序列克隆至pET32aBamH I/ Hind III位點(diǎn)，經(jīng)BamH I和Hind III內(nèi)切酶酶切鑒定合格后，進(jìn)一步用DNA測(cè)序驗(yàn)證，合格即為PCDH10N/PET32a表達(dá)載體。b)將PCDH10N/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10N-端融合蛋白，用 Thrombin酶切除PCDH10N-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽，得到PCDH10N-端融合蛋白。所述的將PCDH10N/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立 P⑶HlON-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化P⑶HlON-端融合蛋白，用Thrombin酶切除P03H10N-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽包括如下步驟I)取I 3 μ I鑒定合格的P⑶H10N/PET32a重組質(zhì)粒加至10 90 μ I感受態(tài)的 BL21 DE3 pLysS大腸桿菌，冰浴15 45min，42°C 60s休克，加入50 350 μ ILB液30 440C 30 90min，涂布含50 150 μ g/ml的LB平板，37 °C孵箱培養(yǎng)過夜，次日，用滅菌牙簽挑取單個(gè)菌落于一管6 8ml新的LB液中，至37°C孵箱靜置過夜，取OD為O. 4 O. 6的過夜菌液300 1000 μ I于一管6 8ml新的LB液中，30 44°C擴(kuò)大培養(yǎng)2 8h，加入終濃度為I 7mM的IPTG誘導(dǎo)O. 5 6h，離心收集細(xì)菌沉淀。2)將細(xì)菌沉淀以每克濕重細(xì)菌加入I 5ml pH6 8，含O. 5 I. 5% Trition,
0.02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液，重懸細(xì)菌，冰浴下超聲粉碎細(xì)菌，高速冷凍離心區(qū)上清液， 沉淀繼續(xù)超聲粉碎，高速冷凍離心，合并上清液，上His金屬螯合樹脂柱，用含5mM咪唑的 pH6 8，O. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液充分洗柱，用5%的柳硫汞檢測(cè)至無蛋白流出為止， 改用含500mM咪唑，pH6 8，0. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集流出的蛋白液，裝入透析袋，2 8°C對(duì)pH6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次。在透析平衡結(jié)束后，用麗10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5
1.5mg/ml,取5 IOmg重組蛋白用Thrombin酶切除N-端的His-tag標(biāo)簽，同時(shí)通過加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到純化的P03H10N-端重組蛋白，該蛋白用 SDS-PAGE電泳時(shí)，5 20μ g/lane應(yīng)無雜蛋白區(qū)帶發(fā)現(xiàn)。c)用已切除標(biāo)簽的P⑶H10N-端融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物(這里采用大白兔)， 產(chǎn)生抗PCDHION-端抗體,收集抗血清,用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗P⑶H10N-端抗體。所述的用已切除標(biāo)簽的P⑶H10N-端融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物(這里采用大白兔)，產(chǎn)生抗P⑶H10N-端抗體的包括如下步驟I)分別取Img的P⑶H10N-端重組蛋白與完全福氏佐劑混勻，充分乳化，接種大白兔皮下3 20余點(diǎn)，每隔5 12天強(qiáng)化免疫I次，待第3 4周末，用0. 5 I. 5mg PCDH10N-端重組蛋白進(jìn)行直接的兔耳靜脈內(nèi)注射，5 7天后分離大白兔頸總動(dòng)脈，剪短放血至三角燒瓶，2 8°C傾斜放置過夜，次日離心收集血清。2)將收集的抗血清,用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗 P⑶H10N-端抗體的方法是將收集的兔血清用2 6倍預(yù)冷的0. 005 0. 03M, pH 6 8PBS稀釋，在不斷攪拌的同時(shí)緩慢加入I 2倍體積的飽和(NH4)2SO4, 2 8°C放置20 30min，離心，去上清，沉淀用O. 5 2倍原體積的PBS復(fù)溶后，再分別用50%和33. 3%的飽和(NH4)2SO4重復(fù)沉淀各I次，最后蛋白沉淀用2 3ml PBS復(fù)溶后，裝入透析袋，2 8°C對(duì) O. 005 O. 03M, pH 6 8PBS透析除鹽，每隔3 12h換液I次，加至預(yù)經(jīng)O. 01M, pH 6 8PBS 平衡的 ProteinA-Sepharose 柱，流速 O. 5ml/min,流盡后，用 O. 02 O. 08M, pH 6 8 的磷酸鹽緩沖液充分洗至無蛋白流出為止，改用3M,pH 6 8硫氰酸鈉洗脫結(jié)合的IgG,合并洗脫液，2 8°C對(duì)pH 6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次，用MW10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5 I. 5mg/ml，分裝，_20°C 保存。( 二)P⑶HlOC-端片段蛋白質(zhì)的制備及能與P⑶HlOC-端融合蛋白及Eu3+絡(luò)合物結(jié)合的第二抗體的制備a)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10C 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶HlOC-端融合蛋白的原核細(xì)胞P⑶H10C/PET32a表達(dá)載體；所述的采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10C3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶Hioc-端融合蛋白的方法是將表達(dá)P⑶HlO的I IO5 IO7人白血病K562細(xì)胞離心沉淀，加入O. 5 I. 5mlTrizol充分混勻，提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄RNA至cDNA ;然后設(shè)計(jì)上游引物包含NdeI內(nèi)切酶位點(diǎn)CATATG和下游引物包含BamH I內(nèi)切酶位點(diǎn)GGATCC，通過PCR的方法直接將P⑶HlOC-端DNA序列克隆至pET32a NdeI/ BamH I位點(diǎn)，經(jīng)Nde I和BamH I內(nèi)切酶酶切鑒定合格后，進(jìn)一步用DNA測(cè)序驗(yàn)證，合格即為 PCDH10C/PET32a 表達(dá)載體。b)將PCDH10C/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10C-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10C-端融合蛋白，用 Thrombin酶切除PCDH10C-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽，得到PCDH10C-端融合蛋白。所述的將PCDH10C/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立 P⑶HlOC-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化P⑶HlOC-端融合蛋白，用Thrombin酶切除P03H10C-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽包括如下步驟I)取I 3 μ I鑒定合格的P⑶H10C/PET32a重組質(zhì)粒加至10 90 μ I感受態(tài)的BL21DE3pLysS大腸桿菌，冰浴15 45min，42°C 60s休克，加入50 350 μ ILB液30 440C 30 90min，涂布含50 150 μ g/ml的LB平板，37 °C孵箱培養(yǎng)過夜，次日，用滅菌牙簽挑取單個(gè)菌落于一管6 8ml新的LB液中，至37°C孵箱靜置過夜，取OD為O. 4 O. 6的過夜菌液300 1000 μ I于一管6 8ml新的LB液中，30 44°C擴(kuò)大培養(yǎng)2 8h，加入終濃度為I 7mM的IPTG誘導(dǎo)O. 5 6h，離心收集細(xì)菌沉淀。2)將細(xì)菌沉淀以每克濕重細(xì)菌加入I 5ml pH6 8，含O. 5 I. 5% Trition,
0.02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液，重懸細(xì)菌，冰浴下超聲粉碎細(xì)菌，高速冷凍離心區(qū)上清液， 沉淀繼續(xù)超聲粉碎，高速冷凍離心，合并上清液，上His金屬螯合樹脂柱，用含5mM咪唑的 pH6 8，O. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液充分洗柱，用5%的柳硫汞檢測(cè)至無蛋白流出為止， 改用含500mM咪唑，pH6 8，0. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集流出的蛋白液，裝入透析袋，2 8°C對(duì)pH6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次。在透析平衡結(jié)束后，用麗10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5
1.5mg/ml,取5 IOmg重組蛋白用Thrombin酶切除N-端的His-tag標(biāo)簽，同時(shí)通過加入Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到純化的P03H10C-端重組蛋白，該蛋白用 SDS-PAGE電泳時(shí)，5 20 μ g/lane應(yīng)無雜蛋白區(qū)帶發(fā)現(xiàn)。c)用已切除標(biāo)簽的rcDHioc-端融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物(這里采用大白兔)， 產(chǎn)生抗PCDHIOC-端抗體,收集抗血清,用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗P⑶HlOC-端抗體。所述的用已切除標(biāo)簽的P⑶HlOC-端融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物(這里采用大白兔)，產(chǎn)生兔抗P⑶HlOC-端抗體的包括如下步驟I)分別取Img的P⑶HlOC-端重組蛋白與完全福氏佐劑混勻，充分乳化，接種大白兔皮下3 20余點(diǎn)，每隔5 12天強(qiáng)化免疫I次，待第3 4周末，用O. 5 I. 5mg PCDH10C-端重組蛋白進(jìn)行直接的兔耳靜脈內(nèi)注射，5 7天后分離大白兔頸總動(dòng)脈，剪短放血至三角燒瓶，2 8°C傾斜放置過夜，次日離心收集血清。2)將收集的抗血清,用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗 P⑶HlOC-端抗體的方法是將收集的兔血清用2 6倍預(yù)冷的O. 005 O. 03M, pH 6 8PBS稀釋，在不斷攪拌的同時(shí)緩慢加入I 2倍體積的飽和(NH4)2SO4, 2 8°C放置20 30min，離心，去上清，沉淀用O. 5 2倍原體積的PBS復(fù)溶后，再分別用50%和33. 3%的飽和(NH4)2SO4重復(fù)沉淀各I次，最后蛋白沉淀用2 3ml PBS復(fù)溶后，裝入透析袋，2 8 V 對(duì)O. 005 O. 03M，pH6 8PBS透析除鹽，每隔3 12h換液I次，加至預(yù)經(jīng)O. 01M, pH 6 8PBS 平衡的 ProteinA-Sepharose 柱，流速 O. 5ml/min,流盡后，用 O. 02 O. 08M, pH 6 8 的磷酸鹽緩沖液充分洗至無蛋白流出為止，改用3M,pH 6 8硫氰酸鈉洗脫結(jié)合的IgG,合并洗脫液，2 8°C對(duì)pH 6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次，用MW10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5 I. 5mg/ml，分裝，_20°C 保存。d)將兔抗PCDH10C-端抗體與無水DTPA —步交聯(lián)，過S印hadexG-75凝膠柱層析把游離的銪離子(Eu3+)去掉。(三)具有固相結(jié)合部分和能與PCDH10N-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體的固相包埋。作為“固相”可應(yīng)用任意形狀和材質(zhì)的固體物質(zhì)，只要能進(jìn)行抗體的結(jié)合且不妨礙上述復(fù)合物形成以及后述的熒光測(cè)定即可。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。本發(fā)明中應(yīng)用的為Corning公司的多孔型微量滴度板?！暗谝豢贵w”是以與上述固相結(jié)合的狀態(tài)存在，且通過抗原-抗體反應(yīng)與所期望的 P⑶HlO蛋白結(jié)合的抗體。把第一抗體包被于固相載體上的步驟用0. 05M，pH9. 6碳酸鹽包被緩沖液將第一抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為I 10 μ g/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lml，4°C過夜。 次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。-20°C保存，直到需要進(jìn)行測(cè)定之
N / .刖。(四)加入待測(cè)樣品和標(biāo)記Eu3+絡(luò)合物的第二抗體a)加入血清樣本100μ 1，37°C，孵育I 2h，洗滌(洗滌液為Tris-Hcl，必要時(shí)可添加適量的具有蛋白質(zhì)促溶能力的非離子表面活性劑，例如Tween，濃度代表性的為約O. 005 約O. 2%，優(yōu)選O. 01 約O. 1% )。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。b)加入Eu3+標(biāo)記的第二抗體加入用BSA適當(dāng)稀釋的第二抗體100 μ I。37°C，孵育2h，充分洗滌。這里加入濃度約為O. 5%左右的優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)，目的是消除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中非特異性反應(yīng)，提高靈敏度。此步驟中，存在于血清樣品中的所期望的P⑶HlO蛋白或作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的P⑶HlO 蛋白，它通過與第一抗體結(jié)合而固定到固相上。P⑶HlO蛋白不必以游離狀態(tài)與第一抗體接觸，它可與標(biāo)記Eu3+絡(luò)合物的第二抗體結(jié)合后再與第一抗體結(jié)合。這樣本發(fā)明中樣品和標(biāo)記Eu3+絡(luò)合物的第二抗體的加入次序不分先后。(五)增強(qiáng)液的加入以及時(shí)間分辨熒光儀(TRFIA)結(jié)果測(cè)定。a)加增強(qiáng)液:100μ I。增強(qiáng)液由傘酮、popop即1，4_雙(5_苯基_2_噁唑基)苯、 甲醇組成，其目的是增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，提高檢測(cè)靈敏度。結(jié)果測(cè)定測(cè)定上述步驟得到的含有鑭系絡(luò)合物的復(fù)合物裝置是由Wellac公司提供的的時(shí)間分辨型熒光檢測(cè)儀。測(cè)定條件是，代表性的是延遲時(shí)間約為O. 2 約O. 3毫秒 (ms),窗口時(shí)間為約O. 2 約O. 6ms,閃爍速度為約O. 5 約I. 5ms,激發(fā)波長為337. Inm(氮激光的波長)，測(cè)定波長為615nm。測(cè)定對(duì)照組合樣品組的數(shù)據(jù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣品中P⑶HlO蛋白的含量。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施進(jìn)行更詳細(xì)的說明。本發(fā)明試劑盒是基于時(shí)間分辨熒光雙抗體免疫檢測(cè)(TRFIA)方法提出的。“時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)”是應(yīng)用如本發(fā)明鑭系金屬絡(luò)和物的能發(fā)射長壽命熒光的熒光化合物， 通過免疫學(xué)反應(yīng)標(biāo)記測(cè)定對(duì)象物，在較短壽命的背景熒光消失后，對(duì)來自標(biāo)記物的熒光信號(hào)進(jìn)行時(shí)間分辨型測(cè)定的測(cè)定方法。本發(fā)明試劑盒用來測(cè)血清PCDHlO蛋白具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性且操作簡單的優(yōu)本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用，為了選擇性捕捉、標(biāo)記血清樣品中所期望的P⑶HlO蛋白， 在固相上形成含該蛋白的復(fù)合物。具體而言，含有該P(yáng)CDHlO蛋白的復(fù)合物是由以下成分在適宜的固相上形成的(a)具有固相結(jié)合部分和能與PCDH10N-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體；(b)PCDHlO 蛋白；(c)具有能與P⑶HlOC-端融合蛋白和Eu3+絡(luò)合物結(jié)合的第二抗體。據(jù)此，本發(fā)明試劑盒內(nèi)包含P⑶HlON-端融合蛋白、能與P⑶HlON-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體和P⑶HlOC-端融合蛋白、能與P⑶HlOC-端融合蛋白和Eu3+絡(luò)合物結(jié)合的第二抗體。以下，對(duì)各成分進(jìn)行說明。I、將能與固相和KDH10N-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體包被于固相上。作為“固相”可應(yīng)用任意形狀和材質(zhì)的固體物質(zhì)，只要能進(jìn)行抗體的結(jié)合且不妨礙上述復(fù)合物形成以及后述的熒光測(cè)定即可。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。本發(fā)明中應(yīng)用的為Corning公司的多孔型微量滴度板。第一抗體是以與上述固相結(jié)合的狀態(tài)存在，且通過抗原-抗體反應(yīng)與所期望的 P⑶HlO蛋白結(jié)合的抗體。第一抗體的制備步驟如下I)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10N 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶HlON-端融合蛋白的原核細(xì)胞P⑶H10N/PET32a表達(dá)載體；2)將PCDH10N/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10N-端融合蛋白，用 Thrombin酶切除PCDH10N-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽，得到PCDH10N-端融合蛋白；3)用已切除標(biāo)簽的P⑶HlON-端融合蛋白作為抗原免疫大白兔，產(chǎn)生抗 PCDH10N-端抗體,收集抗血清，用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗 PCDH10N-端抗體。2、存在于血清樣品中的所期望的P⑶HlO蛋白，代表性的是通過與第一抗體結(jié)合而固定到固相上。PCDHlO蛋白不必以游離狀態(tài)與第一抗體接觸，它可與后述的第二抗體結(jié)合后與第一抗體結(jié)合。這樣本發(fā)明中復(fù)合物的形成不限于各成分結(jié)合的次序。3、具有能與P⑶HlOC-端融合蛋白和Eu3+絡(luò)合物結(jié)合的第二抗體的制備步驟如下I)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10C 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶HlOC-端融合蛋白的原核細(xì)胞P⑶H10C/PET32a表達(dá)載體；2)將PCDH10C/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10C-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10C-端融合蛋白，用 Thrombin酶切除PCDH10C-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽，得到PCDH10C-端融合蛋白；3)用已切除標(biāo)簽的rcDHlOC-端融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物(這里采用大白兔)， 產(chǎn)生抗PCDHIOC-端抗體,收集抗血清,用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗P⑶H10C-端抗體。4)將兔抗PCDH10C-端抗體與無水DTPA —步交聯(lián)，過S印hadexG-75凝膠柱層析把游離的銪離子(Eu3+)去掉。第二抗體中還需加入優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)，其濃度代表性的為約0.05 約 0. 5%左右，優(yōu)選約0. I 約0. 3%。其目的是來消除試驗(yàn)中非特異性反應(yīng)，從而提高其靈敏度。第二抗體工作濃度的選擇首先采取預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步效價(jià)的滴定，然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及銪標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度) 在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。本發(fā)明方法中第一抗體包埋和樣品檢測(cè)的步驟可以概括如下I)把第一抗體包被于固相載體上用0. 05M，pH9. 6碳酸鹽包被緩沖液將第一抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為I 10 μ g/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lml，4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。_20°C保存，直到需要進(jìn)行測(cè)定之前。2)加樣加入血清樣本100μ 1，37°C，孵育I 2h，洗滌(洗滌液為Tris-Hcl，必要時(shí)可添加適量的具有蛋白質(zhì)促溶能力的非離子表面活性劑，例如Tween，濃度代表性的為約O. 005 約O. 2%，優(yōu)選O. 01 約O. 1% )。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。3)加入第二抗體加入用BSA適當(dāng)稀釋的第二抗體100 μ I。37°C，孵育2h，充分洗漆。4)加增強(qiáng)液100μ I。增強(qiáng)液由傘酮、popop、甲醇組成，其目的是增強(qiáng)熒光強(qiáng)度， 提聞檢測(cè)靈敏度。5)結(jié)果測(cè)定測(cè)定上述步驟得到的含有鑭系絡(luò)合物的復(fù)合物裝置是由Well ac 公司提供的的時(shí)間分辨型熒光檢測(cè)儀。測(cè)定條件是，代表性的是延遲時(shí)間約為O. 2 約 O. 3毫秒(ms),窗口時(shí)間為約O. 2 約O. 6ms,閃爍速度為約O. 5 約I. 5ms,激發(fā)波長為 337. lnm(氮激光的波長)，測(cè)定波長為615nm。時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)(TRFIA)方法，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與熒光物質(zhì)檢測(cè)的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種免疫分析技術(shù)。此發(fā)明中時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定是用鑭系金屬離子絡(luò)合物(如 Eu3+絡(luò)合物)標(biāo)記抗體，檢測(cè)樣品中相應(yīng)的PCDHlO抗原。此絡(luò)合物具有較長熒光壽命，利用時(shí)間分辨熒光分析儀延長測(cè)量時(shí)間，可排除標(biāo)本中非特異性熒光的干擾，所得信號(hào)完全是鑭系金屬離子絡(luò)合物發(fā)射的特異熒光。另一特點(diǎn)是激發(fā)光與熒光的波長差別顯著，其波長轉(zhuǎn)變達(dá)270nm，可有效排除激發(fā)光的干擾，測(cè)得的熒光為鑭系金屬離子絡(luò)合物發(fā)出的特異性熒光信號(hào)。所測(cè)得的熒光信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)樣品含量成正比。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線和被測(cè)樣品數(shù)據(jù)即可獲得血清中P⑶HlO蛋白的數(shù)值。實(shí)施例I :具有固相結(jié)合部分和能與PCDH10N-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體制備I、采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10N 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶HlON-端融合蛋白的方法是將表達(dá)P⑶HlO的I X IO5 IO7人白血病K562細(xì)胞離心沉淀，加入O. 5 I. 5mlTrizol充分混勻，提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄RNA至cDNA ;然后設(shè)計(jì)上游引物包含BamH I內(nèi)切酶位點(diǎn)GGATCC和下游引物包含Hind III內(nèi)切酶位點(diǎn)AAGCTT，通過PCR的方法直接將P⑶HlON-端DNA序列克隆至pET32aBamH I/ Hind III位點(diǎn)，經(jīng)BamH I和Hind III內(nèi)切酶酶切鑒定合格后，進(jìn)一步用DNA測(cè)序驗(yàn)證，合格即為PCDH10N/PET32a表達(dá)載體。2、將PCDH10N/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10N-端融合蛋白，用 Thrombin酶切除P03H10N-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽包括如下步驟I)取I 3 μ I鑒定合格的P⑶H10N/PET32a重組質(zhì)粒加至10 90 μ I感受態(tài)的BL21DE3pLysS大腸桿菌，冰浴15 45min，42°C 60s休克，加入50 350 μ ILB液30 440C 30 90min，涂布含50 150 μ g/ml的LB平板，37 °C孵箱培養(yǎng)過夜，次日，用滅菌牙簽挑取單個(gè)菌落于一管6 8ml新的LB液中，至37°C孵箱靜置過夜，取OD為O. 4 O. 6的過夜菌液300 1000 μ I于一管6 8ml新的LB液中，30 44°C擴(kuò)大培養(yǎng)2 8h，加入終濃度為I 7mM的IPTG誘導(dǎo)O. 5 6h，離心收集細(xì)菌沉淀。2)將細(xì)菌沉淀以每克濕重細(xì)菌加入I 5ml pH6 8，含O. 5 I. 5% Trition,
O.02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液，重懸細(xì)菌，冰浴下超聲粉碎細(xì)菌，高速冷凍離心區(qū)上清液， 沉淀繼續(xù)超聲粉碎，高速冷凍離心，合并上清液，上His金屬螯合樹脂柱，用含5mM咪唑的 pH6 8，O. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液充分洗柱，用5%的柳硫汞檢測(cè)至無蛋白流出為止， 改用含500mM咪唑，pH6 8，0. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集流出的蛋白液，裝入透析袋，2 8°C對(duì)pH6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次。在透析平衡結(jié)束后，用麗10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5
I.5mg/ml,取5 IOmg重組蛋白用Thrombin酶切除N-端的His-tag標(biāo)簽，同時(shí)通過加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到純化的P03H10N-端重組蛋白，該蛋白用 SDS-PAGE電泳時(shí)，5 20 μ g/lane應(yīng)無雜蛋白區(qū)帶發(fā)現(xiàn)。3、用已切除標(biāo)簽的P⑶HlON-端融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物(這里采用大白兔)， 產(chǎn)生抗P⑶HlON-端抗體的包括如下步驟I)分別取Img的P⑶HlON-端重組蛋白與完全福氏佐劑混勻，充分乳化，接種大白兔皮下3 20余點(diǎn)，每隔5 12天強(qiáng)化免疫I次，待第3 4周末，用O. 5 I. 5mg PCDH10N-端重組蛋白進(jìn)行直接的兔耳靜脈內(nèi)注射，5 7天后分離大白兔頸總動(dòng)脈，剪短放血至三角燒瓶，2 8°C傾斜放置過夜，次日離心收集血清。2)將收集的抗血清,用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗 P⑶HlON-端抗體的方法是將收集的兔血清用2 6倍預(yù)冷的O. 005 O. 03M, pH 6 8PBS稀釋，在不斷攪拌的同時(shí)緩慢加入I 2倍體積的飽和(NH4)2SO4, 2 8°C放置20 30min，離心，去上清，沉淀用O. 5 2倍原體積的PBS復(fù)溶后，再分別用50%和33. 3%的飽和(NH4)2SO4重復(fù)沉淀各I次，最后蛋白沉淀用2 3ml PBS復(fù)溶后，裝入透析袋，2 8 V 對(duì)O. 005 O. 03M，pH6 8PBS透析除鹽，每隔3 12h換液I次，加至預(yù)經(jīng)O. 01M, pH 6 8PBS 平衡的 ProteinA-Sepharose 柱，流速 O. 5ml/min,流盡后，用 O. 02 O. 08M, pH 6 8 的磷酸鹽緩沖液充分洗至無蛋白流出為止，改用3M,pH 6 8硫氰酸鈉洗脫結(jié)合的IgG,合并洗脫液，2 8°C對(duì)pH 6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次，用MW10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5 I. 5mg/ml，分裝，_20°C 保存。實(shí)施例2 :具有能與P⑶HlOC-端融合蛋白和BHHCT-Eu3+絡(luò)合物結(jié)合的第二抗體制備I、采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10C 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶HlOC-端融合蛋白的方法是將表達(dá)P⑶HlO的I X IO5 IO7人白血病K562細(xì)胞離心沉淀，加入O. 5 I. 5ml Trizol充分混勻，提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄RNA至cDNA ;然后設(shè)計(jì)上游引物包含NdeI內(nèi)切酶位點(diǎn)CATATG和下游引物包含BamH I內(nèi)切酶位點(diǎn)GGATCC，通過PCR的方法直接將P⑶HlOC-端DNA序列克隆至pET32a Nde I/ BamHI位點(diǎn)，經(jīng)Nde I和BamH I內(nèi)切酶酶切鑒定合格后，進(jìn)一步用DNA測(cè)序驗(yàn)證，合格即為 PCDH10C/PET32a 表達(dá)載體。2、將PCDH10C/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10C-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10C-端融合蛋白，用 Thrombin酶切除P03H10C-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽包括如下步驟I)取I 3 μ I鑒定合格的P⑶H10C/PET32a重組質(zhì)粒加至10 90 μ I感受態(tài)的BL21DE3pLysS大腸桿菌，冰浴15 45min，42°C 60s休克，加入50 350 μ ILB液30 440C 30 90min，涂布含50 150 μ g/ml的LB平板，37 °C孵箱培養(yǎng)過夜，次日，用滅菌牙簽挑取單個(gè)菌落于一管6 8ml新的LB液中，至37°C孵箱靜置過夜，取OD為O. 4 O. 6的過夜菌液300 1000 μ I于一管6 8ml新的LB液中，30 44°C擴(kuò)大培養(yǎng)2 8h，加入終濃度為I 7mM的IPTG誘導(dǎo)O. 5 6h，離心收集細(xì)菌沉淀。2)將細(xì)菌沉淀以每克濕重細(xì)菌加入I 5ml pH6 8，含O. 5 I. 5% Trition,
0.02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液，重懸細(xì)菌，冰浴下超聲粉碎細(xì)菌，高速冷凍離心區(qū)上清液， 沉淀繼續(xù)超聲粉碎，高速冷凍離心，合并上清液，上His金屬螯合樹脂柱，用含5mM咪唑的 pH6 8，O. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液充分洗柱，用5%的柳硫汞檢測(cè)至無蛋白流出為止， 改用含500mM咪唑，pH6 8，0. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集流出的蛋白液，裝入透析袋，2 8°C對(duì)pH6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次。在透析平衡結(jié)束后，用麗10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5
1.5mg/ml,取5 IOmg重組蛋白用Thrombin酶切除N-端的His-tag標(biāo)簽，同時(shí)通過加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到純化的P03H10C-端重組蛋白，該蛋白用 SDS-PAGE電泳時(shí)，5 20 μ g/lane應(yīng)無雜蛋白區(qū)帶發(fā)現(xiàn)。3、用已切除標(biāo)簽的P⑶HlOC-端融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物(這里采用大白兔)， 產(chǎn)生抗P⑶HlOC-端抗體的包括如下步驟I)分別取Img的P⑶HlOC-端重組蛋白與完全福氏佐劑混勻，充分乳化，接種大白兔皮下3 20余點(diǎn)，每隔5 12天強(qiáng)化免疫I次，待第3 4周末，用O. 5 I. 5mg PCDH10C-端重組蛋白進(jìn)行直接的兔耳靜脈內(nèi)注射，5 7天后分離大白兔頸總動(dòng)脈，剪短放血至三角燒瓶，2 8°C傾斜放置過夜，次日離心收集血清。2)將收集的抗血清,用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗 P⑶HlOC-端抗體的方法是將收集的兔血清用2 6倍預(yù)冷的O. 005 O. 03M, pH 6 8PBS稀釋，在不斷攪拌的同時(shí)緩慢加入I 2倍體積的飽和(NH4)2SO4, 2 8°C放置20 30min，離心，去上清，沉淀用O. 5 2倍原體積的PBS復(fù)溶后，再分別用50%和33. 3%的飽和(NH4)2SO4重復(fù)沉淀各I次，最后蛋白沉淀用2 3ml PBS復(fù)溶后，裝入透析袋，2 8 V 對(duì)O. 005 O. 03M，pH6 8PBS透析除鹽，每隔3 12h換液I次，加至預(yù)經(jīng)O. 01M, pH 6 8PBS 平衡的 ProteinA-Sepharose 柱，流速 O. 5ml/min,流盡后，用 O. 02 O. 08M, pH 6 8 的磷酸鹽緩沖液充分洗至無蛋白流出為止，改用3M,pH 6 8硫氰酸鈉洗脫結(jié)合的IgG,合并洗脫液，2 8°C對(duì)pH 6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次，用MW10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5 I. 5mg/ml，分裝，_20°C 保存。實(shí)施例3 :把第一抗體包被于固相載體上用O. 05M, pH9. 6碳酸鹽包被緩沖液將第一抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為I 10 μ g/ ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加O. lml，4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。-20°C保存，直到需要進(jìn)行測(cè)定之前。實(shí)施例4 標(biāo)準(zhǔn)品的TRFIA在已包被第一抗體的96孔微量滴度板中加入含P⑶HlO蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μ I)， 37°C孵育2h，用洗滌液洗滌3次；加入用BHHCT-Eu3+標(biāo)記的第二抗體100μ 1，37°C孵育2h， 用洗滌液充分洗滌；加增強(qiáng)液100 μ I ;應(yīng)用Well ac公司的1420型多標(biāo)記計(jì)數(shù)儀對(duì)該板進(jìn)行固相熒光測(cè)定。實(shí)施例5 :血清樣品的制備用BD公司一次性靜脈真空采血管(不含抗凝劑管紅色蓋或黃色蓋)抽取血液，然后3000 5000rpm離心5 10分鐘，得到血清。_80°C保存血清樣品，分析前融化使用， 不要反復(fù)凍融。實(shí)施例6 :用血清樣品進(jìn)行的TRFIA在已包被第一抗體的96孔微量滴度板中加入血清樣品和陰、陽性對(duì)照各100 μ 1， 37°C孵育2h，用洗滌液洗滌3次；加入用BHHCT-Eu3+標(biāo)記的第二抗體100μ 1，37°C孵育2h， 用洗滌液充分洗滌；加增強(qiáng)液100 μ I ;應(yīng)用Well ac公司的1420型多標(biāo)記計(jì)數(shù)儀對(duì)該板進(jìn)行固相熒光測(cè)定。
權(quán)利要求
1.一種血清rcDHIO的TRFIA法檢測(cè)用試劑盒，具有能與rcDHlOC-端融合蛋白結(jié)合并被Eu3+絡(luò)合物標(biāo)記的第二抗體凍干品；該第二抗體凍干品是經(jīng)I)以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將PCDH10C 3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建PCDH10C端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)載體；2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10C端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯和樹脂純化P⑶HlOC端融合蛋白，用Thrombin酶切除P⑶HlOC端融合蛋白N端的His-tag標(biāo)簽，得到P⑶HlOC端融合蛋白；3)用己切除標(biāo)簽的P⑶HlOC端融合蛋白作為抗原免疫大白兔，產(chǎn)生抗PCDH10C端抗體，收集抗血清，用硫酸銨沉淀、透析、 Protein A-Sepharose親和柱純化所得；其特征是還有包被有具有固相結(jié)合部分及能與 PCDH10N-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體的多孔型微量滴度板。
2.權(quán)利要求書I所述的試劑盒，其特征是其中第一抗體為PCDH10N-端融合蛋白的動(dòng)物抗體；其中第二抗體為PCDH10C-端融合蛋白的動(dòng)物抗體。
3.權(quán)利要求書I所述的試劑盒，其特征是此檢測(cè)試劑盒還包括PCDHlO標(biāo)準(zhǔn)蛋白凍干品、洗滌液、優(yōu)選牛血清BSA和增強(qiáng)液。
4.權(quán)利要求書I所述的試劑盒，其特征是其中包被有具有固相結(jié)合部分及能與 PCDH10N-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體的制備方法為(a)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)直接從體外培養(yǎng)細(xì)胞株中將PCDH10N3’端堿基序列克隆至原核細(xì)胞，構(gòu)建P⑶HlON-端融合蛋白的原核細(xì)胞P⑶H10N/PET32a表達(dá)載體。其特征是在經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄mRNA獲得的cDNA兩端設(shè)計(jì)上游包含BamH I酶切位點(diǎn)之引物和下游包含Hind III酶切位點(diǎn)之引物的cDNA片段經(jīng)高溫多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增為含BamH I和Hind III位點(diǎn)的雙鏈DNA P⑶HlON-端基因，然后克隆入PET32a載體的BamH I/Hind III位點(diǎn)；構(gòu)建P⑶HlON-端融合蛋白的具體方法是將表達(dá)P⑶HlO的I X IO5 IO7人白血病 K562細(xì)胞離心沉淀，加入O. 5 I. 5ml Trizol充分混勻，提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄 RNA至cDNA ;然后設(shè)計(jì)上游引物包含BamH I內(nèi)切酶位點(diǎn)GGATCC和下游引物包含Hind III 內(nèi)切酶位點(diǎn)AAGCTT，通過PCR的方法直接將rcDHlON-端DNA序列克隆至PET32a BamH I/ Hind III位點(diǎn)，經(jīng)BamH I和Hind III內(nèi)切酶酶切鑒定合格后，進(jìn)一步用DNA測(cè)序驗(yàn)證，合格即為PCDH10N/PET32a表達(dá)載體；(b)將PCDH10N/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化P⑶H10N-端融合蛋白，用ThiOmbin 酶切除P⑶H10N-端融合蛋白N-端的His-tag標(biāo)簽，得到P⑶HlON端融合蛋白；所述的將PCDHl0N/PET32a表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21DE3pLysS大腸桿菌，建立PCDH10N-端融合蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，用His金屬螯合樹脂純化PCDH10N-端融合蛋白，用 Thrombin酶切除P03H10N-端融合蛋白N端的His-tag標(biāo)簽包括如下步驟(I)取I 3μ I鑒定合格的rcDH10N/PET32a重組質(zhì)粒加至10 90 μ I感受態(tài)的 BL21DE3pLysS大腸桿菌，冰浴15 45min，42°C 60s休克，加入50 350 μ I LB液30 440C 30 90min，涂布含50 150 μ g/ml的LB平板，37 °C孵箱培養(yǎng)過夜，次日，用滅菌牙簽挑取單個(gè)菌落于一管6 8ml新的LB液中，至37°C孵箱靜置過夜，取OD為0. 4 0. 6的過夜菌液300 1000 μ I于一管6 8ml新的LB液中，30 44°C擴(kuò)大培養(yǎng)2 8h，加入終濃度為I 7mM的IPTG誘導(dǎo)0. 5 6h，離心收集細(xì)菌沉淀；將細(xì)菌沉淀以每克濕重細(xì)菌加入I 5ml pH6 8，含0. 5 I. 5% Trition,0. 02 ·0.08M的磷酸鹽緩沖液，重懸細(xì)菌，冰浴下超聲粉碎細(xì)菌，高速冷凍離心區(qū)上清液，沉淀繼續(xù)超聲粉碎，高速冷凍離心，合并上清液，上His金屬螯合樹脂柱，用含5mM咪唑的pH6 8,0. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液充分洗柱，用5%的柳硫汞檢測(cè)至無蛋白流出為止，改用含500mM咪唑，pH6 8，O. 02 O. 08M的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集流出的蛋白液，裝入透析袋，2 8°C對(duì)pH6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次；在透析平衡結(jié)束后，用麗10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5 ·1.5mg/ml,取5 IOmg重組蛋白用Thrombin酶切除N-端的His-tag標(biāo)簽，同時(shí)通過加入 Avidin-agarose的方法去除Thrombin蛋白，得到純化的P03H10N-端重組蛋白，該蛋白用 SDS-PAGE電泳時(shí)，5 20μ g/lane應(yīng)無雜蛋白區(qū)帶發(fā)現(xiàn)。(c)用已切除標(biāo)簽的P⑶HlON-端融合蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，產(chǎn)生抗P⑶HlON-端抗體；具體包括如下步驟(1)分別取Img的P⑶HlON端重組蛋白與完全福氏佐劑混勻，充分乳化，接種動(dòng)物皮下 3 20余點(diǎn)，每隔5 12天強(qiáng)化免疫I次，待第3 4周末，用O. 5 I. 5mg P⑶HlON端重組蛋白進(jìn)行直接的兔耳靜脈內(nèi)注射，5 7天后分離動(dòng)物頸總動(dòng)脈，剪短放血至三角燒瓶， 2 8°C傾斜放置過夜，次日離心收集血清；(2)將收集的抗血清，用硫酸銨沉淀、透析、ProteinA-Sepharose親和柱純化兔抗 P⑶HlON-端抗體的方法是將收集的兔血清用2 6倍預(yù)冷的O. 005 O. 03M, pH 6 8PBS稀釋，在不斷攪拌的同時(shí)緩慢加入I 2倍體積的飽和(NH4)2SO4, 2 8°C放置20 30min，離心，去上清，沉淀用O. 5 2倍原體積的PBS復(fù)溶后，再分別用50%和33. 3%的飽和(NH4)2SO4重復(fù)沉淀各I次，最后蛋白沉淀用2 3ml PBS復(fù)溶后，裝入透析袋，2 8°C對(duì)O.005 O. 03M, pH 6 8PBS透析除鹽，每隔3 12h換液I次，加至預(yù)經(jīng)O. 01M, pH 6 8PBS 平衡的 ProteinA-Sepharose 柱，流速 O. 5ml/min,流盡后，用 O. 02 O. 08M, pH 6 8 的磷酸鹽緩沖液充分洗至無蛋白流出為止，改用3M,pH 6 8硫氰酸鈉洗脫結(jié)合的IgG,合并洗脫液，2 8°C對(duì)pH 6 8、0. 005 O. 015M的磷酸鹽緩沖液透析除鹽，每隔3 12h換液I次，共3 9次，用MW10000 30000的聚乙二醇濃縮至O. 5 I. 5mg/ml，分裝，_20°C 保存。
5.權(quán)利要求書I所述的試劑盒，其特征是其中的具有固相結(jié)合部分及能與 PCDH10N-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體的多孔型微量滴度板固相包被方法為用Corning公司的多孔型微量滴度板作為固相載體與等量第一抗體在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)從而把第一抗體包被于固相載體上；其具體步驟是用O. 05M, pH9. 6碳酸鹽包被緩沖液將第一抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為I 10 μ g/ml ;在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加O. lml,4°C過夜； 次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。凍干后_20°C保存，直到需要進(jìn)行測(cè)定之前。
6.權(quán)利要求書I所述的試劑盒，其特征是其中的第二抗體凍干品的制備方法中所說的表達(dá)載體是PCDH10C/PET32a。
7.權(quán)利要求書I所述的試劑盒，其特征是其中的具有能與PCDH10C-端融合蛋白結(jié)合并被Eu3+絡(luò)合物標(biāo)記的第二抗體凍干品的Eu3+絡(luò)合物標(biāo)記方法是將兔抗PCDH10C端抗體與無水DTPA —步交聯(lián),過SephadexG-75凝膠柱層析把游離的Eu3+去掉,凍干備用。
8.權(quán)利要求書I所述的試劑盒，其特征是其使用方法是在固相包被有第一抗體的多孔型微量滴度板上加入待測(cè)樣品盒和一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)PCDHlO蛋白和標(biāo)記Eu3+絡(luò)合物的第二抗體，其加入順序不限形成雙抗體夾心免疫復(fù)合體，用洗滌液洗去游離的第二抗體和其他雜蛋白，再加入增效液后進(jìn)行TRFIA時(shí)間分辨免疫熒光分析；測(cè)定對(duì)照組和樣品組的數(shù)據(jù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣品中PCDHlO蛋白的含量；其具體步驟如下加入待測(cè)樣品和標(biāo)記Eu3+絡(luò)合物的第二抗體(1)加入血清樣本100μ1，37°C，孵育I 2h，洗滌，洗滌液為Tris-HCl，或還添加有O.005 O. 2%的Tween，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔及標(biāo)準(zhǔn)P⑶HlO對(duì)照；(2)加入Eu3+標(biāo)記的第二抗體加入用BSA稀釋的第二抗體100μ I。37°C，孵育2h， 充分洗滌；這里加入濃度約為O. 5%左右的優(yōu)選牛血清白蛋白，目的是消除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中非特異性反應(yīng)，提高靈敏度；(3)增強(qiáng)液的加入以及時(shí)間分辨熒光儀結(jié)果測(cè)定；(a)加增強(qiáng)液:100μ I ;增強(qiáng)液由傘酮、popop即1，4_雙(5-苯基-2-噁唑基)苯、甲醇組成，其目的是增強(qiáng)熒光強(qiáng)度，提高檢測(cè)靈敏度；(b)TRFIA測(cè)定條件特征是，延遲時(shí)間約為O. 2 約O. 3毫秒，窗口時(shí)間為O. 2 O. 6ms， 閃爍速度為O. 5 I. 5ms,激發(fā)波長為337. Inm,測(cè)定波長為615nm ;測(cè)定對(duì)照組合樣品組的數(shù)據(jù)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣品中PCDHlO蛋白的含量。
9.權(quán)利要求書3所述的試劑盒，其特征是其中的洗滌液為Tris-HCl。
10.權(quán)利要求書3所述的試劑盒，其特征是其中增效液由傘酮、popop即1，4_雙(5-苯基-2-噁唑基)苯和甲醇組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血清中PCDH10的TRFIA法檢測(cè)用試劑盒，包括PCDH10N-端融合蛋白、能與PCDH10N-端融合蛋白結(jié)合的第一抗體和PCDH10C-端融合蛋白、能與PCDH10C-端融合蛋白及鑭系金屬離子絡(luò)合物結(jié)合的第二抗體，應(yīng)用于檢測(cè)血清樣品中PCDH10蛋白的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在應(yīng)用中具有較長熒光壽命，可排除標(biāo)本中非特異性熒光的干擾，所得信號(hào)完全是鑭系金屬離子絡(luò)合物發(fā)射的特異熒光。另外其激發(fā)光與熒光的波長轉(zhuǎn)變達(dá)270nm，可有效排除激發(fā)光的干擾，測(cè)得的熒光為鑭系金屬離子絡(luò)合物發(fā)出的特異性熒光信號(hào)。所測(cè)得的熒光信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)樣品含量成正比。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102590529SQ20121003473
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者邵偉 申請(qǐng)人:邵偉