專利名稱：測定水中As (III)的適配體-納米金共振瑞利散射光譜法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)，具體是測定水中As (III)的適配體-納米金共振瑞利散射光譜法。
背景技術(shù)：
砷是重要的環(huán)境污染物之一，以原礦或氧化物的形式逸散到周圍環(huán)境中，對大氣、 水體、農(nóng)作物等造成污染。砷可從呼吸道、消化道及皮膚進(jìn)入人體，進(jìn)入體內(nèi)的砷排出緩慢， 可長期蓄積，對人類健康造成了很大的威脅。在環(huán)境和生物樣品中，砷主要以As(III)和 As(V)的形式存在，且三價砷的毒性大于五價砷，世界衛(wèi)生組織推薦10 ng/mL作為飲用水的最新標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立一種高靈敏度、高選擇性檢測砷離子的方法，對于環(huán)境保護(hù)和人類健康都具有很重要的意義。目前，砷的分析方法主要有比色法，電化學(xué)法，熒光法，化學(xué)發(fā)光法，原子吸收光譜法，電感耦合等離子體質(zhì)譜法等。但這些方法有的需要昂貴且復(fù)雜的儀器設(shè)備，有的方法復(fù)雜，有的靈敏度欠佳，有的選擇性欠佳，使得這些方法的使用受到了一定的限制。
核酸適配體是一段由十幾個或幾十個核苷酸組成的單鏈寡聚核苷酸。由于核酸適配體具有精確識別、易體外合成與修飾、穩(wěn)定性好等特性，能夠特異性結(jié)合靶物質(zhì)，已用于分析和臨床檢驗。共振瑞利散射光譜法是一種簡便、快速、靈敏的光譜分析新技術(shù)，在核酸、 蛋白質(zhì)、小分子分析等領(lǐng)域獲得了較好的應(yīng)用。它與適配體反應(yīng)結(jié)合，已建立了一些高靈敏高選擇性的共振瑞利散射光譜法。納米金具有穩(wěn)定性好、生物相容性好及共振瑞利散射效應(yīng)，在適配體分析和共振瑞利散射光譜分析已有應(yīng)用。據(jù)我們所知，有關(guān)適配體修飾納米金共振瑞利散射光譜法檢測砷離子未見報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種簡單快速測定水中As (III) 的適配體-納米金共振瑞利散射光譜法。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是 應(yīng)用適配體-納米金共振瑞利散射光譜法測定As (III)的方法，包括如下步驟(1)制備納米金適配體探針(AussDNA):取序列為5’ -TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGG TACTTCTTCATCG -3’的單鏈DNA (ssDNA)，用二次蒸餾水溶解至濃度為390 nmol/L0移取57.9μ g/mL納米金6. O mL于錐形瓶中，在攪拌條件下緩慢加入1. 8mL 390 nmol/L ssDNA 溶液，加完后繼續(xù)攪拌15min，密封4°C保存。以ssDNA計算，該AussDNA濃度為90 nmol/ L ；(2)制備As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液體系取5支刻度試管，依次移取50 300μ L 90 nmol/ L AussDNA，100 250yL 50 mmol/L pH 8.2的4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉緩沖溶液(HEPES， 含150 mmol/L NaCl)，再分別加入I 60 μ L的5760 ng/mL As (III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，置于超聲波儀上超聲15 min，再加入20 80 μ L 2. O mo I/L NaCl溶液，用二次蒸餾水定容至1. 5 mL,混勻；
(3)制備空白對照溶液用步驟(2)的方法不加As(III)標(biāo)準(zhǔn)液制備空白對照溶液；
(4)分別取按步驟(2)、(3)制備的As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白對照溶液適量，置于比色皿中，于熒光分光光度計上，同步掃描各溶液獲得共振瑞利散射光譜。278nm波長處測定As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液的共振瑞利散射峰強(qiáng)度/，并測定其空白對照溶液的共振瑞利散射峰強(qiáng)度值(Z0)，計算 Λ/ 二1-10 ;
(5)以Λ/對As(III)的濃度關(guān)系做工作曲線；
(6)被測物樣品測定取含有As(III)的被測物水樣；然后移取一定量替換As (III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按步驟(2) (4)操作。算出被測物的Λ/樣=/樣-J0 ；
⑴根據(jù)樣品測得的八/#，查步驟(5)的工作曲線，計算出被測物水樣中As(III)的濃 度。實現(xiàn)本發(fā)明的原理是ssDNA和納米金可通過電荷引力、范德華力、及分子間作用力相互結(jié)合形成較穩(wěn)定的Ay_ssDNA探針,保護(hù)金納米粒子不被較高濃度的鹽聚集。在pH8.2 HEPES緩沖溶液中，當(dāng)溶液中存在As(III)時，As(III)與AussDNA探針中的ssDNA形成穩(wěn)定的As-ssDNA復(fù)合物,釋放出的納米金在NaCl作用下聚集形成粒徑較大的聚集體,導(dǎo)致共振瑞利散射峰強(qiáng)度增強(qiáng)。隨著As (III)濃度增大，AussDNA探針釋放出來的納米金越多，納米金聚集體越多，共振瑞利散射峰強(qiáng)度增強(qiáng)。據(jù)此可建立檢測As (III)的適配體納米金共振瑞利散射光譜法。本發(fā)明的優(yōu)點是與已有的方法相比，本測定方法的儀器簡單，操作簡便，快速，靈敏度高、選擇性好。


圖1為本發(fā)明實施例測定As (III)的部分共振瑞利散射光譜圖。圖中a: 12 nmol/L AussDNA - 200 μ L pH 8.2 HEPES - 0. 05 mol/L NaCl ；b: a+76.8 ng/mL As (III)；
c: a+230. 4 ng/mL As (III)
具體實施例方式實施例
測定水中As (III)的適配體-納米金共振瑞利散射光譜法，包括如下步驟
(1)制備納米金適配體探針(AussDNA):取序列為5’ -TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCG -3’的單鏈DNA (ssDNA)，用二次蒸餾水溶解至濃度為390 nmol/L0移取57.9 μ g/mL納米金6. O mL于錐形瓶中，在攪拌條件下緩慢加入1. 8mL 390 nmol/L ssDNA溶液，加完后繼續(xù)攪拌15min，密封4°C保存。以ssDNA計算，該AussDNA濃度為90 nmol/L ；
(2)制備As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液體系取5支刻度試管，依次移取200μ L 90 nmol/LAussDNA, 200 μ L 50 mmol/L pH 8.2的4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉緩沖溶液(HEPES，含150mmol/L NaCl)，再分別加入1、10、20、30、60 μ L的5760 ng/mL As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，置于超聲波儀上超聲15 min，再加入40 μ L 2. O mol/L NaCl溶液，用二次蒸餾水定容至1. 5mL,混勻；(3)制備空白對照溶液用步驟(2)的方法不加As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備空白對照溶液；(4)分別取按步驟(2)、(3)制備的As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白對照溶液適量，置于比色皿中，于日立F-7000型熒光分光光度計上，設(shè)參數(shù)PMT電壓為450v，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫均為5nm，激發(fā)波長等于發(fā)射波長的條件下同步掃描各溶液獲得共振瑞利散射光譜。278nm 波長處測定As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液的共振瑞利散射峰強(qiáng)度I，并測定其空白對照溶液的共振瑞利散射峰強(qiáng)度值(Z0)，計算Λ J =1-10 ；(5)以Λ/對As(III)的濃度(單位為ng/mL)關(guān)系做工作曲線，其線性回歸方程為Λ/ =8.1C + 21 ；(6)被測物樣品測定取來源不同的含有As(III)的被測物廢水樣3個；然后各移取 1.0 mL替換As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定3份，按步驟(2) (4)操作。算出被測物的Λ/ 樣=/樣_/0，各水樣的Λ/樣平均值分別為75、96、102 ；⑴根據(jù)樣品測得的八/#，查步驟(5)的工作曲線，計算出被測物水樣中As(III)的濃度。
本發(fā)明實施例測定水樣3個，As(III)含量分別為6. 7 ng/mL、9. 3 ng/mLUO. O ng/Π Τ, η
本發(fā)明實施例測定As(III)的線性范圍為3.8 230.4 ng/mL，檢出限(3 α )為1. 9 ng/mL
本發(fā)明檢測方法的驗證取已知As(III)的水樣，加入相近濃度的As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，操作步驟如下(1)制備納米金適配體探針(AussDNA):取序列為5’ -TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGG TACTTCTTCATCG -3’的單鏈DNA (ssDNA)，用二次蒸餾水溶解至濃度為390 nmol/L。移取57.9μ g/mL納米金6. O mL于錐形瓶中,在攪拌條件下緩慢加入1. 8mL 390 nmol/L ssDNA 溶液，加完后繼續(xù)攪拌15min，密封4°C保存。以ssDNA計算，該AussDNA濃度為90 nmol/ L ；(2)制備As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液體系取5支刻度試管，依次移取200μ L 90 nmol/L AussDNA, 200 μ L 50 mmol/L pH 8.2的4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉緩沖溶液(HEPES，含150 mmol/L NaCl)，再分別加入1、10、20、30、60 μ L的5760 ng/mL As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，置于超聲波儀上超聲15 min，再加入40 μ L 2. O mo I/L NaCl溶液，用二次蒸餾水定容至1. 5 mL,混勻；(3)制備空白對照溶液用步驟(2)的方法不加As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備空白對照溶液;(4)分別取按步驟(2)、(3)制備的As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白對照溶液適量，置于比色皿中，于日立F-7000型熒光分光光度計上，設(shè)參數(shù)PMT電壓為450v，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫均為5nm，激發(fā)波 長等于發(fā)射波長的條件下同步掃描各溶液獲得共振瑞利散射光譜。278nm 波長處測定As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液的共振瑞利散射峰強(qiáng)度I，并測定其空白對照溶液的共振瑞利散射峰強(qiáng)度值(Z0)，計算Λ J =1-10 ；(5)以Λ/對As(III)的濃度(單位為ng/mL)關(guān)系做工作曲線，其線性回歸方程為 Δ/=8. 1^+21 ；(6)回收率測定于刻度試管中，準(zhǔn)確移取已知As(III)濃度為6.7 ng/mL,9. 3 ng/mL、10. O ng/mL的水樣各0. 5 mL,平行測定三份,再分別加入100 ng/mL As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液50μ ,混勻，按步驟(2)、(4)操作，測定Λ J平均值分別為66. 0,72. 9,74. 5，計算所測得 As (III)的濃度為 5. 56 ng/mL,6. 41 ng/mL、6. 60 ng/mL，回收率分別為 99. 8%、99. 7%、99. 0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2. 9%、 3. 2%、2. 6%，符合分析誤差的要求，說明該方法準(zhǔn)確可靠。
權(quán)利要求
1.一種測定水中As (III)的適配體-納米金共振瑞利散射光譜法，其特征是包括如下步驟 (1)制備納米金適配體探針(AussDNA):取序列為5’-TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCG -3’的單鏈DNA (ssDNA)，用二次蒸餾水溶解至濃度為390 nmol/L ;移取57. 9μ g/mL納米金6. O mL于錐形瓶中,在攪拌條件下緩慢加入1. 8mL 390 nmol/L ssDNA溶液，加完后繼續(xù)攪拌15min，密封4°C保存；以ssDNA計算，該AussDNA濃度為90 nmol/L ； (2)制備As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液取5支刻度試管，依次移取200μ L 90 nmol/L AussDNA，.200 μ L 50 mmol/L pH 8.2的4-羥乙基哌嗪乙磺酸鈉緩沖溶液(HEPES，含150 mmol/L恥(1)，再分別加入1、10、20、30、60 yL的5760 ng/mL As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，置于超聲波儀上超聲15 min，再加入40 μ L 2. O mo I/L NaCl溶液，用二次蒸餾水定容至1. 5 mL，混勻； (3)制備空白對照溶液用步驟(2)的方法不加As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備空白對照溶液； (4)分別取按步驟(2)、(3)制備的As(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白對照溶液適量，置于比色皿中，于熒光分光光度計上，設(shè)定儀器參數(shù)在激發(fā)波長等于發(fā)射波長的條件下同步掃描各溶液獲得共振瑞利散射光譜；278nm波長處測定As (III)標(biāo)準(zhǔn)溶液的共振瑞利散射峰強(qiáng)度I，并測定其空白對照溶液的共振瑞利散射峰強(qiáng)度值(Jtl)，計算Λ J =1-10 ； (5)以Λ/對As(III)的濃度關(guān)系做工作曲線； (6)被測物樣品測定取含有As(III)的被測物水樣；然后移取一定量替換As (III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按步驟(2) (4)操作，算出被測物的Λ/樣=Im-10 ； ⑴根據(jù)樣品測得的八/#，查步驟(5)的工作曲線，計算出被測物水樣中As(III)的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定水中As(III)的適配體-納米金共振瑞利散射光譜法，主要是利用ssDNA和納米金相互結(jié)合形成較穩(wěn)定的AussDNA探針，保護(hù)金納米粒子不被較高濃度的鹽聚集。在pH8.2HEPES緩沖溶液中，當(dāng)溶液中存在As(III)時，As(III)與AussDNA探針中的ssDNA形成穩(wěn)定的As-ssDNA復(fù)合物，釋放出的納米金在NaCl作用下聚集形成粒徑較大的聚集體，導(dǎo)致共振瑞利散射峰強(qiáng)度增強(qiáng)。隨著As(III)濃度增大，AussDNA探針釋放出來的納米金越多，納米金聚集體越大，共振瑞利散射峰強(qiáng)度增強(qiáng)。據(jù)此可建立測定As(III)的適配體納米金共振瑞利散射光譜法。本測定方法的儀器簡單，操作簡便，快速，靈敏度高、選擇性好。
文檔編號G01N21/64GK102998288SQ20121036430
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者蔣治良, 梁愛惠, 唐美玲 申請人:廣西師范大學(xué)