專利名稱：一種基于納米金棒熒光猝滅效應(yīng)的微流芯片核酸傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光子學(xué)、材料化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程交叉技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于
納米金棒熒光猝滅效應(yīng)的微流芯片核酸傳感方法。
背景技術(shù)：
生物光子學(xué)、納米光子學(xué)是近些年新興的交叉領(lǐng)域?qū)W科，將光學(xué)方法中無損、快 速、實(shí)時(shí)探測(cè)的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用于生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，同時(shí)結(jié)合納米材料技術(shù)，降低器件的體積 及成本，從而實(shí)現(xiàn)十分微量的生物分子傳感探測(cè)。將具有特殊光學(xué)特性的納米金棒材料應(yīng) 用于微流控芯片中，并采用熒光猝滅的方法通過激光掃描光學(xué)探測(cè)手段進(jìn)行對(duì)DNA/RNA的 探測(cè)技術(shù)為制作出低成本、高效率、快速實(shí)時(shí)的生物基因分析芯片提供了可能。
傳統(tǒng)的基因芯片常采用將同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記探針固定在芯片中的方法，通過 放射影像或熒光強(qiáng)度探測(cè)判斷核酸序列。這些方法對(duì)基因探針制作要求比較高，其芯片制 作成本也較高，探針固定難度較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。采用納米材料熒光猝滅方法制作的傳感芯 片，利用納米材料方便了核酸的固定，并且熒光猝滅效應(yīng)其敏感度更高。納米材料同微流芯 片的結(jié)合更減少了樣品及探針的用量，降低成本，簡(jiǎn)化器件結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，利用納米金棒材料快捷方便連接核酸的能 力及其高效的熒光猝滅效應(yīng)，提出了一種探測(cè)DNA雜交的方法。
本發(fā)明的方法包括以下步驟 步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒。具體方法是將制作好的納米金棒溶液以 摩爾比例(1 : 90 110)同牛血清蛋白(BSA)混合攪拌反應(yīng)1 2小時(shí)，靜置10 12個(gè) 小時(shí)完成反應(yīng)。將反應(yīng)后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個(gè)微流 通道并靜置1 2個(gè)小時(shí)。連接了牛血清蛋白的納米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用 而固定在玻璃基底制成的微流通道中。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余未固定 的納米金棒。 步驟(2)、待測(cè)DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接。具體方法是將未經(jīng)過任 何標(biāo)記修飾的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通 道。由于合成的納米金棒表面包覆物具有強(qiáng)正電性，待測(cè)DNA單鏈或RNA分子可以快速地 連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性。隨后用清水沖洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池， DNA雜交緩沖液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩 沖液混合流入微流通道，反應(yīng)0. 5 1. 5個(gè)小時(shí)。當(dāng)納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分 子序列與該通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列互補(bǔ)時(shí)，寡核苷酸將與此序列發(fā)生雜交，從而 使連接寡核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒光染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列 與該通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列沒有互補(bǔ)時(shí)，雜交過程不發(fā)生，熒光染劑仍可發(fā)出明 顯的熒光信號(hào)。 步驟(4)、將完成反應(yīng)的微流通道芯片置于激光掃描探測(cè)樣品臺(tái)，開啟半導(dǎo)體激光 光源，軟件控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通 過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號(hào)強(qiáng)度，予以 記錄，從而完成對(duì)DNA/RNA序列片段的傳感偵測(cè)。 本發(fā)明方法采用納米金棒材料作為熒光猝滅劑，利用其十分高效的熒光猝滅作 用，同時(shí)由于水溶液合成納米金棒方法簡(jiǎn)單方便，其材料表面的強(qiáng)正電性有助于核酸的快 速連接；納米金棒其納米結(jié)構(gòu)使得傳感探測(cè)過程微量化，大大地降低了成本同時(shí)提高了探 測(cè)的敏感度，十分適用于微流控芯片這種結(jié)構(gòu)微型化探測(cè)微量分子的器件。結(jié)合納米材料 技術(shù)在微流控芯片中的應(yīng)用，采用激光掃描探測(cè)熒光猝滅這種新型的光學(xué)手段進(jìn)行核酸的 傳感偵測(cè)，有著極大的技術(shù)發(fā)展應(yīng)用空間和廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1為熒光猝滅原理示意圖；
圖2為光學(xué)探測(cè)裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法所采用的裝置1、多通道微流控芯片。以標(biāo)準(zhǔn)載玻片玻 璃為基底，刻蝕10條50微米寬、50微米深的通道槽，每個(gè)通道間距1毫米，隨后采用玻璃 鍵合的方法密封通道，每條通道有樣品池、緩沖液池及廢液池三個(gè)開孔，微流通道經(jīng)過預(yù)處 理后由壓電微閥控制其液流方向及速度。2、激光掃描及熒光探測(cè)顯微光學(xué)裝置。裝置采用 470納米半導(dǎo)體激光器，激發(fā)光功率為5微瓦，水平方向橫向和縱向的掃描裝置是由兩塊振 鏡控制完成的，振鏡的掃描速度和幅度由軟件控制。激發(fā)光通過在一片二色鏡反射，由10 倍物鏡聚焦在樣品上，樣品發(fā)出的熒光通過物鏡采集，透射過二色鏡并通過熒光波長(zhǎng)帶通 濾波片，在CCD接收記錄熒光信號(hào)，CCD上不同位置的光點(diǎn)明暗強(qiáng)度對(duì)應(yīng)不同掃描微流通道 中的熒光劑熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例(一) —種基于納米金棒熒光猝滅效應(yīng)的微流芯片核酸傳感方法包括如下步驟
步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒。具體方法是將制作好的納米金棒溶液以 摩爾比例(1 : 90)同牛血清蛋白(BSA)混合攪拌反應(yīng)1小時(shí)，靜置10個(gè)小時(shí)完成反應(yīng)。將 反應(yīng)后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個(gè)微流通道并靜置1個(gè)小 時(shí)。連接了牛血清蛋白的納米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃基底制成 的微流通道中。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余未固定的納米金棒。
步驟(2)、待測(cè)DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接。具體方法是將未經(jīng)過任 何標(biāo)記修飾的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通 道。由于合成的納米金棒表面包覆物具有強(qiáng)正電性，待測(cè)DNA單鏈或RNA分子可以快速地 連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余的核酸分子。 步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池， DNA雜交緩沖液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩 沖液混合流入微流通道，反應(yīng)0. 5個(gè)小時(shí)。當(dāng)納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列 與該通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列互補(bǔ)時(shí)，寡核苷酸將與此序列發(fā)生雜交，從而使連接 寡核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒 光染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列與該 通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列沒有互補(bǔ)時(shí)，雜交過程不發(fā)生，熒光染劑仍可發(fā)出明顯的 熒光信號(hào)。 步驟(4)、將完成反應(yīng)的微流通道芯片置于激光掃描探測(cè)樣品臺(tái)，開啟半導(dǎo)體激光 光源，軟件控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通 過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號(hào)強(qiáng)度，予以 記錄，從而完成對(duì)DNA/RNA序列片段的傳感偵測(cè)。
實(shí)施例(二 ) —種基于納米金棒熒光猝滅效應(yīng)的微流芯片核酸傳感方法包括如下步驟
步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒。具體方法是將制作好的納米金棒溶液以 摩爾比例(1 : 100)同牛血清蛋白(BSA)混合攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)，靜置11個(gè)小時(shí)完成反 應(yīng)。將反應(yīng)后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個(gè)微流通道并靜置 1.5個(gè)小時(shí)。連接了牛血清蛋白的納米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃 基底制成的微流通道中。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余未固定的納米金棒。
步驟(2)、待測(cè)DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接。具體方法是將未經(jīng)過任 何標(biāo)記修飾的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通 道。由于合成的納米金棒表面包覆物具有強(qiáng)正電性，待測(cè)DNA單鏈或RNA分子可以快速地 連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性。隨后用清水沖洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池， DNA雜交緩沖液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩 沖液混合流入微流通道，反應(yīng)1個(gè)小時(shí)。當(dāng)納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列與 該通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列互補(bǔ)時(shí)，寡核苷酸將與此序列發(fā)生雜交，從而使連接寡 核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒光 染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列與該通 道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列沒有互補(bǔ)時(shí)，雜交過程不發(fā)生，熒光染劑仍可發(fā)出明顯的熒 光信號(hào)。 步驟(4)、將完成反應(yīng)的微流通道芯片置于激光掃描探測(cè)樣品臺(tái)，開啟半導(dǎo)體激光 光源，軟件控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通 過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號(hào)強(qiáng)度，予以 記錄，從而完成對(duì)DNA/RNA序列片段的傳感偵測(cè)。
實(shí)施例(三) —種基于納米金棒熒光猝滅效應(yīng)的微流芯片核酸傳感方法包括如下步驟
步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒。具體方法是將制作好的納米金棒溶液以 摩爾比例(1 : 110)同牛血清蛋白(BSA)混合攪拌反應(yīng)2小時(shí)，靜置12個(gè)小時(shí)完成反應(yīng)。 將反應(yīng)后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個(gè)微流通道并靜置2個(gè) 小時(shí)。連接了牛血清蛋白的納米金棒由于牛血清蛋白的物理粘附作用而固定在玻璃基底制 成的微流通道中。隨后用清水沖洗微流通道一次，以去除多余未固定的納米金棒。
步驟(2)、待測(cè)DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接。具體方法是將未經(jīng)過任 何標(biāo)記修飾的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通 道。由于合成的納米金棒表面包覆物具有強(qiáng)正電性，待測(cè)DNA單鏈或RNA分子可以快速地 連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性。隨后用清水沖洗微流 通道一次，以去除多余的核酸分子。 步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池， DNA雜交緩沖液(0. 2M NaCl，O. 1M Tris，pH 7. 5)加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩 沖液混合流入微流通道，反應(yīng)1. 5個(gè)小時(shí)。當(dāng)納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列 與該通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列互補(bǔ)時(shí)，寡核苷酸將與此序列發(fā)生雜交，從而使連接 寡核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒 光染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列與該 通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列沒有互補(bǔ)時(shí)，雜交過程不發(fā)生，熒光染劑仍可發(fā)出明顯的 熒光信號(hào)。 步驟(4)、將完成反應(yīng)的微流通道芯片置于激光掃描探測(cè)樣品臺(tái)，開啟半導(dǎo)體激光 光源，軟件控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通 過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號(hào)強(qiáng)度，予以 記錄，從而完成對(duì)DNA/RNA序列片段的傳感偵測(cè)。
以下對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步說明。 如圖1所示，基于納米金棒熒光猝滅效應(yīng)的DNA傳感的原理結(jié)構(gòu)是將納米金棒8 表面修飾牛血清蛋白7，利用牛血清蛋白7的物理粘附能力將納米金棒8固定于微流芯片 通道2中。未知待測(cè)核酸分子4注入微流通道，由于納米金棒表面強(qiáng)正電性，待測(cè)核酸分子 4吸附于納米金棒8表面。連接有熒光染劑6的A序列的寡核苷酸3和B序列的寡核苷酸 5(A與B為兩種不同序列的寡核苷酸)隨同緩沖液一起分別注入不同通道的微流管。雜交 反應(yīng)發(fā)生后，寡核苷酸3與待測(cè)DNA單鏈或RNA分子中某片段因序列互補(bǔ)而雜交，導(dǎo)致熒光 染劑6與納米金棒8空間距離很近，在激發(fā)光1的激勵(lì)下，熒光染劑6發(fā)出的熒光被猝滅； 寡核苷酸5與待測(cè)DNA單鏈或RNA分子中沒有互補(bǔ)序列片段，不能發(fā)生雜交，因而熒光染劑 6距離納米金棒8的空間距離比較遠(yuǎn)，在激發(fā)光1的激勵(lì)下，熒光染劑6發(fā)出明顯的熒光信 號(hào)9。 如圖2所示，半導(dǎo)體激光光源發(fā)出470納米5微瓦的激光光束，經(jīng)過二色鏡，發(fā)射 后通過橫向振鏡10進(jìn)行橫向掃描，橫向振鏡10每掃描擺動(dòng)一下光束聚焦點(diǎn)由一條微流通 道移到相鄰的另一條微流通道，實(shí)現(xiàn)不同微流通道的快速掃描；縱向振鏡11實(shí)現(xiàn)縱向掃 描，在橫向振鏡10完成一次完整橫向掃描后，縱向振鏡11擺動(dòng)一次，實(shí)現(xiàn)同條微流通道中 不同位置的掃描探測(cè)，起多次測(cè)量保證準(zhǔn)確度、降低誤差的作用。激勵(lì)光束經(jīng)過兩個(gè)振鏡后
通過io倍的顯微物鏡聚焦在微流芯片的微流通道上，微流通道中產(chǎn)生的熒光同樣由顯微物鏡收集，激勵(lì)光與產(chǎn)生熒光為同一光路，熒光信號(hào)透射過二色鏡后，經(jīng)由帶通濾波片，最 后在CCD上進(jìn)行接收記錄。 微流芯片上的微流通道管有三處開孔，分別為樣品池，緩沖液池及廢液池。
權(quán)利要求
一種基于納米金棒熒光猝滅效應(yīng)的微流芯片核酸傳感方法，其特征在于該方法包括如下步驟步驟(1)、在微流通道中固定納米金棒，具體方法是將制作好的納米金棒溶液以摩爾比例1∶90～110同牛血清蛋白混合攪拌反應(yīng)1～2小時(shí)，靜置10～12個(gè)小時(shí)完成反應(yīng)；將反應(yīng)后的納米金棒溶液加入微流通道樣品池中，使該溶液充滿整個(gè)微流通道并靜置1～2個(gè)小時(shí)；隨后用清水沖洗微流通道一次；步驟(2)、待測(cè)DNA單鏈或RNA分子同納米金棒的連接，具體方法是將未經(jīng)過任何標(biāo)記修飾的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子溶液加入微流通道樣品池中，使其緩慢通過微流通道；合成的納米金棒表面包覆物具有強(qiáng)正電性，待測(cè)DNA單鏈或RNA分子可以快速地連接并附著在納米金棒表面，并改變納米金棒的表面電性趨于中性；隨后用清水沖洗微流通道一次；步驟(3)、將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池，DNA雜交緩沖液加入緩沖液池，讓熒光染劑和DNA雜交緩沖液混合流入微流通道，反應(yīng)0.5～1.5個(gè)小時(shí)；當(dāng)納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列與該通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列互補(bǔ)時(shí)，寡核苷酸將與此序列發(fā)生雜交，從而使連接寡核苷酸的熒光染劑在空間距離上靠近納米金棒，由于納米金棒高效的熒光猝滅特性，熒光染劑的熒光將被納米金棒猝滅；而如果納米金棒上的待測(cè)DNA單鏈或RNA分子序列與該通道中流過的對(duì)應(yīng)寡核苷酸序列沒有互補(bǔ)時(shí)，雜交過程不發(fā)生，熒光染劑仍可發(fā)出明顯的熒光信號(hào)；步驟(4)、將完成反應(yīng)的微流通道芯片置于激光掃描探測(cè)樣品臺(tái)，開啟半導(dǎo)體激光光源，控制其掃描過程，每次掃描激光光束通過顯微物鏡聚焦在微流通道中心位置，通過激光光束掃描逐條微流通道，由CCD接收每次掃描的各微流通道中熒光信號(hào)強(qiáng)度，予以記錄，從而完成對(duì)DNA/RNA序列片段的傳感偵測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于納米金棒熒光猝滅效應(yīng)的微流芯片核酸傳感方法。傳統(tǒng)方法對(duì)探針要求高，制作成本高。本發(fā)明首先將納米金棒固定在微流通道中，其次將待測(cè)核酸分子溶液加入微流通道樣品池中使其緩慢通過微流通道，然后將連接有不同寡核苷酸序列的熒光染劑分別加入各微流通道的樣品池，DNA雜交緩沖液加入緩沖液池，讓連接有寡核苷酸序列的熒光染劑和DNA雜交緩沖液混合流入微流通道，反應(yīng)0.5～1.5個(gè)小時(shí)。最后將微流通道芯片置于激光掃描探測(cè)樣品臺(tái)，掃描的各微流通道中熒光信號(hào)強(qiáng)度，完成對(duì)DNA/RNA序列片段的傳感偵測(cè)。本發(fā)明方法降低了成本同時(shí)提高了探測(cè)的敏感度，適用于微流控芯片這種結(jié)構(gòu)微型化探測(cè)微量分子的器件。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101709327SQ20091015512
公開日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日
發(fā)明者何賽靈, 李心, 錢駿 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)