專利名稱：一種檢測新霉素殘留的膠體金試紙條及其使用方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥殘留分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測新霉素殘留的膠體金試紙條及其使用方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新霉素(Neomycin，ΝΕΟ)是屬于氨基糖苷類藥物中的一種堿性抗生素。新霉素對第珊對腦神經(jīng)具有損害作用，會造成不可逆性耳聾，并且有較強的腎臟毒性，亦可引起機體對維生素A及B12吸收不良，導(dǎo)致維生素的缺乏而引起相關(guān)病癥。新霉素在獸醫(yī)臨床和畜禽養(yǎng)殖上仍被廣泛應(yīng)用，尤其是不規(guī)范用藥引起畜產(chǎn)品中的新霉素藥物的殘留，會對食品衛(wèi)生、公共健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。因此各國對動物性產(chǎn)品中新霉素的殘留制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。 動物組織中新霉素殘留的檢測方法有微生物法，高效液相色譜法，薄層層析法，電泳法和酶聯(lián)免疫分析法、免疫層析方法等。在動物性組織基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立起來的免疫層析方法具有樣品預(yù)處理簡單，分析時間短，使用方便等特點，在大規(guī)模篩選檢測中有廣闊的應(yīng)用前景。目前，尚未見有新霉素免疫層析試紙條的文獻(xiàn)和專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測新霉素殘留的膠體金試紙條及其使用方法和應(yīng)用。本發(fā)明是基于一種能同時識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體(該單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞EDC/5G04分泌的，雜交瘤細(xì)胞EDC/5G04由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC N0:C201144)，通過制備膠體金，標(biāo)記純化后的抗體，優(yōu)化各項層析條件等，制備了膠體金試紙條。針對新霉素具有溶于水，微溶或不溶于常見有機溶劑的特點，采用堿性緩沖液作為提取試劑，加熱使蛋白質(zhì)變性以減少基質(zhì)的干擾等手段，建立了組織樣品中新霉素的提取方法，進(jìn)而完成本發(fā)明。上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種膠體金試紙條，包括吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊依次粘貼在塑料襯板上，其特征在于所述金標(biāo)墊包被有膠體金標(biāo)記的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體，所述檢測線包被有新霉素包被原，所述質(zhì)控線包被有羊或兔抗鼠IgG。所述的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞EDC/5G04所分泌的，所述雜交瘤細(xì)胞EDC/5G04于2011年6月29日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC N0:C201144。所述的新霉素包被原是由新霉素(NEO)與卵清蛋白(OVA)形成的偶聯(lián)物(NEO-OVA)0所述的膠體金試紙條的使用方法，包括用樣品提取液對組織樣品前處理和用膠體金試紙條進(jìn)行檢測的步驟，所述樣品提取液為PHlO 11的磷酸鹽緩沖液，其配制方法為準(zhǔn)確稱取 KH2PO4 O. 40g, NaCl 20. 00g, Na2HPO4 · Iffi2O 13. 40g, KCl O. 50，NaOH O. 32g,少量超純水溶解，定容至500mL，所述前處理的方法為稱取組織勻漿樣品lg，加入IOml樣品提取液，渦旋混勻，60°C孵育30分鐘，冷卻至室溫并搖勻，以4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，室溫離心10分鐘，取上清液。所述組織樣品為牛奶、雞肉，豬肉、蝦肉、牛肉、羊肉、豬肝中的一種或多種。所述的膠體金試紙條在新霉素殘留檢測中的應(yīng)用。具體步驟如下(I)復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞EDC/5G04，免疫小鼠，制備單克隆抗體，并利用辛酸硫酸銨進(jìn)行純化。
(2)利用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，優(yōu)化標(biāo)記條件，制備膠體金標(biāo)記的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體；(3)將包被原NEO-OVA和羊或兔抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上；(4)將待測樣品用緩沖液提取，利用試紙條檢測。檢測時，若樣品中有新霉素，則新霉素先和膠體金標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合，到達(dá)檢測線時，已結(jié)合了新霉素的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體就不會與包被在硝酸纖維素膜上的包被原(NEO-OVA)發(fā)生結(jié)合，就不會在檢測線處形成肉眼可見的紅色沉淀線，膠體金標(biāo)記的抗體繼續(xù)向前泳動，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，判為陽性結(jié)果。若樣品中不含有新霉素，檢測時，膠體金標(biāo)記的單克隆抗體就會與包被在硝酸纖維素膜上的包被原(NEO-OVA)發(fā)生結(jié)合，在檢測線處形成肉眼可見的紅色沉淀線，未反應(yīng)完的膠體金標(biāo)記的抗體繼續(xù)向前泳動，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，判為陰性結(jié)果。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明膠體金試紙條能快速檢測包括動物肌肉和肝臟，以及牛奶等樣品中的新霉素，最低檢測限為500 μ g/L，，特異性高，準(zhǔn)確性好。本發(fā)明涉及的組織樣品處理方法簡單，易操作，樣品處理所用的主要試劑為堿性條件的磷酸鹽緩沖液，樣品處理完全沒有涉及有機試劑，對操作者身體健康和環(huán)境的危害較小。


圖I是本發(fā)明的技術(shù)路線圖。圖2是本發(fā)明膠體金試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中1 一吸收墊；2 —硝酸纖維素膜；3 一金標(biāo)墊；4 一樣品墊；5 —檢測線；6 —質(zhì)控線；7 —塑料襯板。圖3是本發(fā)明膠體金試紙條的顯色示意圖，圖中a —陰性、b —陽性、c 一無效，其中T為檢測線，C為質(zhì)控線。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限制本發(fā)明。實施例I膠體金試紙條的制備I. I單克隆抗體的制備及純化I. I. I腹水的制備在接種前7天取Balb/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射O. 5ml弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)處理。用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮由保藏號為CCTCC N0:C201144的雜交瘤細(xì)胞EDC/5G04擴大培養(yǎng)的細(xì)胞，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至I X IO6個/mL，每只小鼠腹腔接種O. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動時采集腹水。I. I. 2單克隆抗體的純化參照朱立平等《免疫學(xué)常用實驗方法》人民軍醫(yī)出版社2000版中的方法取所得的小鼠腹水5ml與適量的二氧化硅混合，加入等體積的巴比妥緩沖液，室溫振蕩Ih后，室溫靜置30min，取上清于潔凈離心管中，4°C，3000r/m離心IOmin ；取上清液8ml，加入16ml O. 06mol醋酸鈉緩沖液，用HCL調(diào)pH值至4. 5，充分?jǐn)嚢柘戮従徏尤胄了?32μ1后，室溫攪拌30min，然后轉(zhuǎn)入4°C冰箱充分沉淀2h，4°C，15000 r/m離心30min，得上清液22ml，加入2. 2ml O. IM的磷酸緩沖液，用NaOH調(diào)pH值至7. 6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為O. 277g/ml，4°C冰箱充分沉淀2h后，4°C，12000r/m離心30min，棄上清，沉淀用5ml O. IM的磷酸緩沖液重懸，裝入透析袋，對5000ml O. OlM pH7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)充分透析后，再對2000ml蒸餾水透析，最后對3000ml三蒸去離子水透析，將充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇一 20000 (PEG - 20000)濃縮至3ml，然后4°C，12000r/m離心30min，棄沉淀，收集上清液，測得蛋白濃度為3. 3mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定為純化的單克隆抗體，純度為98%。該單克隆抗體可用于制備檢測新霉素殘留的試劑。 I. 2膠體金、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的制備I. 2. I溶液的配制(I)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4°C備用，有效期四個月。IOOOml 1%氯金酸溶液配方IOg氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)檸檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解檸檬酸三鈉，配成1%溶液，O. 22ΜΠ1膜濾過，置4°C備用,有效期四個月，雙蒸去離子水定容至1000ml。(3) O. IM碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，O. 22ΜΠ1膜濾過，置4°C備用，有效期四個月。IOOOml O. IM碳酸鉀溶液配方13. 8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。(4) 2% PEG-20000的配制用雙蒸去離子水配制，O. 22Mm膜濾過，置4°C備用，有效期四個月。1000ml2% PEG-20000溶液配方20g PEG-20000 ;雙蒸去離子水定容至1000ml。(5)標(biāo)記洗滌保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)，0. 05%疊氮鈉(NaN3)，O. OlMpH 7.2 PBS溶液，0.22Mm膜濾過，置4°C備用，有效期四個月。1000 ml標(biāo)記洗滌保存液配方20g BSA, O. 5g NaN3, O. OlM pH 7. 2 PBS 溶液定容至 1000ml。I. 2. 2膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成O. 01%，置電爐煮沸，按每IOOml O. 01%氯金酸加入2ml 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。I. 2. 3膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的制備將20ml膠體金加入50ml小燒杯中，用電磁攪拌器250rpm攪拌,加入O. IM的K2CO3調(diào)節(jié)至最佳pH處。緩慢逐滴加入雜交瘤細(xì)胞EDC/5G04所分泌的單克隆抗體，攪拌反應(yīng)30min。加入10%的BSA溶液，使BSA終濃度達(dá)到1%，持續(xù)攪拌lOmin。4°C條件下靜置lh。將標(biāo)記好的單克隆抗體復(fù)合物以10000r/min,4°C離心30min,棄去上清；沉淀用含1%BSA的IOmM磷酸鹽緩沖液(PB，pH值約為7. O)緩沖液重懸于原體積，重復(fù)離心兩次；沉淀用配好的含1%BSA的IOmM的PB (含O. 02%NaN3)緩沖液重懸于原體積1/10中，4°C保存?zhèn)溆?。I. 3金標(biāo)墊3的制備
封閉液的配制2% BSA, O. 1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton Χ_100)、0· 05%NaN3, O. OlM pH 7.2 PBS溶液，O. 22Mm微孔濾膜濾過，置4°C備用，有效期四個月。IOOOml封閉液配方20g BSA, O. 5g NaN3iIml Triton X_100、0. OlM pH7. 2PBS 溶液定容至 1000ml。金標(biāo)墊3的制備將金標(biāo)墊3浸泡于封閉液中30min后，于37°C烘干。然后將制備好的膠體金標(biāo)記單克隆抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4°C備用。I. 4試紙條樣品墊4的制備封閉液的配制2%BSA, O. 1% Triton Χ_100、0· 05% NaN3, O. OlM pH 7.2 PBS 溶液，O. 22Mm微孔濾膜濾過，置4°C備用，有效期四個月。IOOOml封閉液配方20g BSA,O. 5gNaN3'Iml Triton X_100、0. OlM ρΗ7· 2PBS 溶液定容至 1000ml。樣品墊4的制備將樣品墊4浸泡于封閉液中30min后，于37°C烘干，封裝，置4°C備用?！. 5試紙條的組裝將吸收墊I、硝酸纖維素膜2、金標(biāo)墊3、樣品墊4按圖2所示依次層疊粘貼在塑料襯板7上，切成3mm寬的小條。每十小條一包，加入干燥劑，真空封裝。4 8°C保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個月。實施例2膠體金試紙條的使用方法和應(yīng)用2. I膠體金試紙條檢測方法的優(yōu)化當(dāng)包被濃度為O. 005mg/ml時，陰性空白檢測線顯色不明顯，說明包被原濃度太低，攔截膠體金標(biāo)記抗體量太少，需要增加包被原的濃度，當(dāng)包被濃度為大于O. 01mg/ml時，檢測靈敏度達(dá)不到要求，當(dāng)包被濃度為0. 01mg/ml時，陰性空白顯色清晰，并且能夠檢測出50 μ g/L的標(biāo)準(zhǔn)品,最終確定新霉素包被原的包被濃度為0. Olmg/mlo確定包被原濃度后，包被不同濃度的羊或兔抗鼠IgG，使質(zhì)控線顯色情況與檢測線顯色情況基本一致，羊或兔抗鼠IgG濃度為0. 2mg/ml時,質(zhì)控線顯色較淺,0. lmg/ml時,相比較檢測線顯色情況，質(zhì)控線顯色僅隱約可見，當(dāng)羊或兔抗鼠IgG濃度為0. 3mg/ml時，質(zhì)控線與檢測線顯色基本一致，并且顯色清晰，所以最終選擇了 0. 3mg/ml作為膠體金試紙條羊或兔抗鼠IgG包被的濃度。2.2樣品前處理方法2. 2. I試劑的配制新霉素樣品提取液(0. IM磷酸鹽緩沖液，pHIO 11):準(zhǔn)確稱取KH2PO4 0. 40g，NaCl20. 00g, Na2HPO4 · Iffi2O 13. 40g, KCl O. 50，NaOH 0. 32g 少量超純水溶解，定容至 500mL。2. 2. 2組織樣品前處理稱取肌肉勻漿樣品I. 00±0· Olg于50ml離心管中，加入IOml 0. IM的PBS(pH10 11)緩沖液中，充分渦旋混勻，60 V孵育30min，冷卻至室溫并搖勻，4000r/min,室溫離心lOmin，取上清液檢測。2. 3膠體金試紙條檢測步驟每次使用試紙條檢測時均需要設(shè)置對照用移液器或者滴管滴加100 μ L水或者陰性的樣品于樣品口中。樣品檢測方法將待測樣品處理后，取IOOyL加入加樣孔中，通過樣品檢測試紙條和對照試紙條檢測線的顯色情況比較來判斷待測樣品的陰陽性。陰陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)如樣品檢測試紙條和對照的檢測試紙條顏色深淺一致或者略淺，結(jié)果判斷為陰性；如果樣品檢測試紙條檢測線沒有出現(xiàn)或者檢測線明顯淺于對照試紙條檢測線，結(jié)果判斷為陽性。2. 4膠體金試紙條性能參數(shù)的確定2. 4. I 檢測限 在經(jīng)檢測不含氨基糖苷類藥物的雞肌肉組織添加新霉素濃度為0μ g/L、100y g/L、200 μ g/L、300 μ g/L、400 μ g/L、500 μ g/L、600 μ g/L 和 1000 μ g/L，樣品處理后，用試紙條檢測，檢測結(jié)果表明當(dāng)濃度等于或大于500μ g/kg時，檢測線完全不顯色，結(jié)果顯示為陽性，當(dāng)濃度低于500 μ g/kg時結(jié)果為陰性。所以該試紙條檢測雞肉組織的檢測限為500 μ g/L02. 4. 2 特異性檢測氨基糖苷類藥物(慶大霉素、阿米卡星、巴龍霉素、卡那霉素、鏈霉素、妥布霉素)和其他藥物(萊克多巴胺、沙丁胺醇、泰樂菌素和氯霉素)的標(biāo)準(zhǔn)品，用PBS配成不同濃度，分別為50μ g/L、500y g/L，并設(shè)置陰性對照，用試紙條進(jìn)行檢測，設(shè)置三次重復(fù)，觀察顯色結(jié)果。結(jié)果顯示，當(dāng)藥物濃度大于50 μ g/L時,試紙條對新霉素、阿米卡星，巴龍霉藥物檢測結(jié)果為陽性，當(dāng)藥物濃度為500 μ g/L時，試紙條檢測氨基糖苷類其他藥物，慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、妥布霉素和其他藥物，如萊克多巴胺、沙丁胺醇、泰樂菌素和氯霉素，檢測結(jié)果均為陰性，結(jié)果表明，該試紙條具有較好的特異性。2. 4. 3假陰性率與假陽性率測定在雞、豬肌肉組織添中加新霉素藥物，濃度為O μ g/L、250 μ g/L、500 μ g/L和1000 μ g/L各25份，分別用試紙進(jìn)行檢測。用O μ g/L及250 μ g/L濃度的添加樣品計算假陽性率，假陽性率=假陽性樣品數(shù)Λ00Χ 100% ;用500 μ g/L濃度的添加樣品計算假陰性率，假陰性率=假陰性樣品數(shù)Λ00Χ 100%。試紙條檢測結(jié)果如下(表I)所示，其中50份空白對照樣品和添加新霉素藥物濃度為250 μ g/kg檢測結(jié)果全部為陰性，藥物濃度500 μ g/kg、1000 μ g/kg，檢測結(jié)果全部為陽性，試紙條陽性符合率為100% (100/100)，陰性符合率為100%(100/100)，說明試紙條的準(zhǔn)
確性比較高。表I膠體金試紙條的假陰性率與假陽性率測定結(jié)果
新霉素O μ g/kg 250 μ g/kg 500 μ g/kg 1000 μ g/kg
雞肉樣品數(shù)~25252525
豬肉樣品數(shù)~25252525
￥1全部陰性全部陰性全部陽性全部陽性~
權(quán)利要求
1.一種膠體金試紙條，包括吸收墊(I)、硝酸纖維素膜(2)、金標(biāo)墊(3)、樣品墊(4)，所述硝酸纖維素膜(2)上設(shè)有檢測線(5)和質(zhì)控線(6)，所述吸收墊(I)、硝酸纖維素膜(2)、金標(biāo)墊(3)、樣品墊(4)依次粘貼在塑料襯板(7)上，其特征在于所述金標(biāo)墊(3)包被有膠體金標(biāo)記的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體，所述檢測線(4)包被有新霉素包被原，所述質(zhì)控線(5)包被有羊或兔抗鼠IgG。
2.如權(quán)利要求I所述的膠體金試紙條，其特征在于所述的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體是由保藏號為CCTCC N0:C201144雜交瘤細(xì)胞EDC/5G04所分泌的。
3.如權(quán)利要求I所述的膠體金試紙條，其特征在于所述的新霉素包被原是由新霉素與卵清蛋白形成的偶聯(lián)物。
4.如權(quán)利要求I一 3任何一項所述的膠體金試紙條的使用方法，其特征在于包括用樣品提取液對組織樣品前處理和用膠體金試紙條進(jìn)行檢測的步驟，所述樣品提取液為pHIO 11的磷酸鹽緩沖液，其配制方法為準(zhǔn)確稱取KH2PO4 O. 40g, NaCl 20. OOg,Na2HPO4 · 12H20 13. 40g, KCl O. 50，NaOH O. 32g，少量超純水溶解，定容至 500mL，所述前處理的方法為稱取組織勻漿樣品lg，加入IOml樣品提取液，渦旋混勻，60°C孵育30分鐘，冷卻至室溫并搖勻，以4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，室溫離心10分鐘，取上清液。
5.如權(quán)利要求4所述的膠體金試紙條的使用方法，其特征在于所述組織樣品為牛奶、雞肉，豬肉、蝦肉、牛肉、羊肉、豬肝中的一種或多種。
6.權(quán)利要求I一 3任何一項所述的膠體金試紙條在新霉素殘留檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠體金試紙條，該試紙條由吸收墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊依次層疊粘貼在塑料襯板上構(gòu)成，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述金標(biāo)墊包被有膠體金標(biāo)記的能識別新霉素、阿米卡星和巴龍霉素的單克隆抗體，所述檢測線包被有新霉素包被原，所述質(zhì)控線包被有羊或兔抗鼠IgG。本發(fā)明還公開了一種膠體金試紙條的使用方法及其在新霉素殘留檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明可用于對牛奶、雞肉，豬肉、蝦肉、牛肉、羊肉、豬肝等組織樣品進(jìn)行新霉素殘留快速檢測，最低檢測限為500μg/L，特異性高，準(zhǔn)確性好。
文檔編號G01N33/577GK102778563SQ20121017642
公開日2012年11月14日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者劉振利, 彭大鵬, 彭慶娟, 王玉蓮, 袁宗輝, 陳冬梅, 陶燕飛 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)