專(zhuān)利名稱：檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法。
背景技術(shù)：
花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類(lèi)化合物，廣泛存在于黑米、紫薯、葡萄、藍(lán)莓、甘藍(lán)等多種天然有色蔬菜和水果的花、果實(shí)、莖、葉和根器官的細(xì)胞液中。由于花色苷具有抗氧化、清除自由基作用、抗炎、降血脂、心血管保護(hù)、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、保肝等作用，因此添加花色苷的食品備受人們喜愛(ài)。國(guó)內(nèi)外以花色苷為原料的保健食品和膳食補(bǔ)充劑已經(jīng)開(kāi)始上市，其健康功效明顯?；ㄉ盏目寡趸⑶宄杂苫饔?、減少血漿氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL)形成、抗腫瘤、心血管保護(hù)、抗衰老、抗炎、保肝等功效與花色苷的在不同組織細(xì)胞的生物利用率有關(guān)。目前關(guān)于花色苷研究主要集中在腸道吸收和血、尿中代謝物檢測(cè)方面，但相關(guān)檢測(cè)結(jié)果無(wú)法反映在其他靶細(xì)胞的生物利用情況。同時(shí)， 關(guān)于花色苷在不同的靶細(xì)胞的生物利用，目前沒(méi)有一種方便、敏感和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。因此，急需一種檢測(cè)花色苷的方法，用于研究花色苷的在體內(nèi)靶細(xì)胞的生物利用。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法， 該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，可檢范圍寬，不需要特殊設(shè)備，即能定性還能定量分析。為實(shí)現(xiàn)上述目的，技術(shù)方案為
檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，包括以下步驟
a.用終濃度為I 200μ M的花色苷處理靶細(xì)胞，得處理靶細(xì)胞；
b.將步驟a所得處理靶細(xì)胞先用PBS洗滌，再用胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后破碎細(xì)胞，最后離心收集上清液，備用；
c.將步驟b所得上清液用氮?dú)飧稍铮稍锖笕苡趐H=3 3.5的甲醇溶液中，測(cè)定在最大接收波長(zhǎng)的突光 強(qiáng)度；
d.準(zhǔn)確稱取花色苷，溶于pH=3 3.5的甲醇溶液中，配置成濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，然后測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液在最大接收波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度和熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算步驟c所得熒光強(qiáng)度的花色苷濃度，用生物利用度=花色苷濃度X樣品體積計(jì)算花色苷在靶細(xì)胞的生物利用度。本發(fā)明中，pH=3 3. 5的甲醇溶液的配制方法取分析純甲醇溶液200mL，用濃度為 IM的鹽酸逐滴加入，至pH計(jì)測(cè)定溶液pH=3 3. 5即得。進(jìn)一步，所述步驟a是將花色苷溶于pH=3的甲醇溶液中，然后加入靶細(xì)胞中至花色苷終濃度為I 200 μ M，在37°C、100%飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少I(mǎi)小時(shí)。進(jìn)一步，所述步驟a是用終濃度為50-200 μ M的花色苷處理靶細(xì)胞。進(jìn)一步，所述步驟b中，所述胰蛋白酶消化是用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 25% O. 5%的胰蛋白酶消化；
進(jìn)一步，所述破碎細(xì)胞為在功率為IOOW的超聲破碎儀中超聲至少10分鐘；所述離心為在溫度為4°C、12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘。進(jìn)一步，所述步驟b中，所述胰蛋白酶消化后，破碎細(xì)胞前還包括如下步驟，離心收集收集細(xì)胞，加入lmL，pH=3. O的甲醇溶液重懸細(xì)胞，準(zhǔn)確收集I X IO6個(gè)細(xì)胞。進(jìn)一步，所述步驟d中，所述濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液是將花色苷溶于pH=3的甲醇溶液，配制成花色苷濃度分別為 O. I μ M, I μ M, 5 μ M, 10 μ M, 20 μ M, 40 μ M, 80 μ Μ, 160 μ M 320 μ M的標(biāo)準(zhǔn)液。進(jìn)一步，所述靶細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞，小腸上皮細(xì)胞，肝細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。進(jìn)一步，所述花色苷為飛燕草素或矢車(chē)菊素。本方法的有益效果在于本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法， 利用了花色苷的自發(fā)熒光特性，運(yùn)用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)花色苷在體內(nèi)靶細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，經(jīng)過(guò)計(jì)算得出花色苷在靶細(xì)胞的生物利用率，該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)線性范圍寬，每IO6個(gè)細(xì)胞最低檢測(cè)濃度低至O. Inmol,最高檢測(cè)濃度達(dá)IOOnmol,結(jié)果準(zhǔn)確性高，靈敏度高，重復(fù)性好，為進(jìn)一步研究花色苷的亞細(xì)胞定位分布、生物學(xué)活性和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為利用分子修飾研制具有組織靶向性的治療藥物提供理論依據(jù)。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖I為本發(fā)明突光分光光度計(jì)對(duì)飛燕草素(delphinidin)的全波長(zhǎng)掃描圖。圖2為本發(fā)明飛燕草素在血管內(nèi)皮細(xì)胞生物利用度。圖3為本發(fā)明飛燕草素在小腸上皮細(xì)胞的生物利用度。圖4為本發(fā)明矢車(chē)菊素在肝細(xì)胞的生物利用度。圖5為本發(fā)明飛燕草素在腫瘤細(xì)胞的生物利用度。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。本方法主要利用花色苷的自發(fā)熒光特性，運(yùn)用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)花色苷在體內(nèi)靶組織的生物利用度。實(shí)施例I、花色苷熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
對(duì)花色苷單體飛燕草素(delphinidin)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果如圖I所示，結(jié)果顯示花色苷在350 500nm均有吸收，最大接收波長(zhǎng)為379nm。將飛燕草素溶于pH=3 3. 5的甲醇溶液中，配制成濃度分別為 O. I μ M，I μ M，5 μ M，10 μ M，20 μ M，40 μ M，80 μ Μ, 160 μ M 和 320 μ M 的標(biāo)準(zhǔn)液，利用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)315nm，最大接收波長(zhǎng)379nm條件下，分別測(cè)不同濃度飛燕草素的熒光強(qiáng)度，以濃度為橫坐標(biāo)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立飛燕草素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)曲線。利用SPSS13. O軟件進(jìn)行回歸分析，回歸方程為Y = 3. 203X + 9. 116，其中Y表示熒光強(qiáng)度，X表示飛燕草素終濃度。實(shí)施例2、熒光分光光度計(jì)測(cè)定花色苷在血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物利用度
將血管內(nèi)皮細(xì)胞EA. hy926接種至活細(xì)胞培養(yǎng)皿，并向培養(yǎng)皿中加入花色苷至花色苷終濃度分別為I μ M，50 μ M，100 μ Μ, 150 μ M和200 μ Μ,然后在溫度為37°C、100%飽和濕度、 CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在I小時(shí)后取樣；所取樣品用冰冷的PBS洗滌兩次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 25%的胰蛋白酶消化，離心，去上清，收集細(xì)胞，加入lmL, ρΗ=3. O的甲醇溶液，重懸細(xì)胞，并利用細(xì)胞密度計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，然后準(zhǔn)確收集I X IO6個(gè)細(xì)胞，充氮?dú)夂?，蓋上EP管蓋，在功率為100W的超聲破碎儀中超聲15分鐘，破碎細(xì)胞；再在溫度為4°C、 12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘，取上清液，重復(fù)此步驟兩次。將收集的上清液，以氮?dú)飧稍?，加?00 μ L的ρΗ=3的甲醇溶液，用熒光分光光度計(jì)，在激發(fā)波長(zhǎng)為315nm，飛燕草素最大接收波長(zhǎng)為379nm處，測(cè)定花色苷熒光強(qiáng)度，結(jié)果如表I所示。根據(jù)飛燕草素的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = 3. 203X + 9. 116，計(jì)算飛燕草素在血管內(nèi)皮細(xì)胞的濃度，再由如下公式飛燕草素在內(nèi)皮細(xì)胞的生物利用度(nmol/106個(gè)細(xì)胞)=飛燕草素在血管內(nèi)皮細(xì)胞的濃度X樣品體積，計(jì)算飛燕草素在內(nèi)皮細(xì)胞的生物利用度，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在處理I小時(shí)后，用濃度為50 μ M飛燕草素處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞EA. hy926，飛燕草素能夠被利用，并隨著飛燕草素的濃度升 高，飛燕草素的生物利用度逐漸升高。
表I、不同濃度的飛燕草素在血管內(nèi)皮細(xì)胞熒光強(qiáng)度瓦濃度(μ M) j飛燕草素的熒光強(qiáng)度( ο6個(gè)細(xì)胞) _
權(quán)利要求
1.檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于，包括以下步驟a.用終濃度為I 200μ M的花色苷處理靶細(xì)胞，得處理靶細(xì)胞；b.將步驟a所得處理靶細(xì)胞先用PBS洗滌，再用胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后破碎細(xì)胞，最后離心收集上清液，備用；c.將步驟b所得上清液用氮?dú)飧稍铮稍锖笕苡趐H=3 3.5的甲醇溶液中，測(cè)定在最大接收波長(zhǎng)的突光強(qiáng)度；d.準(zhǔn)確稱取花色苷，溶于pH=3 3.5的甲醇溶液中，配置成濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，然后測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液在最大接收波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度和熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算步驟c所得熒光強(qiáng)度的花色苷濃度，用生物利用度=花色苷濃度X樣品體積計(jì)算花色苷在靶細(xì)胞的生物利用度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于所述步驟a是將花色苷溶于pH=3的甲醇溶液中，然后加入靶細(xì)胞中至花色苷終濃度為I 200 μ M，在37°C、100%飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少I(mǎi)小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于所述步驟a是用終濃度為50-200 μ M的花色苷處理靶細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于所述步驟b中，所述胰蛋白酶消化是用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 25% O. 5%的胰蛋白酶消化。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于所述破碎細(xì)胞為在功率為100W的超聲破碎儀中超聲至少10分鐘；所述離心為在溫度為4°C、 12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于所述步驟b中，所述胰蛋白酶消化后，還包括如下步驟，離心收集收集細(xì)胞，加入ImL, pH=3.0的甲醇溶液重懸細(xì)胞，準(zhǔn)確收集I X IO6個(gè)細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于所述步驟d中，所述濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液是將花色苷溶于pH=3的甲醇溶液，配制成花色苷濃度分別為 O. I μ M，I μ M，5 μ M，10 μ M，20 μ M，40 μ M，80 μ Μ, 160 μ M 和 320 μ M 的標(biāo)準(zhǔn)液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于所述靶細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞，小腸上皮細(xì)胞，肝細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，其特征在于所述花色苷為飛燕草素或矢車(chē)菊素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞生物利用度的方法，具體為，用終濃度為1～200μM的花色苷處理靶細(xì)胞，得處理靶細(xì)胞；將所得處理靶細(xì)胞先用PBS洗滌，再用胰蛋白酶消化，然后破碎細(xì)胞，最后離心收集上清液；將所得上清液用氮?dú)飧稍?，干燥后溶于pH=3～3.5的甲醇溶液中，測(cè)定在最大接收波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度；準(zhǔn)確稱取花色苷，溶于pH=3～3.5的甲醇溶液中，配置成濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，然后測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液在最大接收波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度和熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靶細(xì)胞的花色苷濃度，最后計(jì)算花色苷在靶細(xì)胞的生物利用度；利用本發(fā)明公開(kāi)的方法可以用于檢測(cè)花色苷在靶細(xì)胞中的生物利用度，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102721675SQ201210165840
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者易龍, 糜漫天, 金鑫, 陳明亮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)