專利名稱：一種采用定向交叉偶聯(lián)技術(shù)制備的短肽抗體試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體檢驗試劑盒，特別涉及短肽抗體ELISA檢驗試劑盒。
背景技術(shù)：
研究表明，II型膠原(CU)是與RA發(fā)病相關(guān)的主要自身抗原之一。抗類風(fēng)濕肽(NTAP)作為一種基于CII主要抗原結(jié)合位點(263-272序列)的變構(gòu)肽，將原型肽中與TCR結(jié)合的氨基酸殘基替換，保留與HLA-DRP I結(jié)合的氨基酸，從而能夠競爭性地抑制自身致病抗原與HLA-DR β I分子的結(jié)合，卻不被TCR識別，特異性地阻斷抗原肽-HLA-TCR復(fù)合物的形成，從發(fā)病上游阻斷RA病理免疫應(yīng)答，達到治療RA的目的。NTAP作為RA治療的潛力藥物，具有很高的開發(fā)和應(yīng)用價值。作為一種多肽，NTAP在體內(nèi)可能會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。NTAP抗體的檢驗對于評價NTAP的安全性和藥效均有很大的作用，是NTAP開發(fā)成藥品的安全性檢驗的必檢之項。作為創(chuàng)新藥物，NTAP沒有現(xiàn)成可用的抗體檢測方法，因此開發(fā)一種靈敏、可信的NTAP抗體檢驗方法，勢在必行。夾心法和直接法是制備ELISA檢測試劑盒的常規(guī)方法，由于NTAP是僅由十個氨基酸組成的短肽，采用常規(guī)方法制備短肽抗體的ELISA檢測試劑盒非常困難。夾心法:即雙抗體夾心法，利用連接于固相載體上的抗體結(jié)合抗原，實現(xiàn)血清中抗原特異性抗體的檢測，由于NTAP屬于短肽，沒有過多的抗原決定簇或可結(jié)合區(qū)域，因此該方法不易實現(xiàn)。直接法:即直接將抗原吸附在載體表面上的方法，而由于NTAP分子量太小，直接包被在固相載體上的效果不好，所得酶標(biāo)板的檢測效果均一性差，檢測結(jié)果的重現(xiàn)性不佳。同時，由于短肽不具有或僅有較低免疫原性，短肽陽性對照抗體不易獲得?，F(xiàn)有技術(shù)通常使用偶聯(lián)載體蛋白的方法制備短肽抗體，但是試驗發(fā)現(xiàn)NTAP直接偶聯(lián)載體蛋白無法獲得滿足檢測的高效價的抗體。NTAP僅由10個氨基酸組成，在體內(nèi)較難形成抗體，且由于其屬于短肽，因此沒有過多的抗原決定簇或可結(jié)合區(qū)域，因此用傳統(tǒng)的陽性抗體制備的方法不能獲得滿足檢測的高效價陽性對照抗體、亦無法用常規(guī)的夾心法或直接法制備包被板及得到檢驗試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在用酶聯(lián)免疫的方法結(jié)合NTAP的特點，采用定向交叉的偶聯(lián)方法，開發(fā)出一種能簡單、準(zhǔn)確的檢驗血清中NTAP抗體的檢驗方法，以求解決NTAP抗體檢驗的難題。本發(fā)明提供了一種用于NTAP抗體檢測的酶標(biāo)板，是包被有NTAP的酶標(biāo)板。包被有NTAP的酶標(biāo)板，NTAP的C端連接半胱氨酸(Cys)，再在半胱氨酸上連接載體蛋白。其載體蛋白選用牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血藍蛋白(KLH)等大分子白蛋白，優(yōu)選為牛血清蛋白(BSA)。所述偶聯(lián)方法為常規(guī)方法，如DDC法(二環(huán)己基碳二亞胺法)，EDC法(對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺法)，戊二醛法或N-琥珀酰亞胺法，其中優(yōu)選EDC法。用于包被抗原的固相載體物質(zhì)為常規(guī)物質(zhì)，可以為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。載體的形式為常規(guī)形式，可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠或小圓片等。本發(fā)明還提供了一種NTAP抗體ELISA檢驗試劑盒。本發(fā)明的NTAP抗體檢驗試劑盒包括包被有NTAP的酶標(biāo)板，純化抗體，酶和二抗。所述包被有多肽藥物NTAP的酶標(biāo)板，是包被有抗原的固相載體，根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合原理檢測受試者體內(nèi)是否有抗體產(chǎn)生。所述包被有NTAP的酶標(biāo)板，NTAP的C端連接半胱氨酸(Cys)，定向偶聯(lián)于載體蛋白，其載體蛋白選用牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血藍蛋白(KLH)等大分子白蛋白，優(yōu)選為牛血清蛋白(BSA);所述偶聯(lián)方法為常規(guī)方法，如DDC法(二環(huán)己基碳二亞胺法)，EDC法(對乙基-N, N- 二甲基丙基碳二亞胺法)，戊二醛法或N-琥珀酰亞胺法，其中優(yōu)選EDC法；用于包被抗原的固相載體物質(zhì)為常規(guī)物質(zhì)，可以為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式為常規(guī)形式，可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠或小圓片等。所述純化抗體 為NTAP陽性抗體，用于做陽性對照，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使可定性、定量檢測結(jié)果。NTAP陽性抗體的獲得:先在NTAP的C端偶聯(lián)半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶聯(lián)相應(yīng)的蛋白載體作為免疫原，也可采用NTAP直接偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原，使用免疫原免疫大鼠，對免疫后的大鼠取血檢測免疫效果，采血純化多克隆抗體，即陽性抗體。其中蛋白載體的選擇原則為:與包被NTAP選用的載體蛋白不同的常規(guī)載體蛋白，其中優(yōu)選血蘭蛋白(KLH);所述偶聯(lián)方法為常規(guī)方法，如DDC法(二環(huán)己基碳二亞胺法)，EDC法(對乙基-N,N- 二甲基丙基碳二亞胺法)，戊二醛法或N-琥珀酰亞胺法，其中優(yōu)選EDC法。

所述的酶和二抗中，所述的酶，用于結(jié)果檢測。酶的選擇標(biāo)準(zhǔn)為:純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。所述的酶可以是辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP)或堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)、葡萄糖氧化酶、β _D_ 半乳糖苷酶、脲酶。所述二抗，是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體，一般是抗所檢測物種(類或亞類)的抗體，例如，檢測大鼠中NTAP抗體，則二抗是抗大鼠的抗體；檢測靈長類中NTAP抗體，則二抗可以是抗猴的抗體，也可以是抗人的抗體。本發(fā)明所述二抗可以是鼠抗抗體、兔抗抗體或羊抗抗體。二抗的制備方法:如果所檢測的宿主是大鼠，就用大鼠血清注射兔子，免疫得到兔抗鼠的二抗，注射羊，就得到羊抗鼠的二抗；如果所檢測的宿主是人，就用人血清注射大鼠、兔子或羊，免疫得到鼠抗人抗體、兔抗人抗體或羊抗人抗體。本發(fā)明中酶和二抗還可以是酶結(jié)合物的形式，所述酶結(jié)合物即為用酶標(biāo)記的二抗。本發(fā)明的NTAP抗體檢驗試劑盒還可包括:包被緩沖液、稀釋液、洗滌液、封閉物、顯色液和終止液、陰性對照血清。所述的包被緩沖液，有助于NTAP抗體結(jié)合到固相載體表面，可以選擇PBS (磷酸鹽緩沖液)或CB (碳酸鹽緩沖液)。所述的稀釋液，用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)(例如1% BSA)，通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。稀釋液可以選擇1% BSA-PBS或5% Milk-PBS。稀釋液優(yōu)選1%BSA-PBS。所述的洗滌液，借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。使無關(guān)蛋白脫離固相載體，避免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。洗滌液可以選擇水(蒸餾水或去離子水)或PBS。在孵育或洗滌過程中，已吸附的抗原可能有部份會從固相載體上被洗滌下來，從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會吸附到原來包被抗原凹孔的空白處，增加本底顏色，產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，這是限制ELISA特異性的一個因素。因此可在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護性阻劑來抑制非特異性蛋白的競爭性吸附作用。保護性阻劑可以選自BSA或吐溫-20。所述的封閉物，可以與特異的抗原或抗體非特異性的競爭相應(yīng)的抗體或抗原，防止非特異結(jié)合導(dǎo)致的背景升高，避免假陽性。此外還有保護作用。封閉物可以選擇BSA或脫脂奶粉。所述的顯色液，含有酶或酶結(jié)合物的底物，發(fā)生酶底物反應(yīng)，用于顯色。顯色液根據(jù)所選用的酶確定；如使用辣根過氧化物酶，通常選用TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色液或OPD (鄰苯二胺)顯色液；如使用堿性磷酸酶，通常選用pNPP (對硝基苯磷酸鹽)顯色液。所述的終止液，終止顯色反應(yīng)。終止液根據(jù)所選用的酶及顯色液確定，如使用辣根過氧化物酶，使用TMD或OPD顯色，終止液可以選擇2mol/L硫酸；如使用堿性磷酸酶，pNPP顯色液，終止液可以選擇0.5mol/L碳酸鈉。所述的陰性對照血清，用于在定性試驗中計算Cutoff標(biāo)準(zhǔn)，檢測樣品的OD值高于Cutoff值則為陽性結(jié)果，檢測樣品的OD值低于Cutoff值則為陰性結(jié)果。陰性血清現(xiàn)用現(xiàn)取，與試驗時的陰性對照一致。Cutoff值=N+1.645X SD (N為陰性血清平均OD值，如小于
0.05按0.05計算，SD為陰性血清標(biāo)準(zhǔn)差)。陰性對照血清是不含有NTAP抗體的血清，即未接觸NTAP的動物的血清。針對常規(guī)方法難于制備短肽抗體檢測試劑盒，本發(fā)明提供了一種NTAP抗體檢驗試劑盒，優(yōu)選采用定向交叉偶聯(lián)的方法獲得NTAP抗體檢驗試劑盒。本發(fā)明根據(jù)NTAP作為短肽的特殊要求，采用定向偶聯(lián)KLH后免疫動物，獲得陽性血清，偶聯(lián)后包被的方法獲得操作簡單、靈敏度高的NTAP抗體檢驗試劑盒，實現(xiàn)了血清中NTAP抗體的檢測。其中定向是指在NTAP的C端通過加上半胱氨酸(Cys)的方法使所需偶聯(lián)的載體蛋白定向的(僅在NTAP的C末端)偶聯(lián)到NTAP上，增強NTAP陽性抗體的效價，以及酶標(biāo)板的檢測準(zhǔn)確性。其中交叉是指在陽性抗體制備的免疫階段采用的載體蛋白是一種蛋白，例如KLH(血藍蛋白)，而包被的時候偶聯(lián)的載體蛋白是另一種蛋白，例如BSA，即在抗體產(chǎn)生和酶標(biāo)板包被時分別采用兩種載體蛋白交叉偶聯(lián)的方法，避免抗體檢測出現(xiàn)同種載體蛋白的干擾。同時由于血藍蛋白是存在于海洋動物體內(nèi)的一種蛋白，哺乳動物體內(nèi)沒有，因此在抗體免疫的時候選擇KLH，而在包被的時候選擇BSA。本發(fā)明的ELISA檢測試劑盒的優(yōu)勢為即能滿足NTAP抗體的定性分析，又能滿足NTAP抗體的定量分析，做到簡單、準(zhǔn)確的分析樣本中的NTAP的抗體情況。本發(fā)明中NTAP是指美國專利US2006166890中公開的肽段FKGEQAGAGE。NTAP是一種根據(jù)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗原肽(II型膠原)設(shè)計的變構(gòu)肽。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，即機體對自身抗原(II型膠原)發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織(關(guān)節(jié)軟骨)損害所引起的疾病。NTAP可以競爭性結(jié)合抗原提呈分子，而抑制抗原肽的提呈，達到抑制免疫應(yīng)答，抑制炎癥反應(yīng)，治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的目的。美國專利US2006166890公開了 NTAP的作用機制及用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用，以及固相合成NTAP的方法。本發(fā)明還提供了本發(fā)明試劑盒的制備方法。包被有NTAP的酶標(biāo)板的制備NTAP的C端聯(lián)上半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶聯(lián)相應(yīng)的載體蛋白作為包被抗原，其中載體蛋白為與制備陽性抗體所選用的載體蛋白不同的另一種常規(guī)的載體蛋白，可以選擇牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)，其中優(yōu)選BSA，包被抗原用于制備包被有NTAP的酶標(biāo)板。包被緩沖液選自PBS或CB緩沖液，優(yōu)選CB緩沖液。包被緩沖液的濃度可以是0.5-5ug/ml,優(yōu)選為lug/ml。包被方法可采用常規(guī)的孵育方法,利用蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用實現(xiàn)物理吸附結(jié)合，優(yōu)選4°C過夜孵育。
包被抗原，如偶聯(lián)BSA后的藥物多肽，可以用于包板檢測。陽性抗體的制備偶聯(lián)NTAP或NTAP+Cys至載體蛋白作為免疫原，使用免疫原免疫大鼠，對免疫后的大鼠取血檢測免疫效果，采血純化多克隆抗體，獲得純化抗體。載體蛋白選自與包被NTAP選用的載體蛋白不同的常規(guī)載體蛋白，如KLH、BSA、HSA或OVA，優(yōu)選KLH。使用NTAP+Cys (半胱氨酸)定向偶聯(lián)到KLH，可以獲得比NTAP偶聯(lián)KLH更高的效價。優(yōu)選NTAP+Cys與載體蛋白偶聯(lián)。本發(fā)明的一個實施方式中，純化抗體采用如下方法制備:1.偶聯(lián)1.5mg NTAP+Cys至KLH(血藍蛋白)作為免疫原，用于制備陽性對照血清，NTAP+Cys可以通過常規(guī)的合成方法獲得，偶聯(lián)方法為對乙基-N，N- 二甲基丙基碳二亞胺法；2.使用制備的免疫原KLH-多肽免疫大鼠，共10只，采用AbMax快速程序(28天)；3.在免疫后的第25天取血ELISA法檢測免疫效果，采用大鼠酶標(biāo)二抗檢測；4.ProteinG純化多克隆抗體:采血后，將1#大鼠部分血清進行ProteinG純化，獲得純化抗體，作為實驗用陽性對照原料。本發(fā)明中的酶和二抗的制備，酶和二抗以及酶結(jié)合物(酶標(biāo)二抗)均可采用常規(guī)方法制備或通過商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明中包被緩沖液、稀釋液、洗滌液、封閉物、顯色液和終止液均可采用常規(guī)方法制備或通過商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明中的陰性對照血清取自未經(jīng)NTAP免疫的動物的血清。本發(fā)明試劑盒可采用如下方法使用。在包被多肽藥物的酶聯(lián)板的孔中加入需檢測樣品，同時設(shè)陰性對照、陰性血清孔。用封板膜封板后溫育。棄去各孔內(nèi)液體，洗板，靜置，拍干。每孔加酶結(jié)合物用封板膜封板后溫育60分鐘。棄去各孔內(nèi)液體，洗板，靜置，拍干。每孔加底物顯色液，顯色，每孔加終止液。用酶標(biāo)儀測定各孔OD值。采用本發(fā)明的NTAP抗體檢測試劑盒檢測了 NTAP安全性試驗大鼠血清NTAP抗體的產(chǎn)生情況，在進行的檢測中未發(fā)現(xiàn)安全性試驗大鼠產(chǎn)生NTAP抗體。


圖為純化抗體濃度與OD值曲線
具體實施例方式下述實驗和實施例進一步說明本發(fā)明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實施例1包被多肽藥物(NTAP)的酶標(biāo)板(酶聯(lián)板)的制備:EDC法偶聯(lián)0.5mgNTAP-Cys到BSA.，固相載體選用聚苯乙烯的微量反應(yīng)板凹孔，4°C孵育過夜；考察不同包被緩沖液(表I)及不同包被濃度(表2)對檢測結(jié)果的影響。表1.不同包被緩沖液的影響
權(quán)利要求
1.一種用于NTAP抗體檢測的酶標(biāo)板，包被有NTAP，其中NTAP的C端連接半胱氨酸(Cys)，再在半胱氨酸上連接載體蛋白。
2.—種NTAP抗體檢驗試劑盒，特征在于包括包被NTAP的酶標(biāo)板，純化抗體，酶和二抗。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述包被有NTAP的酶標(biāo)板，其中NTAP的C端連接半胱氨酸(Cys)，再在半胱氨酸上連接載體蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，包被有NTAP的酶標(biāo)板中載體蛋白選自牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血藍蛋白(KLH)等大分子白蛋白。
5.如權(quán)利要求2-4任一所述的試劑盒，其中所述純化抗體為NTAP陽性抗體，是以NTAP的C端偶聯(lián)半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶聯(lián)相應(yīng)的蛋白載體作為免疫原，或用NTAP直接偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原，用免疫原免疫動物獲得。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述純化抗體為NTAP陽性抗體，是以NTAP的C端偶聯(lián)半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶聯(lián)相應(yīng)的蛋白載體作為免疫原，用免疫原免疫動物獲得。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述純化抗體為NTAP陽性抗體，是以NTAP的C端偶聯(lián)半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶聯(lián)血藍蛋白(KLH)作為免疫原，用免疫原免疫動物獲得。
8.如權(quán)利要求2-7任一所述的試劑盒，所述酶和二抗中，所述酶選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶或脲酶。
9.如權(quán)利要求2-7任一所述的試劑盒，還包括包被緩沖液、稀釋液、洗滌液、封閉物、顯色液和終止液、陰性對照血清。
10.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，所述包被緩沖液選自PBS(磷酸鹽緩沖液)或CB (碳酸鹽緩沖液)；所述稀釋液選自I % BSA-PBS或5% Milk-PBS ;所述洗滌液選自水或PBS ;所述封閉物選自BSA或脫脂奶粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短肽抗體ELISA檢驗試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的短肽抗體ELISA檢驗試劑盒包括包被短肽的酶標(biāo)板，純化抗體，酶和二抗。本發(fā)明同時涉及一種采用定向交叉偶聯(lián)技術(shù)制備的短肽抗體試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK103163302SQ20111041452
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月10日
發(fā)明者劉超, 王紅權(quán), 葛蘭, 黃麗晶, 趙婧, 閆少峰, 許曉紅 申請人:石家莊恩澤藥品技術(shù)開發(fā)有限公司