專利名稱：一種短肽的制作方法
一種短肽
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短肽。背景技術(shù)：
McPherron等在研究肌肉萎縮時(shí)發(fā)現(xiàn)了 一種在肌肉生長(zhǎng)過程中起重要作 用的負(fù)調(diào)控因子，研究結(jié)果在Nature雜志上發(fā)表后，作者將這個(gè)因子被命名 為myostatin(肌肉生長(zhǎng)抑制素，MSTN)。該發(fā)現(xiàn)引起了相關(guān)研究人員的極大 興趣，隨后有不少的學(xué)者對(duì)MSTN作用的分子機(jī)制及其與肌肉萎縮有關(guān)的疾 病機(jī)理進(jìn)行了深入的研究。在臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)以及農(nóng)業(yè)上，對(duì)MSTN的 研究也有不少的進(jìn)展。根據(jù)它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，己經(jīng)將MSTN歸類為生長(zhǎng)分化因 子-8 (growth differentiation factor 8, GDF-8)，屬TGF- 0 (轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-P )超家 族中的一成員，在骨骼肌的生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)作用。MSTN是抑制骨 骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的重要細(xì)胞因子，屬于旁分泌或自分泌因子，由骨骼肌細(xì)胞表 達(dá)后分泌出胞外，作用于自身肌細(xì)胞或周圍的骨骼肌細(xì)胞，抑制肌細(xì)胞的生 長(zhǎng)。機(jī)體在正常狀態(tài)下MSTN基因表達(dá)保持很低的水平，使肌肉生長(zhǎng)處在一 個(gè)平衡狀態(tài)。該基因突變或敲除的動(dòng)物，肌肉生長(zhǎng)失去抑制，骨骼肌肌肉群 明顯增加，表現(xiàn)為全身骨骼肌的超常發(fā)達(dá)，如MSTN基因敲除的小鼠，骨骼 肌肌肉增加了2-3倍，而比利時(shí)藍(lán)牛由于MSTN基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致了其 骨骼肌生長(zhǎng)的去抑制，表現(xiàn)為高產(chǎn)肉的優(yōu)良品種。而在一些肌肉萎縮的生物 體內(nèi)，該基因的表達(dá)水平則顯著升高。機(jī)體長(zhǎng)期處于不運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)，也可以 引起MSTN表達(dá)的上調(diào)，導(dǎo)致肌肉的萎縮。許多長(zhǎng)期臥床或營(yíng)養(yǎng)消耗性疾病 的患者，如愛滋病患者等體內(nèi)的MSTN水平都存在不同程度的提高。經(jīng)常處 于體育鍛煉狀態(tài)的人，其體內(nèi)的MSTN水平要比長(zhǎng)期不運(yùn)動(dòng)人體內(nèi)的水平要 低。
MSTN全長(zhǎng)376個(gè)氨基酸，由骨骼肌細(xì)胞表達(dá)后，在第267位氨基酸處 被蛋白酶裂解成兩個(gè)片段，N端部分稱propeptide (肌肉生長(zhǎng)抑制素前肽，
3簡(jiǎn)稱M前肽)，C端片段為MSTN的活性區(qū)域，兩個(gè)C端分子通過二硫鍵形 成一個(gè)二聚體并與M前肽以非共價(jià)的形式結(jié)合，C端結(jié)合M前肽后不表現(xiàn) 出生物學(xué)活性。C片段與M前肽結(jié)合后進(jìn)入到體液中，結(jié)合C片段的M前 肽隨后被金屬蛋白酶在第76位的天門冬氨酸處裂解，此時(shí)C端就表現(xiàn)出抑 制肌肉生長(zhǎng)的生物學(xué)活性。此時(shí)若有大量的M前肽存在就會(huì)持續(xù)抑制C段 的活性。
運(yùn)動(dòng)鍛煉能減低體內(nèi)MSTN的表達(dá)，減少M(fèi)STN對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)的抑制， 繼而間接促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為發(fā)達(dá)的骨骼肌。有實(shí)驗(yàn)證明抑制體內(nèi) MSTN的活性，可促進(jìn)成肌細(xì)胞的分裂和繁殖，如給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)注射M前 肽，使M前肽不斷與C段結(jié)合，就可以抑制MSTN的活性，但是所用的量 比較大。另有研究者采用抗MSTN的抗體以及針對(duì)MSTN的RNAi在體外對(duì) 抑制MSTN的作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性的研究，認(rèn)為二者都有抑制MSTN的活性。 但是抗體屬于異源蛋白，在體內(nèi)使用會(huì)引起變態(tài)反應(yīng)。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞實(shí) 驗(yàn)中，RNAi通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，但是在體內(nèi)就無法通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，雖 然有一些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以將RNAi帶入細(xì)胞，但仍存在安全隱患。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種可以抑制動(dòng)物的MSTN活性，促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)的具 有抵抗"肌肉生長(zhǎng)抑制素"(myostatin, MSTN)活性的短肽。 本發(fā)明所述的短肽，其氨基酸序列為
lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Ala Val lie Arg Gin Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu 或者為-
lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Ala Ala lie Arg Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Ley Arg Glu 或者為
Pro Leu Thr VaJ Asp Phe Glu Val Phe Gly Trp Asp Trp lie lie200910041420.3 Ala Pro Lys Arg Tyr Arg Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
這些短肽具有抵抗'肌肉生長(zhǎng)抑制素，(myostatin， MSTN)活性?？梢杂?br> 于培育多肌肉牲畜。
本發(fā)明短肽采用現(xiàn)有技術(shù)中的公知方法進(jìn)行，既可以用多肽自動(dòng)合成儀 進(jìn)行化學(xué)合成，又可以將短肽序列推導(dǎo)成核苷酸序列，然后克隆到表達(dá)載體 中進(jìn)行生物合成。
本發(fā)明模擬M前肽與C段結(jié)合的模式，合成能與C段結(jié)合的短肽，抑 制動(dòng)物體內(nèi)的MSTN活性，可以促進(jìn)牲畜骨骼肌生長(zhǎng)，用于培育多肌肉牲畜 時(shí)，簡(jiǎn)單、方便、安全、有效。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1制備本發(fā)明短肽
以樹脂作為肽合成的固相基質(zhì)，按照Merrifield發(fā)明的固相化學(xué)合成方 法，依照本發(fā)明短肽的氨基酸序列從C端開始依次進(jìn)行。在合成反應(yīng)柱中進(jìn) 行反應(yīng)液的減壓抽干、洗樹脂等步驟。洗樹脂過程依次分別用異丙醇、二氯 甲烷、二甲基甲酰胺、含6-氫吡啶的二甲基甲酰胺脫保護(hù)溶液反應(yīng)，抽干反 應(yīng)柱。隨后對(duì)樹脂上的合成肽進(jìn)行裂解，裂解液采用三氟乙酸、苯甲醚、乙 二硫醇在避光條件下進(jìn)行，最后溶解在冷乙醚中。冷凍干燥后獲得粗制肽產(chǎn) 品。肽的粗制品用C18反向柱分離純化，分離過程的流動(dòng)相為三氟乙酸以及 乙腈，經(jīng)過梯度洗脫后獲得本發(fā)明的肽純品。
下述實(shí)施例中，所述的短肽1的氨基酸序列為
lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys
Ala Val lie Arg Gin Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu
短肽2的氨基酸序列為
lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Ala Ala lie Arg Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu短肽3的氨基酸序列為-
Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Val Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr Arg Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu
實(shí)施例2短肽促進(jìn)小白鼠骨骼肌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)
普通雄性昆明種小白鼠20只，體重限定在23g士3g。小鼠分為4組，短 肽1組，短肽2組，短肽3組，另設(shè)一組不注射短肽的對(duì)照組。每組5只， 每只小鼠腹腔注射短肽lmg/天，隔天注射一次，共注射15次。最后以'后 肢比目魚肌/小鼠體重，的相對(duì)濕重來比較各組短肽對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)的作用。 相對(duì)濕重的計(jì)算方法為比目魚肌重量(mg)與小鼠自身體重(g)的比值。
結(jié)果，短肽1組的相對(duì)濕重為3.2mg/g±0. 6，短肽2組的相對(duì)濕重為3.5 mg/g±0.3，短肽3組的相對(duì)濕重為3.6mg/g士0.5，對(duì)照組的相對(duì)濕重為2.4 mg/g±0. 5。
結(jié)果顯示本發(fā)明的短肽組的相對(duì)濕重明顯高于對(duì)照組，說明本發(fā)明的短 肽(短肽l、短肽2、短肽3)對(duì)小白鼠具有明顯的促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)作用。
實(shí)施例3短肽促進(jìn)豬骨骼肌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)
一個(gè)月大幼豬12只，分為4組，每組3只。每條短肽1組，另一組為不 注射短肽的對(duì)照組。每只幼豬每次注射短肽10mg，隔天注射一次。30天后 比較各組的三角肌相對(duì)濕重。
結(jié)果，短肽1組、短肽2組、短肽3組的相對(duì)濕重比對(duì)照組豬三角肌的 相對(duì)濕重分別提高了 30%、 19%、 12%。說明本發(fā)明的短肽(短肽1、短肽2、 短肽3 )具有明顯的促進(jìn)豬骨骼肌生長(zhǎng)作用。
實(shí)施例4短肽促進(jìn)牛骨骼肌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)
兩個(gè)月大的小牛8只，分為4組，每組2只。每條短肽1組，另一組為 不注射短肽的對(duì)照組。每只小牛每次注射短肽50mg，隔天注射一次。45天 后比較各組三角肌的相對(duì)濕重，
6結(jié)果，短肽1組、短肽2組、短肽3組的相對(duì)濕重比對(duì)照組小牛三角肌
的相對(duì)濕重分別提高了 25%、 20%、 16%。說明本發(fā)明的短肽(短肽l、短肽 2、短肽3)具有明顯的促進(jìn)小牛骨骼肌生長(zhǎng)作用。
實(shí)施例5短肽促進(jìn)山羊骨骼肌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)
一個(gè)月大的山羊12只，分為4組，每組3只。每條短肽1組，另一組為 不注射短肽的對(duì)照組。每只山羊每次注射短肽10mg，隔天注射一次。45天 后比較各組三角肌的相對(duì)濕重。
結(jié)果，短肽1組、短肽2組、短肽3組的相對(duì)濕重比對(duì)照組山羊三角肌 的相對(duì)濕重分別提高了 28%、 22%、 18%。說明本發(fā)明的短肽(短肽l、短肽 2、短肽3)具有明顯的促進(jìn)山羊骨骼肌生長(zhǎng)作用。序列表
<1 10>廣州羅森生物科技有限公司
<120>—種短肽<160>3<210>1<2">30<212> PRT<213>人工序列
<400>1
lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys15 10 15
Ala Val lie Arg Gin Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu20 25 30
<210>2
<211>30
<212> PRT
<213>人工序列<400>2
lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys15 10 15
Ala Ala lie Arg Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu20 25 30
<210>3<2">30<212> PRT<213>人工序列
<400>3
Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Val Phe Gly Trp Asp Trp lie lie15 10 15
Ala Pro Lys Arg Tyr Arg Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu20 25 30
9
權(quán)利要求
1、一種短肽，其特征在于其氨基酸序列為Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser LysAla Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu。
2、 一種短肽，其特征在于其氨基酸序列為lie Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Ala Ala lie Arg Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu 。
3、 一種短肽，其特征在于其氨基酸序列為Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Val Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr Arg Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 。
4、 如權(quán)利要求1或2或3所述的短肽，其特征在于具有抵抗'肌肉生長(zhǎng)抑制 素'活性。
5、 如權(quán)利要求1或2或3所述的短肽在培育多肌肉牲畜中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種短肽。該短肽的氨基酸序列為Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Ala Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu。本發(fā)明模擬M前肽與C段結(jié)合的模式，合成能與C段結(jié)合的短肽，抑制動(dòng)物體內(nèi)的MSTN活性，可以促進(jìn)牲畜骨骼肌生長(zhǎng)，用于培育多肌肉牲畜時(shí)，簡(jiǎn)單、方便、安全、有效。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101659700SQ200910041420
公開日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者張明杰 申請(qǐng)人:廣州羅森生物科技有限公司