抗衰老短肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域重組蛋白的制備方法，具體是一種新型抗衰老短肽及制備方法。本發(fā)明公開了一種抗衰老短肽命名為G13，由13個氨基酸所組成；同時公開了一種利用大腸桿菌發(fā)酵的工藝，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模的制備重組G13（簡稱rG13）。本發(fā)明利用多種生物學(xué)手段檢測，證實(shí)rG13具有比同類產(chǎn)品更高的生物學(xué)活性，能夠刺激細(xì)胞大量分泌膠原蛋白，具有抗衰老的能力。本發(fā)明所述的抗衰老短肽生物活性顯著，生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，能夠讓抗衰老皮膚營養(yǎng)產(chǎn)品走近百姓的日常生活，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。
【專利說明】抗衰老短肽及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域重組蛋白的設(shè)計(jì)和制備方法，具體是一種新型抗衰老短肽及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]人和高等動物的皮膚由表皮、真皮、皮下組織組成。表皮沒有血管，細(xì)胞的能量和營養(yǎng)必須由真皮微循環(huán)提供。真皮層是皮膚的生命源泉，是一層致密、堅(jiān)韌且有彈性的組織，主要由纖維成分(膠原蛋白纖維、彈力纖維和網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、氨基葡萄糖和玻尿酸等組成。玻尿酸是一種透明的膠狀物質(zhì)，吸水能力可達(dá)500-1000倍，是公認(rèn)的最佳保濕產(chǎn)品。年輕的皮膚，玻尿酸含量高，皮膚光滑、彈性、水嫩、膨脹飽滿；皮膚老化時，真皮層變薄，減少了真皮層與表皮層之間物質(zhì)交換的界面，細(xì)胞的正常代謝和有絲分裂作用受到阻礙，皮膚萎縮產(chǎn)生皺紋，因此抗衰老要從補(bǔ)充真皮層營養(yǎng)物質(zhì)(如膠原蛋白和玻尿酸等)開始。膠原蛋白可以彌補(bǔ)基底膜功能，幫助表皮層與真皮層的結(jié)合，能夠?qū)⑺?、養(yǎng)分保送至真皮層。因此，如果能夠補(bǔ)充人體皮膚中的膠原蛋白，將能夠有效地對抗皮膚衰老的問題。
[0003]棕櫚酸五勝肽-3 (Pentapeptide-3)別名五環(huán)短肽或五勝月肽，它是由法國著名化妝品公司Sederma公司研發(fā)出品的一種人工合成的短肽。它能夠有效促進(jìn)透明質(zhì)酸、膠原蛋白和彈力纖維增生，減少肌膚細(xì)紋，提高肌膚的含水量，增加皮膚厚度，增強(qiáng)肌膚緊致感和光澤度。它是膠原蛋白I (Collagen I)碎片與棕櫚酸(Palmitic Acid)結(jié)合后得到的對皮膚更具親和性和親水、鎖水性的物質(zhì)。研究表明，若將棕櫚酸五勝肽-3加入纖維組織母細(xì)胞培養(yǎng)皿中，能加強(qiáng)膠原蛋白1、VII (纖維膠原)和纖維黏連蛋白的合成能力，還能促進(jìn)表皮內(nèi)的纖維母細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白和玻尿酸等重要成分?？梢姡貦八嵛鍎匐?3對減輕皮膚老化有重要作用。試管內(nèi)測試表明，棕櫚酸五勝肽-3能迅速激活膠原蛋白IV合成能力達(dá)到100%?327%，激活玻尿酸的合成能力達(dá)到267%。如今，該短肽已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多知名品牌的化妝品行列。
[0004]目前，已經(jīng)有很多國家的知名化妝品品牌的許多系列添加了棕櫚酸五肽-3作為抗衰老的營養(yǎng)成分。我國上海和深圳的一些生物科技公司也有該產(chǎn)品銷售。但是，目前棕櫚酸五勝肽-3的制備方法還都是局限于化學(xué)合成，其高額的成本限制了這類產(chǎn)品的廣泛使用。因此，為了能使這類短肽類的皮膚營養(yǎng)產(chǎn)品不斷走近百姓的日常生活，使得普通人擁有安全、穩(wěn)定、實(shí)用的高品質(zhì)化妝品，有必要設(shè)計(jì)研發(fā)更加高效的抗衰老短肽，并探索大規(guī)模制備抗衰老短肽的技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了提高現(xiàn)有抗衰老短肽一棕櫚酸五肽-3的生物學(xué)活性，同時降低這類美容肽的生產(chǎn)成本，提供了一種新型抗衰老短肽的設(shè)計(jì)方案，并提供其大規(guī)模的制備方法。
[0006]本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種抗衰老短肽，由13個氨基酸所組成，其氨基酸序列為:Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，用單字符號表示為 GPKTTKSLEVLFQ。
[0007]上述G13短肽可以通過多種生產(chǎn)工藝進(jìn)行制備:
1、利用大腸桿菌發(fā)酵的工藝，重組表達(dá)制備的G13，簡稱rG13，生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，易于推廣。
[0008]2、利用化學(xué)合成的工藝合成G13，簡稱sG13，成本較高，但是具有與rG13類似的生物學(xué)功能。
[0009]本發(fā)明提供上述的抗衰老短肽的制備方法，包括如下步驟:
(1)、大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建
1.1、設(shè)計(jì) Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser (用單字符號表示為LEVLFQGPKTTKS)氨基酸序列為基本重復(fù)單元L13構(gòu)建蛋白序列pL13_n，其中η為1-100的任意數(shù)值；
1.2、合成如上所示蛋白序列相對應(yīng)的核苷酸序列nL13, (ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc)n ；
1.3、將核苷酸序列nL13克隆進(jìn)入表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株中，篩選得到大腸桿菌基因工程菌；
(2)大腸桿菌基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)
2.1、挑取優(yōu)選后的大腸桿菌基因工程菌單菌落，至于LB培養(yǎng)基中35?38°C培養(yǎng)過夜；
2.2、將菌液接種放大培養(yǎng)，35?38°C培養(yǎng)2.5?3小時，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，15?18°C繼續(xù)培養(yǎng)18?22小時，此時表達(dá)出的蛋白為GST-pL13-n，離心收集菌體；
(3)重組抗衰老短肽rG13的純化
3.1、用Tris緩沖液重懸細(xì)菌，超聲破碎，離心收集上清液；
3.2、利用谷胱甘肽親和柱從上清液中純化得到抗衰老短肽rG13。
[0010]本發(fā)明所述的rG13短肽檢測活性如下:
1、抗衰老短肽rG13理論分子量為1447.65Da,無法通過常規(guī)的SDS-PAGE進(jìn)行檢測，需要利用質(zhì)譜方法進(jìn)行鑒定。用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜儀MALD1-T0FAXIMA-CFR Plus (KRATOS Analytical, Shimadzu corporat1n, Japan)在線性模式下進(jìn)行分析。分析結(jié)果如圖2所示。
[0011]2、細(xì)胞分泌膠原蛋白的過程中，TGF-β會大量表達(dá)。因此，TGF-β表達(dá)量的增高指示著細(xì)胞合成膠原蛋白的增強(qiáng)。以大鼠腱細(xì)胞為模型，加入不同濃度的短肽(0.2μ g/ml, 2 μ g/ml, 20 μ g/ml, 200 μ g/ml), 24小時之后收集大鼠腱細(xì)胞上清，直接轉(zhuǎn)移到TGF-β的檢測試劑盒中進(jìn)行檢測。分析結(jié)果如圖3所示。
[0012]3、利用標(biāo)準(zhǔn)的MTT法檢測抗衰老短肽rG13的細(xì)胞毒性。參考標(biāo)準(zhǔn)mtt法的操作方法，加入不同濃度的短肽(0.2 μ g/ml, 2 μ g/ml, 20 μ g/ml, 200 μ g/ml), 24小時之后檢測細(xì)胞活性。分析結(jié)果如圖4所示。
[0013]4、免疫組化方法檢測抗衰老短肽rG13刺激細(xì)胞合成膠原蛋白的效果。以大鼠腱細(xì)胞為模型，加入短肽(濃度為20 μ g/ml) 24小時之后，4%多聚甲醛固定，3% BSA封閉，然后用兔抗鼠膠原蛋白的抗體(Novotec, Saint Martin La Garenne, France)進(jìn)行標(biāo)記I小時。用熒光顯色，然后鏡下觀察即可。分析結(jié)果如圖5所示。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的抗衰老短肽rG13具有以下特點(diǎn):
1、本發(fā)明所公開的新型抗衰老短肽G13 (GPKTTKSLEVLFQ)，為長期篩選優(yōu)化的序列，比市場上同類產(chǎn)品效果顯著提高。
[0015]2、本發(fā)明所公開的新型抗衰老短肽rG13的制備方法，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，適于大規(guī)模放大，生產(chǎn)成本非常低，而且基因中的序列針對大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，進(jìn)一步提聞了廣量。
[0016]3、本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)過多項(xiàng)活性檢測，具有目前報道過的最優(yōu)化的抗衰老效果，可以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥和化妝品行業(yè)。
[0017]本發(fā)明利用多種生物學(xué)手段檢測，證實(shí)抗衰老短肽rG13具有比同類產(chǎn)品更高的生物學(xué)活性，能夠刺激細(xì)胞大量分泌膠原蛋白，具有抗衰老的能力。
[0018]本發(fā)明所述的抗衰老短肽生物活性顯著,生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，能夠讓抗衰老皮膚營養(yǎng)產(chǎn)品走近百姓的日常生活，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1表示表達(dá)載體pGEX-6p-nL13_9的質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。
[0020]圖2表示提純產(chǎn)物中抗衰老短肽rG13的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。rG13的理論分子量為1447.65Da,與質(zhì)譜檢測結(jié)果完全吻合。
[0021]圖3表示抗衰老短肽rG13刺激TGF-β表達(dá)的能力的檢測結(jié)果。與空白對照組、棕櫚酸五肽-3 (K5)、合成的G13短肽(sG13)相比，重組表達(dá)制備的rG13具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性。
[0022]圖4表示MTT法檢測抗衰老短肽rG13的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，棕櫚酸五肽_3(K5)、本發(fā)明的基因工程表達(dá)的重組短肽rG13、化學(xué)合成的G13短肽(sG13)在所示濃度范圍內(nèi)，均未發(fā)現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性。
[0023]圖5表示免疫組化方法檢測抗衰老短肽rG13刺激細(xì)胞合成膠原蛋白的效果。結(jié)果顯示，rG13可顯著刺激大鼠腱細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，其活性好于棕櫚酸五肽-3 (K5)及化學(xué)合成的G13短肽(sG13)。

【具體實(shí)施方式】
[0024]下面對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0025]一種抗衰老短肽的制備方法，包括如下步驟:
(I)、大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建
1.1、為了酶切之后獲得抗衰老短肽rG13，特別設(shè)計(jì)氨基酸序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 為基本重復(fù)單兀 L13,構(gòu)建蛋白序列 pL13_n。
[0026]這種單元的重復(fù)數(shù)目與最終短肽的收獲量成正比關(guān)系。通常可以采用1-100個重組單元進(jìn)行構(gòu)建，這樣構(gòu)建的目的蛋白序列(LEVLFQGPKTTKS) n簡寫為pL13_n，其中η為1-100的任意數(shù)值；實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)η=9時,抗衰老短肽rG13的得率較高。
[0027]本實(shí)施例以9個重復(fù)單元為例進(jìn)行說明，9個重復(fù)單元的蛋白序列pL13-9為(LEVLFQGPKTTKS)9:
LEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSo
[0028]1.2、合成如上所示蛋白序列相對應(yīng)的核苷酸序列nL13，并按照大腸桿菌有利的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，獲得核苷酸序列nL13-9如SEQ ID N0.1所示:
ctggaggtgctgttccagggcccgaaaaccacaaagagcctggaggtgctgttccaaggtccgaagaccacc
aagagcctggaggtgctgttccaaggcccgaaaaccaccaaaagcctggaggtgctgttccaaggcccgaagaccac
caagagcctggaagtgctgtttcagggtccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccagggccctaaaacca
ccaagagcctggaggttctgtttcagggcccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccaaggcccgaagacc
accaagagcctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagco
[0029]1.3、將核苷酸序列nL13克隆進(jìn)入表達(dá)載體,然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株中，篩選得到大腸桿菌基因工程菌；具體為:
設(shè)計(jì)引物Pl和P2，
Pl:CGACGGCCAGTGAATTCAGA,
P2:CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC,
將引物稀釋成50ρπιΟ1/μ 1，引物和核苷酸序列進(jìn)行PCR步驟，瓊脂糖凝膠電泳檢測nL13-9條帶位于350bp左右，回收目的基因。用3m I和通ο I將基因(上述核苷酸序列)酶切成粘性末端，同樣處理pGEX-6p-l載體，加入T4 DNA連接酶，4°C連接12小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，用于質(zhì)粒的擴(kuò)增；用氨芐青霉素-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，利用酶切和PCR的方法鑒定正確，然后核苷酸序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，成功構(gòu)建pGEX-6p-nL13-9表達(dá)載體^fpGEX-6p-nL13-9表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21菌(篩選得到大腸桿菌基因工程菌)，用于表達(dá)蛋白。
[0030](2)大腸桿菌基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)
2.1、挑取優(yōu)選后的大腸桿菌基因工程菌單菌落，至于5ml的LB培養(yǎng)基中35?38°C培養(yǎng)過夜，優(yōu)選溫度為37°C。
[0031]2.2、將菌液按照1:100接種放大培養(yǎng)，35?38°C培養(yǎng)2.5?3小時，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，15?18°C繼續(xù)培養(yǎng)18?22小時，優(yōu)選為37°C培養(yǎng)3小時，加入0.5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，16°C繼續(xù)培養(yǎng)20小時；此時表達(dá)出的蛋白為GST-pL13-9，離心收集菌體。
[0032](3)重組抗衰老短肽rG13的純化
3.1、用PBS緩沖液洗滌混合后的菌體沉淀，用Tris緩沖液20_40ml體積重懸約500ml菌液沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100幫助裂解細(xì)菌，在冰水混合物環(huán)境下超聲破菌(2s超聲，5s間歇,全長45min,保護(hù)溫度44°C ), 12000rpm/min離心20min,收集上清液,此時溶液中即含有大量的GST-pL13-9重組蛋白。
[0033]3.2、用PBS緩沖液清洗谷胱甘肽親和柱(Glutath1ne Sepharose beads),然后將柱材和破菌上清混合共育，室溫或冰上輕搖30min，然后上柱，用含有IM NaCl的PBS溶液洗滌雜蛋白，柱上就剩下了純的GST-pL13-9重組蛋白。
[0034]在柱上加入適量的Presciss1n Protease (簡稱PPase)蛋白酶,于室溫或冰上輕搖2小時，即可將抗衰老短肽rG13從谷胱甘肽親和柱上釋放出來，用PBS溶液洗脫抗衰老短肽rG13，所得產(chǎn)物透析過夜，凍干為干粉待用。
[0035]上述方法制備的抗衰老短肽rG13由13個氨基酸所組成，其氨基酸序列為=Gly-Pro-Lys-Thr-Thr- Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln,用單字符號表不為GPKTTKSLEVLFQ。利用大腸桿菌發(fā)酵的工藝，重組表達(dá)制備的rG13，生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，易于推廣。該rG13被發(fā)現(xiàn)具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞合成膠原蛋白的能力，與現(xiàn)有同類短肽相比，效果更強(qiáng)。
【權(quán)利要求】
1.一種抗衰老短肽，其氨基酸序列為=Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln0
2.一種制備權(quán)利要求1所述的抗衰老短肽的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)、大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建 1.1、設(shè)計(jì) Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 氨基酸序列為基本重復(fù)單元L13構(gòu)建蛋白序列pL13-n，其中η為1-100的任意數(shù)值； 1.2、合成如上所示蛋白序列相對應(yīng)的核苷酸序列nL13, (ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc)n ； 1.3、將核苷酸序列nL13克隆進(jìn)入表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株中，篩選得到大腸桿菌基因工程菌； (2)大腸桿菌基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng) 2.1、挑取優(yōu)選后的大腸桿菌基因工程菌單菌落，至于LB培養(yǎng)基中35?38°C培養(yǎng)過夜； 2.2、將菌液接種放大培養(yǎng)，35?38°C培養(yǎng)2.5?3小時，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，15?18°C繼續(xù)培養(yǎng)18?22小時，此時表達(dá)出的蛋白為GST-pL13-n，離心收集菌體； (3)重組抗衰老短肽rG13的純化 3.1、用Tris緩沖液重懸細(xì)菌，超聲破碎，離心收集上清液； 3.2、利用谷胱甘肽親和柱從上清液中純化得到抗衰老短肽rG13。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗衰老短肽的制備方法，其特征在于:步驟1.1和1.2中，n=9。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗衰老短肽的制備方法，其特征在于:步驟1.3具體為，設(shè)計(jì)引物Pl和P2，
Pl:CGACGGCCAGTGAATTCAGA,
P2: CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC, 將引物和核苷酸序列進(jìn)行PCR步驟，回收目的基因，用I和通ο I將核苷酸序列酶切成粘性末端，同樣處理pGEX-6p-l載體，加入T4 DNA連接酶，4°C連接12小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α ;用氨芐青霉素-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的堿裂解法或者煮沸法提取質(zhì)粒，利用酶切和PCR的方法鑒定正確，然后核苷酸序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，成功構(gòu)建pGEX-6p-nL13-9表達(dá)載體；將pGEX-6p-nL13_9表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗衰老短肽的制備方法，其特征在于:步驟2.2具體為，將菌液按照1: 100接種放大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)3小時，加入0.5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，16°C繼續(xù)培養(yǎng)20小時,離心收集菌體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗衰老短肽的制備方法，其特征在于:步驟3.1具體為，用PBS緩沖液洗滌混合后的菌體沉淀，用Tris緩沖液重懸菌液沉淀，用溶菌酶配合TritonX-100幫助裂解細(xì)菌，在冰水混合物環(huán)境下超聲破菌，12000rpm/min離心20min，收集上清液，此時溶液中即含有大量的GST-pL13-9重組蛋白； 步驟3.2具體為，用PBS緩沖液清洗谷胱甘肽親和柱，然后將柱材和破菌上清混合共育，室溫或冰上輕搖30min,然后上柱,用含有IM NaCl的PBS溶液洗漆雜蛋白，柱上就剩下了純的GST-pL13_9重組蛋白；在柱上加入Presciss1n Protease蛋白酶,于室溫或冰上輕 搖2小時，即可將抗衰老短肽rG13從谷胱甘肽親和柱上釋放出來。
【文檔編號】A61P17/16GK104402975SQ201410755706
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】楊霞 申請人:太原錦波生物醫(yī)藥科技有限公司