專利名稱：小分子有機物的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小分子有機物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的量子點標(biāo)記抗體均相免疫分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
環(huán)境和農(nóng)畜產(chǎn)品中農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的殘留超標(biāo)，對環(huán)境和環(huán)境生物構(gòu)成一定威脅，影響食品安全和人類健康。加強環(huán)境和食品安全監(jiān)控，需要高效快速的分析技術(shù)。目前已報道的農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留的檢測方法主要有色譜法和色質(zhì)聯(lián)用法。采用這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)化的實驗室和訓(xùn)練有素的專門人才， 樣品前處理要求高、過程復(fù)雜、速度慢，檢測成本高，特異性不強，難以適應(yīng)大量樣品和現(xiàn)場快速檢測的要求。現(xiàn)有小分子有機物的免疫分析，通常采用聚苯乙烯微孔板作固相載體固定抗體或抗原，在固相和液相界面進(jìn)行競爭性免疫反應(yīng)，反應(yīng)速度慢，需要通過洗滌方式將固、液兩相分離。其中酶聯(lián)免疫吸附分析需要加入酶的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)后檢測，步驟較多且時間較長；放射性同位素標(biāo)記免疫分析方法趨向于淘汰；以有機熒光分子作標(biāo)記物的熒光免疫分析存在穩(wěn)定性差、易發(fā)生光漂白等問題，與化學(xué)發(fā)光免疫分析類似，經(jīng)典的熒光免疫分析容易受背景的干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以高效水溶性量子點作為納米熒光探針標(biāo)記抗目標(biāo)分析小分子有機物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)抗體，建立一種特異性強、靈敏度高、簡便高效、用于目標(biāo)分析小分子有機物快速檢測的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析新技術(shù)。本發(fā)明的原理和技術(shù)方案是以激發(fā)波長寬、發(fā)射波長窄、熒光量子效率高、穩(wěn)定性好的水溶性量子點作為納米熒光探針，采用碳二亞胺法與抗目標(biāo)分析農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物抗體共價偶聯(lián)制備量子點標(biāo)記抗體；將適量量子點標(biāo)記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋成適當(dāng)濃度，加入含對應(yīng)目標(biāo)分析物的標(biāo)樣，與量子點標(biāo)記抗體發(fā)生均相免疫反應(yīng)，降低了量子點標(biāo)記抗體的熒光強度(量子點標(biāo)記抗體發(fā)生熒光淬滅)，同樣條件下以待測樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對照反應(yīng)體系；免疫反應(yīng)平衡后，分別檢測空白對照體系的熒光強度Ftl和含對應(yīng)目標(biāo)分析物體系的熒光強度F，依據(jù)空白對照體系的熒光強度Ftl與標(biāo)樣體系的熒光強度的比值FcZF的大小(即量子點標(biāo)記抗體的熒光淬滅程度)與體系中對應(yīng)目標(biāo)分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)待測樣品的FcZF和所述免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品中目標(biāo)分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測目標(biāo)分析小分子有機物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析方法。本發(fā)明綜合利用免疫分析特異性強、量子點熒光性能優(yōu)異、均相免疫反應(yīng)速度快、 平衡時間短、可直接進(jìn)行熒光檢測等優(yōu)勢。與常規(guī)免疫分析技術(shù)相比，本發(fā)明所建立的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析方法不僅特異性強、靈敏度高、重現(xiàn)性好，而且更加簡便高效，不需要進(jìn)行固液分和顯色反應(yīng)，檢測時間約為常規(guī)免疫分析的1/4，是對現(xiàn)有小分子有機物免疫分析技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新，迄今尚未見同類報道，在環(huán)境和食品中農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物等小分子有機物快速檢測方面具有很高的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1為不同濃度氯氰菊酯與量子點標(biāo)記抗氯氰菊酯抗體熒光強度變化的關(guān)系曲線。圖2為不同濃度氯霉素與量子點標(biāo)記抗氯霉素抗體熒光強度變化的關(guān)系曲線。圖3為不同濃度雙酚A與量子點標(biāo)記抗雙酚A抗體熒光強度變化的關(guān)系曲線。
具體實施例方式一、量子點標(biāo)記抗氯氰菊酯抗體非競爭均相免疫分析技術(shù)實施例
采用水溶性碳二亞胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，將表面修飾有活性羧基的核殼結(jié)構(gòu)(CdSe/SiS)熒光發(fā)射波長為625nmd 的高效水溶性量子點與對氯氰菊酯具特異性親和力的抗體共價偶聯(lián)，制備量子點標(biāo)記抗氯氰菊酯抗體，經(jīng)透過分子量為5000的超濾離心管超濾純化后用含0. 5g/L疊氮化鈉和1M/L 甜菜堿、PH8. 3的硼酸鹽緩沖液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存?zhèn)溆?，臨用前用0. 02mol/L、 pH7. 2 PBS 稀釋 400 倍。用0. 02mol/L、pH7. 2 PBS稀釋lmg/mL氯氰菊酯標(biāo)樣的甲醇溶液，配置l(TlO_Vg/ mL氯氰菊酯標(biāo)樣系列，分別與所述量子點標(biāo)記抗氯氰菊酯抗體稀釋液等體積混合，在室溫下反應(yīng)10 15min，同樣條件下分別以待測樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對照反應(yīng)體系。反應(yīng)平衡后，在235nm的激發(fā)波長下分別檢測空白對照體系在625nm附近的最大熒光強度(Ftl)和含氯氰菊酯的體系相同波長的熒光強度(F)。優(yōu)化反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)物濃度比、反應(yīng)溫度和時間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關(guān)條件，選擇量子點標(biāo)記抗氯氰菊酯抗體與氯氰菊酯免疫反應(yīng)速度快、敏感性強、穩(wěn)定性好、 量子點標(biāo)記抗體用量少、空白對照體系熒光強度(Ftl)與含氯氰菊酯體系的熒光強度(F)比值(Ftl/ F)高、背景干擾少的條件組合。在上述基礎(chǔ)上，依據(jù)空白對照體系熒光強度(Ftl)與含氯氰菊酯體系的熒光強度 (F)的比值(量子點標(biāo)記抗體的熒光淬滅程度)與體系中氯氰菊酯濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，建立氯氰菊酯的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。根據(jù)樣品的Ftl/ F和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中氯氰菊酯的含量，對待測樣品中的氯氰菊酯進(jìn)行定性定量快速檢測，從而建立高靈敏度快速檢測氯氰菊酯的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析技術(shù)。二、量子點標(biāo)記抗氯霉素抗體非競爭均相免疫分析技術(shù)實施例
采用水溶性碳二亞胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，將表面修飾有活性羧基的核殼結(jié)構(gòu)(CdSe/SiS)熒光發(fā)射波長為625nmd 的高效水溶性量子點與對氯霉素具特異性親和力的抗體共價偶聯(lián)，制備量子點標(biāo)記抗氯霉素抗體，經(jīng)透過分子量為5000的超濾離心管超濾純化后用含0. 5g/L疊氮化鈉和1M/L甜菜堿、PH8. 3的硼酸鹽緩沖液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存?zhèn)溆茫R用前用0. 02mol/L、pH6. 8 PBS稀釋400倍。用0. 02mol/L、pH6. 8 PBS稀釋lmg/mL氯霉素標(biāo)樣的甲醇溶液，配置廣10_Vg/mL 氯霉素標(biāo)樣系列，分別與所述量子點標(biāo)記抗氯霉素抗體稀釋液等體積混合，在室溫下反應(yīng) 10 15min，同樣條件下分別以待測樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對照反應(yīng)體系；
反應(yīng)平衡后，在235nm的激發(fā)波長下分別檢測空白對照體系625nm附近的熒光強度 (F0)和含氯霉素的體系相同波長的熒光強度(F)。優(yōu)化反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)物濃度比、反應(yīng)溫度和時間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關(guān)條件，選擇量子點標(biāo)記抗氯霉素抗體與氯霉素免疫反應(yīng)速度快、敏感性強、穩(wěn)定性好、量子點標(biāo)記抗體用量少、空白對照體系熒光強度(Ftl)與含氯霉素體系的熒光強度(F)比值(Ftl/ F)高、背景干擾少的條件組合。在上述基礎(chǔ)上，依據(jù)空白對照體系熒光強度(Ftl)與含氯霉素體系的熒光強度(F) 的比值(量子點標(biāo)記抗體的熒光淬滅程度)與體系中氯霉素濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，建立氯霉素的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)。根據(jù)樣品的Ftl/ F和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中氯霉素的含量，對待測樣品中的氯霉素進(jìn)行定性定量快速檢測， 從而建立高靈敏度快速檢測氯霉素的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析技術(shù)。三、量子點標(biāo)記抗雙酚A抗體非競爭免疫分析技術(shù)實施例
采用水溶性碳二亞胺(EDO法(Greg Τ. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2ed 2008，p495-496)，將表面修飾有活性羧基的核殼結(jié)構(gòu)(CdSe/SiS)熒光發(fā)射波長為655nm 的高效水溶性量子點與對雙酚A具特異性親和力的抗體共價偶聯(lián)，制備量子點標(biāo)記抗雙酚 A抗體，經(jīng)透過分子量為5000的超濾離心管超濾純化后用含0. 5g/L疊氮化鈉和1M/L甜菜堿、PH8. 3的硼酸鹽緩沖液溶解定容至1 μ moL/L，4°C保存?zhèn)溆茫R用前用0. 02mol/L、pH7. 0 PBS稀釋400倍。用0. 02mol/L、ρΗ7· 0 PBS稀釋lmg/mL雙酚A標(biāo)樣的甲醇溶液，配置1 IO-Vg/ mL雙酚A標(biāo)樣系列，分別與所述量子點標(biāo)記抗雙酚A抗體稀釋液等體積混合，在室溫下反應(yīng)10 15min，同樣條件下分別以待測樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對照反應(yīng)體系。反應(yīng)平衡后，在235nm的激發(fā)波長下分別檢測空白對照體系655nm附近的最大熒光強度(Ftl)和含雙酚A的體系相同波長的熒光強度(F)。優(yōu)化反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)物濃度比、反應(yīng)溫度和時間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關(guān)條件，選擇量子點標(biāo)記抗雙酚A抗體與雙酚A免疫反應(yīng)速度快、敏感性強、穩(wěn)定性好、量子點標(biāo)記抗體用量少、空白對照體系熒光強度(Ftl)與含雙酚A體系的熒光強度(F)比值(Ftl/ F) 高、背景干擾少的條件組合。在上述基礎(chǔ)上，依據(jù)空白對照體系熒光強度(Ftl)與含雙酚A體系的熒光強度(F) 的比值(量子點標(biāo)記抗體的熒光淬滅程度)與體系中雙酚A濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，建立雙酚A的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。根據(jù)樣品的Ftl/ F和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中雙酚A的含量，對待測樣品中的雙酚A進(jìn)行定性定量快速檢測，從而建立高靈敏度快速檢測雙酚A的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析技術(shù)。
權(quán)利要求
1.小分子有機物的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析方法，其特征在于采用混合酸酐法或碳二亞胺法，將激發(fā)波長寬、熒光發(fā)射波長窄、穩(wěn)定性好、表面具有活性氨基的核殼結(jié)構(gòu)高效水溶性量子點與抗目標(biāo)分析小分子有機物抗體共價偶聯(lián)制備量子點標(biāo)記抗體； 將量子點標(biāo)記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋成適當(dāng)濃度，加入含對應(yīng)目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)樣品混勻，進(jìn)行均相免疫反應(yīng)，同樣條件下以待測樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對照反應(yīng)體系；反應(yīng)平衡后分別檢測空白對照體系的熒光強度Ftl和含對應(yīng)目標(biāo)分析物體系的熒光強度F，依據(jù)空白對照體系的熒光強度Ftl與標(biāo)樣體系的熒光強度的比值FcZF的大小與體系中目標(biāo)分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比的規(guī)律，在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)待測樣品的FcZF和所述免疫分析標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品中目標(biāo)分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測目標(biāo)分析小分子有機物的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析方法。
全文摘要
小分子有機物的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析方法，涉及用于小分子有機物高靈敏度快速檢測的納米熒光探針標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析技術(shù)。以高效水溶性量子點標(biāo)記抗目標(biāo)分析小分子有機物抗體，將量子點標(biāo)記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋后加入含對應(yīng)目標(biāo)分析小分子有機物的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行均相免疫反應(yīng)，同樣條件下以待測樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對照反應(yīng)體系；將反應(yīng)平衡后的標(biāo)樣、樣品及空白對照體系直接進(jìn)行熒光檢測，依據(jù)空白對照體系和標(biāo)樣體系熒光強度的比值大小與體系中對應(yīng)目標(biāo)分析物的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比的原理和規(guī)律，建立高靈敏度快速檢測目標(biāo)分析小分子有機物的量子點標(biāo)記抗體非競爭均相免疫分析技術(shù)。
文檔編號G01N21/64GK102495210SQ20111039938
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者馮大和, 劉曙照, 劉騰飛 申請人:揚州大學(xué)