一種Cd體材量子點分子信標及其制備方法
【專利摘要】一種Cd體材量子點分子信標，包括核酸莖環(huán)結構，與核酸莖環(huán)結構5’端連接的熒光基團和與核酸莖環(huán)結構3’端連接的淬滅基團；其制備步驟如下：在半導體量子點的DMF溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺連接劑，反應液中加入核酸，孵育之后加入淬滅劑，超濾后即可制得目標物并低溫保存。本發(fā)明的優(yōu)點是：選用Cd體材量子點和4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸作為信標中熒光共振能量轉移的供體和受體，當自由態(tài)時，熒光被淬滅，一旦與靶細胞結合，熒光隨即恢復，靈敏度高，特異性強，可廣泛應用于生物學領域。
【專利說明】一種Cd體材量子點分子信標及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術中的分子熒光分析領域，具體涉及一種Cd體材量子點分子?目標及其制備方法。

【背景技術】
[0002]分子信標是一種由“莖-環(huán)”組成的寡核苷酸分子，“莖”部分為互補序列，“環(huán)”部分為探測序列，核酸一端連接有熒光基團，另一端連接淬滅基團。通過兩個基團之間發(fā)生熒光能量共振轉移(FRET)，實現(xiàn)檢測目標核酸的目的。
[0003]DNA分子信標就是一種典型的基于FRET原理構建而成檢測DNA或RNA的熒光探針:分子信標在自由狀態(tài)時，信標兩端的熒光和淬滅基團相互靠近(7-10nm)發(fā)生熒光共振能量轉移，使得熒光基團所發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收同時以熱輻射形式向外擴散，熒光幾乎完全被淬滅；當分子信標與之序列完全互補的靶標分子通過互補結合形成雙鏈雜交體時，熒光基團和淬滅基團的距離增大，熒光幾乎都恢復，產生強烈熒光。
[0004]目前，分子信標在生物學領域有廣泛的應用?？赏ㄟ^分子信標探針進行基因變異的快速檢測，從而研究疾病機理及一些相應的治療措施。分子信標還可用于活細胞中RNA的檢測，蛋白質檢測，用作生物芯片和生物傳感器的探針等。
[0005]中國專利201210224174.7，公開了一種用于血小板衍生生長因子檢測的核酸適配子分子信標探針，該核酸適配子分子信標探針包括F1DGF-BB核酸適配子，與F1DGF-BB核酸適配子5’端連接的熒光基團和與TOGF-BB核酸適配子3’端連接的淬滅基團。
[0006]本發(fā)明以Cd體材量子點作為熒光基團，以4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(Dabcyl)作為淬滅基團，探索一種靈敏度高、特異性強的制備分子信標的新方法。


【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對上述技術分析，提供一種Cd體材量子點分子信標及其制備方法，該分子信標以Cd體材量子點作為熒光基團，以4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(Dabcyl)作為淬滅基團，靈敏度高、特異性強且制備方法簡單，可廣泛應用于生物學領域。
[0008]本發(fā)明的技術方案:
一種Cd體材量子點分子信標，由核酸莖環(huán)、熒光基團和淬滅基團組成,核酸莖環(huán)的序列為5’ -RtRaCCRtRRtttctRtRtRRtRtcaC-3 ’，其中畫線部分為該核酸鏈中能形成環(huán)狀結構的序列，熒光基團與核酸莖環(huán)序列中5’端連接，淬滅基團與核酸莖環(huán)結構3’端連接，所述熒光基團為Cd體材量子點，所述淬滅基團為4- 二甲胺偶氮苯-4-羧酸(Dabcyl )。
[0009]所述Cd 體材量子點為 TGA-CdSe、TGA-( CdSe-ZnS )、TGA-ZnS、TGA-CdTe 或 TGA-CdS。
[0010]一種所述Cd體材量子點分子信標的制備方法，步驟如下:
1)將濃度為l-10mmol/L的Cd體材量子點水溶液凍干，然后將凍干的粉末溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到Cd體材量子點的DMF溶液；
2)在Cd體材量子點的DMF溶液中加入連接劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液，在室溫下溫和震蕩5-12h,然后加入核酸鏈5’ (HS)-gtgaccgtj^tttctgtgtj^tgtcac-3，的水溶液，室溫下孵育l_5h得到孵育液；
3)在上述孵育液中加入淬滅劑4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(Dabcyl)的DMF溶液，室溫下反應5-12h,得到混合液；
4)用超濾離心管將上述混合液中未反應的連接劑、量子點和核酸鏈去除，得到Cd體材-Dabcyl分子信標并在4°C下避光保存。
[0011]所述Cd體材量子點的DMF溶液的濃度為1-lOmmol/L，連接劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的 DMF 溶液的濃度為 10-100mmol/L,核酸鏈 5’ (HS)-gtgaccgtggtttctgtgtggtgtcac-3’的水溶液的濃度為0.lmmol/L，淬滅劑4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(Dabcyl)的DMF溶液的濃度為lmg/mL。
[0012]所述Cd體材量子點的DMF溶液、連接劑的DMF溶液、核酸鏈的水溶液、淬滅劑的DMF 溶液的體積比為 1-5:1-5:0.01-0.1:0.2-1。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點是:選用Cd體材量子點和4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸作為信標中熒光共振能量轉移的供體和受體，當自由態(tài)時，熒光被淬滅，一旦與靶細胞結合，熒光隨即恢復，靈敏度高，特異性強，可廣泛應用于生物學領域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為Cd體材-Dabcyl分子信標的分子結構圖。
[0015]圖2為Cd體材-Dabcyl分子信標的反應過程示意圖。
[0016]圖3為實施例1制備的分子信標的熒光發(fā)射光譜。
[0017]圖4為實施例2制備的分子信標的熒光發(fā)射光譜。
具體實施方案
[0018]實施例1:
一種Cd體材量子點分子信標，如圖1所示，由核酸莖環(huán)、熒光基團和淬滅基團組成，核酸莖環(huán)的序列為5’ -RtRaCCRtRRtttctRtRtRRtRtcaC-3 ’，其中畫線部分為該核酸鏈中能形成環(huán)狀結構的序列，熒光基團與核酸莖環(huán)序列中5’端連接，淬滅基團與核酸莖環(huán)結構3’端連接，所述熒光基團為TGA-CdSe量子點，所述淬滅基團為4-二甲胺偶氮苯_4_羧酸(Dabcyl)。
[0019]所述Cd體材量子點分子信標的制備方法，步驟如下:
1)將濃度為2.5mmol/L的TGA-CdSe量子點水溶液凍干，然后將凍干的粉末溶于N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，得到TGA-CdSe量子點的DMF溶液，TGA-CdSe量子點的DMF溶液的濃度為2.5mmol/L ；
2)在10uL濃度為2.5mmoI/LTGA-CdSe量子點的DMF溶液中加入10uL濃度為25mmol/L 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液，在室溫下溫和震蕩12h，然后加入2uL濃度為 0.lmmol/L 的 5’ -端巰基修飾后的核酸鏈 5’ (HS)-RtRaccRtRRtttctRtRtRRtRtcac-3?水溶液，室溫下孵育2h得到孵育液；
3)在上述孵育液中加入20uL濃度為lmg/mL的4-二甲胺偶氮苯_4_羧酸(Dabcyl)的DMF溶液，室溫下反應12h，得到混合液； 4)用0.5ML、10kD的超濾離心管將上述混合液中未反應的連接劑、量子點和核酸鏈去除，得到CdSe-Dabcyl分子信標并在4°C下避光保存。
[0020]圖2為CdSe-Dabcyl分子信標的反應過程示意圖。
[0021]圖3為制備的分子信標的熒光發(fā)射光譜，圖中表明=CdSe量子點的熒光發(fā)射峰為526nm;分子信標處于游離態(tài)時，量子點與淬滅劑之間足夠接近，存在熒光共振能量轉移現(xiàn)象，量子點的熒光相對強度下降；當加入靶序列時，分子信標的環(huán)序列與靶序列特異性結合，熒光分子與淬滅分子分開，熒光信號上升。
[0022]實施例2:
一種Cd體材量子點分子信標，如圖1所示，由核酸莖環(huán)、熒光基團和淬滅基團組成，核酸莖環(huán)的序列為5’ -RtRaCCRtRRtttctRtRtRRtRtcaC-3 ’，其中畫線部分為該核酸鏈中能形成環(huán)狀結構的序列，熒光基團與核酸莖環(huán)序列中5’端連接，淬滅基團與核酸莖環(huán)結構3’端連接，所述熒光基團為TGA- (CdSe-ZnS)量子點，所述淬滅基團為4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(Dabcyl)。
[0023]所述Cd體材量子點分子信標的制備方法，步驟如下:
1)將濃度為2.5mmol/L的TGA- (CdSe-ZnS)量子點水溶液凍干，然后將凍干的粉末溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到Cd體材量子點的DMF溶液，TGA- (CdSe-ZnS)量子點的DMF溶液的濃度為8.0mmol/L ；
2)在10uL濃度為8.0mmol/L TGA- (CdSe-ZnS)量子點的DMF溶液中加入10uL濃度為25mmol/L 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液，在室溫下溫和震蕩12h，然后加入5uL濃度為 0.lmmol/L 的 5’ -端巰基修飾后的核酸鏈 5’ (HS)-RtRaccRtRRtttctRtRtRRtRtcac-3’水溶液，室溫下孵育2h得到孵育液；
3)在上述孵育液中加入50uL濃度為lmg/mL的4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(Dabcyl)的DMF溶液，室溫下反應12h，得到混合液；
4)用0.5ML、10kD的超濾離心管將上述混合液中未反應的連接劑、量子點和核酸鏈去除，得到(CdSe-ZnS) -Dabcyl分子信標并在4?下避光保存。
[0024]圖4為實施例2制備的分子信標的熒光發(fā)射光譜，圖中表明=CdSe-ZnS量子點的突光發(fā)射峰為453nm和552nm ;分子信標處于游尚態(tài)時，量子點與淬滅劑之間足夠接近，存在熒光共振能量轉移現(xiàn)象，量子點的熒光相對強度下降；當有靶序列存在時，分子信標的環(huán)序列與靶序列特異性結合，熒光分子與淬滅分子分開，熒光信號上升。
【權利要求】
1.一種Cd體材量子點分子信標，其特征在于:由核酸莖環(huán)、熒光基團和淬滅基團組成，核酸莖環(huán)的序列為5’ -RtRaCCRtRRtttctRtRtRRtRtcaC-3 ’，其中畫線部分為該核酸鏈中能形成環(huán)狀結構的序列，熒光基團與核酸莖環(huán)序列中5’端連接，淬滅基團與核酸莖環(huán)結構3’端連接，所述熒光基團為Cd體材量子點，所述淬滅基團為4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(Dabcyl)。
2.根據權利要求1所述Cd體材量子點分子信標，其特征在于:所述Cd體材量子點為TGA-CdSe、TGA- (CdSe-ZnS), TGA-ZnS、TGA-CdTe 或 TGA-CdS。
3.—種如權利要求1所述Cd體材量子點分子信標的制備方法，其特征在于步驟如下: 1)將濃度為l-10mmol/L的Cd體材量子點水溶液凍干，然后將凍干的粉末溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到Cd體材量子點的DMF溶液； 2)在Cd體材量子點的DMF溶液中加入連接劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液，在室溫下溫和震蕩5_12h,然后加入核酸鏈5’ (HS)-gtgaccgtj^tttctgtgtj^tgtcac-3，的水溶液，室溫下孵育l_5h得到孵育液； 3)在上述孵育液中加入淬滅劑4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(Dabcyl)的DMF溶液，室溫下反應5-12h,得到混合液； 4)用超濾離心管將上述混合液中未反應的連接劑、量子點和核酸鏈去除，得到Cd體材-Dabcyl分子信標并在4°C下避光保存。
4.根據權利要求3所述Cd體材量子點分子信標的制備方法，其特征在于:所述Cd體材量子點的DMF溶液的濃度為1-lOmmol/L，連接劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的DMF溶液的濃度為 10-100mmol/L,核酸鏈 5’ (HS) -gtgaccgtggtttctgtgtggtgtcac-3’ 的水溶液的濃度為0.lmmol/L,淬滅劑4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(Dabcyl)的DMF溶液的濃度為lmg/mL。
5.根據權利要求3所述Cd體材量子點分子信標的制備方法，其特征在于:所述Cd體材量子點的DMF溶液、連接劑的DMF溶液、核酸鏈的水溶液、淬滅劑的DMF溶液的體積比為1-5:1-5:0.01-0.1:0.2-1。
【文檔編號】C12N15/11GK104313148SQ201410558493
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月19日 優(yōu)先權日:2014年10月19日
【發(fā)明者】應明, 沈林燕, 邵屾 申請人:天津理工大學