專利名稱：小分子有機物的量子點標記半抗原多組分直接競爭免疫分析方法
技術領域：
本發(fā)明涉及不同小分子有機物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的納米熒光探針標記多組分直接競爭免疫分析新技術。
背景技術：
環(huán)境和農(nóng)畜產(chǎn)品中農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物多殘留超標，對環(huán)境和環(huán)境生物構成一定威脅，影響食品安全和人類健康。加強環(huán)境和食品中多種殘留物的監(jiān)控，需要高效快速的多組分分析技術。
目前已報道的農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物多殘留檢測方法主要有色譜法和色質聯(lián)用法，采用這些方法需要昂貴的儀器設備、專業(yè)化的實驗室和訓練有素的專門人才，樣品前處理要求高、過程復雜、速度慢，檢測成本高，特異性不強，難以適應大量樣品和現(xiàn)場快速檢測的要求。現(xiàn)有小分子有機物多組分免疫分析，通常采用在聚苯乙烯微孔板的不同部位固定不同抗體或抗原，通過空間分辨進行不同免疫反應，反應在固相和液相界面進行，反應后通過洗滌方式實現(xiàn)固液分離，操作復雜；或采用不同標記物，如酶、熒光素等標記不同抗體或抗原，反應條件和檢測手段難以兼容。因此，真正意義上的小分子有機物多組分免疫分析技術尚待建立。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以不同熒光發(fā)射波長的高效水溶性量子點作為納米熒光探針標記不同目標分析物半抗原，建立一種特異性強、靈敏度高、簡便高效、可同時快速檢測多種小分子目標分析物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的直接競爭免疫分析技術。
本發(fā)明的技術方案是采用混合酸酐法或碳二亞胺法，將激發(fā)波長寬、熒光光譜窄、穩(wěn)定性好、熒光發(fā)射波長不同的高效水溶性量子點分別與含活性羧基末端的不同目標分析小分子有機物半抗原共價偶聯(lián)制備具有特征熒光發(fā)射波長的不同量子點標記半抗原。
將抗不同目標分析物的抗體分別固定于水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，封閉微球表面未結合抗體的位點。
取適量固定有抗不同目標分析物抗體的聚苯乙烯磁性微球、對應目標分析物標樣及對應的不同量子點標記半抗原，共同分散于磷酸鹽緩沖液中，在室溫下同時進行競爭性免疫反應，在同樣條件下以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系。反應平衡后的體系在磁性微球分離器上使聚苯乙烯磁性微球與液相快速分離，在同一波長紫外光激發(fā)下對液相進行熒光掃描或多波長檢測，測定標樣和樣品體系中各量子點標記半抗原的特征熒光強度(Fs)與目標分析物空白對照的特征熒光強度(Ftl)之比(Fs/ F0)。
依據(jù)FsZ^Fci與體系中對應目標分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比(聚苯乙烯磁性微球上結合的量子點標記半抗原的量與對應目標分析物濃度在一定范圍內(nèi)成反比)的規(guī)律，在條件優(yōu)化的基礎上建立各目標分析小分子有機物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的量子點標記直接競爭免疫分析方法；根據(jù)待測樣品中各目標分析物的Fs/^計算樣品中對應目標分析物的含量，從而建立高靈敏度快速檢測多種目標分析小分子有機物的量子點標記多組分直接競爭免疫分析技術。
本發(fā)明綜合利用免疫分析特異性強、量子點熒光量子效率高而穩(wěn)定、不同量子點可在同一激發(fā)波長下發(fā)射互不干擾的熒光、聚苯乙烯磁性微球可在水相中分散且可在磁場中與液相快速分離等優(yōu)勢。與常規(guī)免疫分析相比，本發(fā)明所建立的量子點標記半抗原多組分直接競爭免疫分析在同一水分散相中進行，平衡時間短；固相和液相可在磁場中快速分離，在同一激發(fā)波長下同時檢測液相中不同量子點標記物的特征熒光強度，實現(xiàn)對多種目標分析小分子有機物的同時定性定量檢測，省去了洗滌和顯色反應步驟，操作簡便快速，顯著提高了檢測效率和檢測靈敏度，重現(xiàn)性好，是對現(xiàn)有小分子有機物多組分免疫分析技術的突破與創(chuàng)新，國內(nèi)外尚未見報道。


圖1為量子點標記3種農(nóng)藥半抗原直接競爭多組分免疫分析熒光光譜圖。
圖2為量子點標記3種藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物半抗原直接競爭多組分免疫分析熒光光譜圖。
具體實施方式
一、量子點標記農(nóng)藥半抗原多組分直接競爭免疫分析技術實施例采用經(jīng)典的混合酸酐法或碳二亞胺法將氰戊菊酯半抗原0,0^^^^4 40-丁酸JX 夂·和克百威半抗原tiOoLp^(n=l-5)分別與表面修飾有活性氨基、熒光發(fā)射波長為655nm、585nm、525nm的核殼結構 (CdSe/ZnS)高效水溶性量子點共價偶聯(lián)，制備特征熒光發(fā)射波長約為655nm的量子點標記氰戊菊酯半抗原、特征熒光發(fā)射波長約為585nm的量子點標記2，4D_ 丁酸和特征熒光發(fā)射波長約為525nm的量子點標記克百威半抗原。用截留分子量為5000道爾頓的超濾離心管離心去除游離的小分子化合物，量子點標記半抗原分別用PH8. 3、含0. 5g/L疊氮化鈉和 lmol/L甜菜堿的0. 05mol/L硼酸鹽緩沖液定容，使量子點濃度為lMfflol/L，4°C儲存，臨用前分別將量子點標記氰戊菊酯半抗原、量子點標記2，4D- 丁酸和量子點標記克百威半抗原用 0. 02mol/L、ρΗ7· 2 PB稀釋200倍、100倍和50倍后等體積混合。
用0. 02mol/L、ρΗ7. 2的PB分別配置濃度為lOPg/mL的抗氰戊菊酯抗體、抗 2，4D- 丁酸抗體和抗克百威抗體溶液，然后在各抗體溶液中加入等體積的10mg/mL的聚苯乙烯磁性微球水分散液，4°C吸附8 12小時，用磁性微球分離器將包被有抗體的聚苯乙烯磁性微球與液相快速分離，固相加原體積2倍的0. 02mol/L、pH7. 2 PB分散后，再用磁性微球分離器進行固液分離，如此重復2次，最后在固相中加入含NaN3 0. 5g/L、濃度為5g/L的明膠溶液混勻，使聚苯乙烯磁性微球的含量為:3mg/mL，室溫下靜置2小時，封閉微球表面未吸附抗體的位點，4°C儲存?zhèn)溆?。使用前將固定有不同抗體的所述3種聚苯乙烯磁性微球儲備液搖勻，等體積混合。
先用甲醇配置含氰戊菊酯、克百威和2，4D_ 丁酸標樣各lmg/mL的母液，再用 0. 02mol/L、pH7. 2 PB稀釋成分別含氰戊菊酯、克百威和2，4D- 丁酸標樣10 lO—Vg/mL的混合標樣系列，以0. 02mol/L、pH7. 2的PB作空白對照。
在IOOPL標樣、待測樣品和空白對照溶液中分別加入固定有抗對應3種目標分析物抗體的聚苯乙烯磁性微球混合液50μ 和對應3種量子點標記半抗原混合液50μ ，在室溫下混合反應約20min。反應平衡后用磁性微球分離器進行固液分離，分別取液相150μ 加入熒光微孔板的不同孔內(nèi)，在226nm激發(fā)波長下掃描(見圖1所示)或分別檢測655nm、585nm 和525nm附近的最大特征熒光強度。
優(yōu)化反應介質、反應物濃度比、反應溫度和時間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關條件，選擇抗體與對應目標分析物免疫反應速度快、敏感性強、穩(wěn)定性好、固定有抗體的聚苯乙烯磁性微球和量子點標記半抗原用量少、含目標分析物反應體系的熒光強度(Fs)與空白對照熒光強度(Ftl)比值高、背景干擾少的條件組合；在此基礎上，依據(jù)FsZiFtl與對應目標分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比(聚苯乙烯磁性微球上結合的量子點標記半抗原的量與對應目標分析物濃度在一定范圍內(nèi)成反比)的規(guī)律以及各樣品的FsAV計算樣品中對應目標分析物的含量，對待測樣品中的對應目標分析物進行定性定量快速檢測，從而建立對應目標分析小分子有機物的量子點標記半抗原直接競爭多組分免疫分析技術。
二、量子點標記藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物半抗原多組分直接競爭免疫分析技術實施例采用混合酸酐法或碳二亞胺法將己烯雌酚半抗原
權利要求
1.一種小分子有機物的量子點標記半抗原多組分直接競爭免疫分析方法，其特征在于以不同熒光發(fā)射波長、表面具有活性氨基的核殼結構高效水溶性量子點作為納米熒光探針，采用混合酸酐法或碳二亞胺法標記不同目標分析小分子有機物半抗原；將抗不同目標分析物的抗體分別固定于水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，封閉微球表面未結合抗體的位點；分別取固定有不同抗體的聚苯乙烯磁性微球、對應目標分析物標樣和對應量子點標記半抗原，共同分散于磷酸鹽緩沖液中，室溫下進行競爭性免疫反應至平衡，同樣條件下以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系；將反應平衡的體系在磁場中使聚苯乙烯磁性微球與液相分離，在同一激發(fā)波長下對液相進行熒光掃描或多波長檢測；依據(jù)標樣體系中不同量子點標記半抗原的特征熒光強度Fs與對應空白對照的熒光強度Ftl之比值FsZiFtl與對應目標分析物的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比的規(guī)律以及待測樣品中各目標分析物的FsAV計算待測樣品中各目標分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測多種目標分析小分子有機物的量子點標記半抗原直接競爭多組分免疫分析方法。
2.根據(jù)權利要求1所述小分子有機物的量子點標記半抗原多組分直接競爭免疫分析方法，其特征在于所述不同熒光發(fā)射波長、表面具有活性氨基的核殼結構的高效水溶性量子點在200 350nm范圍內(nèi)用同一波長紫外光激發(fā)，發(fā)射半峰寬小于30nm、互不干擾的特征熒光，不同量子點的最大發(fā)射波長的間隔>50nm，熒光量子效率高于60%。
全文摘要
小分子有機物的量子點標記半抗原多組分直接競爭免疫分析方法，涉及多組分直接競爭免疫分析技術，以不同熒光發(fā)射波長的高效水溶性量子點標記不同目標分析物半抗原，取固定有不同抗體的聚苯乙烯磁性微球、對應目標分析物標樣及對應量子點標記半抗原共同分散于磷酸鹽緩沖液中進行競爭性免疫反應；將反應平衡的體系在磁場中使聚苯乙烯磁性微球和液相快速分離，在同一波長紫外光激發(fā)下對液相進行熒光掃描或多波長檢測，依據(jù)標樣體系中不同量子點標記半抗原的特征熒光強度與對應空白對照的熒光強度之比值與對應目標分析物的濃度呈正比的規(guī)律，建立快速檢測多種目標分析小分子有機物的量子點標記半抗原直接競爭多組分免疫分析方法。
文檔編號G01N33/542GK102520152SQ20111039940
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權日2011年12月6日
發(fā)明者馮大和, 劉曙照, 徐科 申請人:揚州大學