專利名稱：膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及到利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測抗Ro52抗體的試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
SS-A抗原是一種小核糖核蛋白，由一個RNA分子和兩種不同的蛋白質(zhì)(分子量分別為52和60kDa)組成，抗-SS-A 60kDa蛋白的抗體對于干燥綜合癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性更高，而單獨抗SS-A 52kDa的抗體不具有疾病的特異性，并且容易與其它抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。在鑒別診斷中，抗SSA/Ro抗體對干燥綜合癥和SLE具有極高的特異性。尤其是抗Ro抗體與60KD Ro蛋白(Ro60)和52KD Ro蛋白(Ro52)的免疫反應(yīng)，分別用于辨別SLE和原發(fā)性干燥綜合癥。334/1 0抗體見于85(%-95(%的干燥綜合癥病人。因此，此抗體是鑒別此病的主要指標(biāo)?？筊o52抗體與抗Ro60抗體相比，對原發(fā)性干燥綜合癥具有更高的特異性。在超過60%的原發(fā)性干燥綜合癥病人中可單獨檢測到Ro52自身抗體，而只有5%的SLE病人可單獨檢測到此抗體。本發(fā)明采用大腸桿菌原核表達人源基因工程方法Ro52，即為本產(chǎn)品的檢測抗原。目前實驗室常用的檢測抗R052抗體的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)、間接免疫突光法(indirect immunof lurescence,IFF)、免疫印跡法(immunoblottingtest, IBT)、線性免疫分析法(Line immuno assay, LIA)等。免疫印跡法雖綜合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，但操作相對復(fù)雜，且試劑具有較強的毒性和污染性。間接免疫熒光法可作半定量測定，但需有熒光顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)果判定的客觀性不足，標(biāo)準(zhǔn)化困難，技術(shù)程序比較復(fù)雜，也不適合高通量標(biāo)本的檢測。線性免疫分析法主要用于疾病大類的篩查，針對性相對較差，同時也不適合高通量樣本的檢測。ELISA法檢測可用于高通量標(biāo)本測定，靈敏度也較高，目前被廣泛認(rèn)可，但操作比較繁瑣，需多次加樣和洗滌，且易受溫度和孵育條件的影響，在專業(yè)實驗室里進行操作，給實驗帶來諸多不便。目前市場上商品化抗Ro52抗體檢測試劑盒主要為酶聯(lián)免疫吸附法，需多次加樣和洗滌步驟，完成整個實驗過程需三小時左右，需酶標(biāo)儀，亦需要專業(yè)免疫學(xué)技術(shù)人員在實驗室中進行實驗操作，易受人員和場地的限制，同時易受各種溫度和孵育時間等環(huán)境條件因素的影響，對試驗帶來諸多不便。膠體金層析法應(yīng)用到抗Ro52抗體的檢測中。膠體金免疫層析法(gold-immunochromatography assay, GI CA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細效應(yīng)使樣品溶液在層析條上泳動，使樣品中的待測物與結(jié)合墊上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)，并與條狀纖維層析材料上的抗原(或抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)而被截留，進而形成肉眼可見的紫紅色條帶，得到直觀的實驗結(jié)果，達到快速檢測的目的(Sikowicz G et al. One-stepchromatographicimmunoassay for qualitative determination ofchoricogonadotropin in urine. ClinChem. 1990(36) 1579-1586.)。使用時只將樣品加樣到樣品墊上，數(shù)分鐘就根據(jù)檢測線上紫紅色條帶出現(xiàn)情況來判斷陰陽性結(jié)果。與其他檢測方法相比，檢測時間短，只需要5 10分鐘，操作人員無需培訓(xùn)，操作簡便、快速，無需低溫保存，儲運方便等優(yōu)勢。在自身免疫性疾病方面，目前國外市場上出現(xiàn)了一些檢測自身免疫疾病的試紙條產(chǎn)品，但抗Ro52抗體的膠體金免疫試紙在國內(nèi)外市場上仍沒有問世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服以上方法學(xué)的不足，將膠體金層析法應(yīng)用到抗Ro52抗體的檢測中，同時首次將Ro52抗原蛋白應(yīng)用到膠體金層析法中，采用間接法來實現(xiàn)血液中的抗R052抗體檢測，實現(xiàn)高特異、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測性能，快速篩選出抗R052抗體的陽性樣本，能快速、便捷地輔助診斷干燥綜合癥。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于提供一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法。作為本發(fā)明第一方面的一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，包括有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側(cè)依次向所述底板的另一側(cè)粘貼在所述底板上，其特癥在于所述的結(jié)合墊包被有金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b ；所述的硝酸纖維素包被膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述的檢測線包被有Ro52抗原蛋白，所述的質(zhì)控線包被有金標(biāo)抗體C。進一步，所述的金標(biāo)抗體a中的抗體A為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)中的一種或多種。所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種。所述的抗人IgG單克隆抗體為羊源或兔源中的一種。 所述金標(biāo)抗體a中的抗體A優(yōu)選為葡萄球菌A蛋白。所述的金標(biāo)抗體b中的抗體B和金標(biāo)抗體c中的抗體C同時或不同時為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中金標(biāo)抗體b中的抗體B和金標(biāo)抗體c中的抗體C可發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。所述的金標(biāo)抗體b中的抗體B優(yōu)選為兔IgG，相應(yīng)地金標(biāo)抗體c中的抗體C優(yōu)選為羊抗兔IgG。所述的檢測線上 包被的Cenp-B抗原蛋白為通過原核表達克隆化基因獲得的Cenp-B抗原蛋白。所述Cenp-B抗原蛋白是通過大腸桿菌原核表達的克隆化基因所獲得的重組蛋白。所述樣品墊的樣本來自人血清、血漿、全血樣本。根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過由Kohler等(Continuousculturesof fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J].Nature,1975(256) =495-497)首先描述的雜交瘤法進行制備，或者可通過重組DNA法進行制備(見美國專利4816567)?！皢慰寺】贵w”由Clackson等(Making antibodyfragments using phagedis play libraries[J] Nature,1991 :624-628)和 Marks 等(By-passingimmunization Human antibodies from V-gene libraries displayedonphage [J]. Journal of Molecular Biology, 1991 :581-597)所述技術(shù)從曬菌體抗體文庫中分離。根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的多克隆抗體可通過陳學(xué)清等(免疫學(xué)常用實驗方法.[M]，2000 15-26)通過免疫動物來制備。本發(fā)明的SPA、Pix)tein G通過原核表達克隆化重組基因，由J.薩姆布魯克等(分子克隆實驗指南.[M]，2002 =1228-1232)描述的大腸桿菌原核表達克隆化基因。作為本發(fā)明第二方面的一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，該試紙由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊和底板共同組成，其特癥在于該方法包括有以下步驟步驟I，硝酸纖維素包被膜的制備(l)Ro52抗原蛋白的制備，通過原核表達克隆化基因獲得Ro52抗原蛋白；(2)金標(biāo)抗體c的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體C，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5%，攪拌10 30min,離心,棄上清,將沉淀用洗漆液洗漆2 3次,末次用十分之一初始體積的保
存液將沉淀重懸，置4°C備用；(3)硝酸纖維素包被膜的制備，用包被膜緩沖液稀釋步驟(I)制備的Ro52抗原蛋白至濃度為0. 5 I. 5mg/mL，包被于硝酸纖維素包被膜的檢測線上；用包被膜緩沖液稀釋將抗體c稀釋到0. 8 2. 0mg/mL,以I 10 y 1/cm包被于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線上，硝酸纖維素包被膜制備好以后置放于37°C烘干備用；步驟2，結(jié)合墊的制備(I)金標(biāo)抗體a的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體A，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5%，攪拌10 30min,離心,棄上清,將沉淀用洗漆液洗漆2 3次,末次用十分之一初始體積的保
存液將沉淀重懸，置4°C備用；(2)金標(biāo)抗體b的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體B，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5%，攪拌10 30min,離心,棄上清,將沉淀用洗漆液洗漆2 3次,末次用十分之一初始體積的保
存液將沉淀重懸，置4°C備用；(3)結(jié)合墊的制備經(jīng)處理液浸潰處理的聚脂膜，烘干后，將金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b混合后，以0. 5 4 y 1/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥后得結(jié)合墊，結(jié)合墊置于2°C 8°C的環(huán)境下備用；
步驟3，樣品墊的制備
將玻璃纖維膜經(jīng)處理液浸潰處理后制成樣品墊，樣品墊于37°C烘干后備用；步驟4，在底板上順次相互搭接粘貼經(jīng)前述步驟1-3所制作完成的硝酸纖維素包被膜、結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊；步驟5，對步驟4所制作完成的材料，切割成試紙條。在所述的步驟I的⑵中，金標(biāo)抗體c的制備用O. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH
8.O 9. O,按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 μ g抗體C,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度O. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；其中抗體C為羊抗兔IgG。在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用O. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至8. O 9. O,按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 μ g抗體A，，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度O. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；其中抗體A為羊抗人IgG。在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用O. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7. O 8. O,按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g抗體Α,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度O. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。然后將金標(biāo)SPAOD30 2 4 μ 1/cm噴涂于結(jié)合墊,干燥后備用；其中抗體A為鼠抗人IgG。在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用O. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. O 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ g抗體A，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度O. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。然后將金標(biāo)SPAOD 20 2 4μ Ι/cm噴涂于結(jié)合墊，干燥后備用；其中抗體A為葡萄球菌A蛋白。在所述的步驟2的(2)中，金標(biāo)抗體b的制備方法為用O. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7. O 8. O,按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15μ g抗體B,兔IgG,攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度O. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用，其中抗體B為兔IgG0所述的步驟2的(3)中，將制備好的金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b按體積比20 40 15 20比例混合，用BIO-Dot噴膜機以2. O 4 μ 1/cm噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥得結(jié)合墊，結(jié)合墊封袋后置于2V 8°C的環(huán)境下備用；其中金標(biāo)抗體a中的抗體A為葡萄球菌A蛋白，金標(biāo)抗體b為金標(biāo)兔IgG。所述的緩沖液的目的為提供一定pH和離子強度使氯金酸膠體金呈現(xiàn)所需的電荷狀態(tài)和離子強度，使其被標(biāo)記的蛋白包被于氯金酸膠體金以Aucl-為核心的離子周圍，且形成相對穩(wěn)定的一種狀態(tài)。每種蛋白由于其電荷狀態(tài)和氨基酸組成不同，因此包被所需的條件也不同，需由試驗來確定其緩沖液的種類、濃度、pH。一般來說，抗體標(biāo)記所需的緩沖液可以為碳酸鉀、硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、碳酸緩沖液等，其濃度為O. I O. 5M，pH為5 10。
所述的步驟3中，切割成的試紙的寬度優(yōu)選為4mm和3mm兩種。本發(fā)明的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙的應(yīng)用，其是定性檢測人血清中抗Ro52抗體，輔助診斷干燥綜合癥。本發(fā)明的檢測原理具體為選用親和層析純化的重組表達的R052抗原蛋白，金標(biāo)抗體a和金標(biāo)兔IgG作為膠體金標(biāo)記復(fù)合物，噴涂于結(jié)合墊，利用間接法來檢測血清樣品中是否含有抗R0 52抗體。檢測時，樣本隨著層析泳動到結(jié)合墊并浸潤膠體金標(biāo)記復(fù)合物，其中的人IgG和金標(biāo)抗體a結(jié)合形成人IgG-金標(biāo)抗體a復(fù)合物，由于毛細效應(yīng)，此人IgG-金標(biāo)抗體a復(fù)合物沿包被膜泳動向前,若血清樣品中有抗R052抗體,此人IgG-金標(biāo)抗體a復(fù)合物與包被于硝酸纖維素膜上的抗原蛋白發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)抗體a-人IgG-Ro52抗原蛋白三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶；由于毛細效應(yīng)繼續(xù)泳動向前，金標(biāo)兔IgG與包被在質(zhì)控線上的羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶，多余的未結(jié)合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線和質(zhì)控線都出現(xiàn)條帶的判為陽性結(jié)果；若血清樣品中不含有抗R052抗體，金標(biāo)抗體a到達檢測線時，不與包被在檢測線上的抗原蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，因此在檢測線處沒有出現(xiàn)紫紅色條帶，金標(biāo)抗體a繼續(xù)泳動向前到達吸水墊,而金標(biāo)兔IgG繼續(xù)泳動向前與包被于質(zhì)控線處羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)而被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成紫紅色條帶，因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)條帶判為陰性結(jié)果。本發(fā)明將基因工程菌表達的抗原蛋白首次引入到試紙條中，實現(xiàn)了高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度的檢測性能。目前市面上也出現(xiàn)了商品化ELISA試劑盒，但金標(biāo)層析試紙與之相比，仍有諸多不同之處，不受場地人員之限，檢測時間短即5-10分鐘，判讀結(jié)果簡便。此外該試紙具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度，能滿足市場的快速篩選SS，為病人及早診斷治療提供條件，同時，也能滿足基層實驗室、即時檢測、床邊檢測的需求。與現(xiàn)有的檢測方法相比，本發(fā)明優(yōu)點I.本發(fā)明的獨特性在于基因重組表達的Ro52抗原蛋白首次應(yīng)用于膠體金層析試紙，大大提高了其檢測靈敏度，通過膠體金試紙可快速篩選出抗R052抗體所有陽性樣本(能檢出大于25RU/ml的樣本)。2.本發(fā)明的優(yōu)點是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的抗R052抗體的檢測試紙所需的核心試劑是抗體A即抗人IgG或SPA或PROTEIN G、抗體C、抗體B、抗原蛋白，其單條試紙所用試劑量少，且可通過購買商品化試劑或自制，抗原蛋白來源于自制的純化基因工程抗原蛋白。3.與已公開的用于抗R052抗體檢測的其他方法相比，本發(fā)明的試紙具有許多其他方法所不能比擬的優(yōu)點，如檢測時間短(5 IOmin);不需要任何特殊儀器，可實現(xiàn)床邊檢測和門診即時檢測；操作簡便，只需一步反應(yīng)，操作人員無需培訓(xùn)，檢測成本低；對溫度無特殊要求，無需冷凍，儲存運輸方便，室溫可保存24個月。


圖I為本發(fā)明的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖。其中
圖2a所示為加樣后，反應(yīng)3 5min即可看到檢測區(qū)D和控制區(qū)E相應(yīng)位置上出現(xiàn)紫紅色條帶；圖2b所示為當(dāng)控制區(qū)E和檢測區(qū)D均出現(xiàn)紫紅色條帶，結(jié)果為陽性，說明血清中含有抗R052抗體；圖2c所示為如只在控制區(qū)E出現(xiàn)一條紫紅色條帶，檢測區(qū)D不出現(xiàn)紫紅色條帶，結(jié)果為陰性，說明血清中不含抗R052抗體； 圖2d、2e所示為如控制區(qū)E不出現(xiàn)紫紅色條帶，無論檢測區(qū)D是否有條帶出現(xiàn)，都說明試紙失效。
具體實施例方式本發(fā)明所述的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙，如圖I所示，該試紙是在底板7上由一側(cè)向另一側(cè)順次相互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜3、結(jié)合墊2、樣品墊I、吸水墊6。結(jié)合墊2上包被有金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b，金標(biāo)抗體a的抗體A為羊抗兔IgG金標(biāo)抗體或鼠抗人IgG金標(biāo)抗體或葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體或鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體；金標(biāo)抗體b中的抗體B為兔IgG。硝酸纖維素包被膜3上設(shè)置有檢測線4和質(zhì)控線5，檢測線4包被有R052抗原蛋白，質(zhì)控線5包被有金標(biāo)抗體C，金標(biāo)抗體c中的抗體為羊抗兔IgG。下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。實施例I R052抗原蛋白制備應(yīng)用于本試紙的R052抗原蛋白是通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建重組基因，然后采用原核表達技術(shù)成功表達出全部為人源的R052抗原蛋白。其中，R052抗原蛋白來源于純化基因工程抗原蛋白。實施例2抗體制備抗體A及抗體C、抗體B用下述方法來制備。其中抗體A中的抗人IgG、抗體C及抗體B—般可通過在動物上經(jīng)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射純化的免疫原和佐劑而產(chǎn)生。通過將O. 05mg Img免疫制劑(分別針對山羊或小鼠)與3倍體積的Freund’s完全佐劑混合得到注射溶液，將該注射溶液在動物皮內(nèi)多部位注射，一個月后將動物用1/5至1/10原初量的人IgG的Freund’ s完全佐劑混合液經(jīng)多部位動物皮下注射而加強免疫。7 14天后將動物放血，測定血清抗人IgG滴度。對動物加強免疫直至滴度達到平臺期。在許多免疫學(xué)教科書中描述了生產(chǎn)多克隆抗體的方法，例如，陳學(xué)清等《免疫學(xué)常用實驗方法》。通過從被免疫的動物回收脾細胞并使細胞永生化，例如通過與骨髓瘤細胞融合或通過Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化,并且篩選能表達目的抗體的單克隆抗體(Kohl er, Milstein.Derivation of specificantibody-producing tissue culture and tumor lines by cellfusion[J]. European Journal of Immunology，1976 :501_511)?？赏ㄟ^大腸桿菌原核表達克隆化基因來制備抗體A中的重組葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白，具體操作方法參見J.薩姆布魯克等(分子克隆實驗指南.[M]，2002:1228-1232)，或購買商品化的重組葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白。
實施例3
膠體金溶液制備將O. 01 %的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入每IOOmL HAuCl4溶液加入適量的還原劑溶液，顏色從藍色，然后淺藍、藍色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7 IOmin出現(xiàn)透明的橙紅色。再用超濾或微孔濾膜(O. 45 μ m)過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色顆粒狀沉淀物時棄用。其中所使用的還原劑可以為檸檬酸三鈉(Frens 1973)、鞣酸-檸檬酸三鈉(Slot與Gueeze 1985年)、白磷，優(yōu)選使用檸檬酸三鈉，更優(yōu)選地使用1%檸檬酸三鈉。其中所用玻璃容器應(yīng)絕對清潔,用前需經(jīng)酸洗、硅化。其水應(yīng)為去離子超純水，電阻率達18. 2ΜΩ。膠體金溶液制備過程中，各溶液的配制方法如下I. HAuCl4的配制用超純水溶解氯金酸，配成I %溶液，置4°C備用，有效期四個月。IOOOmL I % HAuCl4溶液配方IOg HAuCl4、超純水定容至1000mL。2. I %檸檬酸三鈉的配制I %檸檬酸三鈉(Sodium Citrate)的配制用超純水溶解Sodium Citrate,配成1%溶液,0· 22 μ m膜濾過,現(xiàn)配現(xiàn)用。實施例4本發(fā)明的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，具體包括如下步驟步驟I，硝酸纖維素包被膜的制備(I)采用實施例I的方法制備R052抗原蛋白；(2)羊抗兔IgG金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實施例3制備的膠體金pH 7. O 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 μ g羊抗兔IgG，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；(3)硝酸纖維素包被膜3的制備，用包被膜緩沖液稀釋R052抗原蛋白至濃度為
I.O I. 5mg/mL,調(diào)整BIO-Dot儀器，噴涂于硝酸纖維素膜(NC)上檢測線4處，靠近結(jié)合墊2端，距結(jié)合墊2約9. 5mm,使Cenp-B抗原蛋白包被于硝酸纖維素包被膜的檢測線4上；用包被緩沖液將羊抗兔IgG稀釋到0. 8 I. 5mg/mL,以I 10 μ 1/cm用BIO-Dot儀器噴涂于硝酸纖維素膜(NC)上靠近吸水墊6的質(zhì)控線5處，距吸水墊6約9mm。檢測線4與質(zhì)控線5兩線距離約5 8_，噴線應(yīng)粗細均勻。37°C烘干，封裝備用。其使用的包被緩沖液可以是硼酸鹽，碳酸鹽，磷酸鹽，Tris-HCl或Tris-磷酸鹽，醋酸鹽，巴比妥，等等，其緩沖液的目的為提供一定PH和離子強度使蛋白包被并牢固包被于NC膜，其緩沖液pH值一般約為6 9. 5范圍內(nèi)，優(yōu)選為6. 5 7. 5的中性緩沖范圍內(nèi)，且最優(yōu)選緩沖液的PH值為7. O 7. 4范圍內(nèi)。緩沖液優(yōu)選為磷酸鹽。其中的硝酸纖維素膜(NC)可以為任何商品化硝酸纖維素膜，S&SAE99、whatman8 μ m、millipore M135、sartorius CN140等。使用的具體的NC膜不是本發(fā)明的關(guān)鍵,但是在每次測定中，上述幾種NC膜可以作為優(yōu)選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩沖液處理的膜，與所用檢測線抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會很大程度造成線條不均勻，拖帶或是彌散的現(xiàn)象，因此運用組裝試紙來選擇優(yōu)選的NC膜。步驟2，結(jié)合墊的制備(I)羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實施例3制備的膠體金pH
8.0 9. 0，按每毫升 膠體金溶液緩慢加入8 12 ii g羊抗人IgG，攪拌10 30min，然后加A BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；(2)兔IgG金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實施例3制備的膠體金pH值至7. 0 8. 0,按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 ii g兔IgG,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。(3)結(jié)合墊的制備經(jīng)緩沖液將聚脂膜浸泡30分鐘，37°C烘干，將羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體按一定的比例混合后，用BIO-Dot儀器，以0. 5 4 ii 1/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥，待干燥完畢之后得結(jié)合墊2，結(jié)合墊2真空包裝，置2°C 8°C備用。置于2°C 8°C的環(huán)境下備用；結(jié)合墊的制備過程中，可以使用的緩沖液包括以下幾種(a)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% TritonX-IOO ；(b) 1% PVAU% BSA,0. 05% PR0CLIN 300、0. 1% Tr itonX-100, pH7. OPBS ；(c) I % PVAU % BSA、0. 05% PR0CLIN 300, pH7. OPBS ；(d)含有 1% PVA、0. 71% Na3PO4U% BSA、0. 05% NaN3、0. 1% Tween-20 ；(e)含有 1% PVA、0. 71% Na3PO4U% BSA.O. 05% NaN3、0. 1% Tween-20,pH7. OPBS ；其優(yōu)選的緩沖液是緩沖液(d)，因為它具有區(qū)別陰陽性樣品的最大分辨率。PR0CLIN 300和NaN3起防腐作用，而Tween-20具有去污和親水作用。羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照下述方法進行通過預(yù)實驗基本確定兔IgG金標(biāo)抗體的0D20，用BIO-Dot噴量I y 1/cm噴于預(yù)處理的聚脂膜上，用0. OlMPBS為上樣緩沖液，即能得到預(yù)期的顏色強度的條帶，確定兔IgG金標(biāo)抗體的應(yīng)用OD噴量為I ii I。隨后將羊抗人IgG金標(biāo)抗體進行梯度稀釋到終濃度OD 100、80、60、40、20，然后將兔IgG金標(biāo)抗體稀釋到終濃度OD 20，用BIO-Dot將以上羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體混合物噴量為3 iU/cm噴于處理好的聚酯膜，將制備的硝酸纖維素包被膜3、結(jié)合墊
2、樣本墊I、吸水墊6依次粘貼于底板7上，用陽性血清、臨界參考值血清、陰性血清為調(diào)試對象。判定依據(jù)陽性血清的檢測線4和質(zhì)控線5兩者的條帶顏色強度一致為依據(jù)，臨界參考值血清能出現(xiàn)，陰性血清無條帶出現(xiàn)的那個OD值，即為這批的應(yīng)用量。通過本試驗得出0D20 40較為符合要求。步驟3，樣品墊的制備將玻璃纖維膜按45mL/片，用緩沖液均勻灑涂于玻璃纖維膜上，于37°C烘干后得樣品墊，樣品墊用鋁箔袋封裝，備用；該步驟可以用的緩沖液包括以下幾種(a)0. 05M Borax,0. OlMPBS (pH 7. 0)、0. I % Sodium CaseinU % PEG20000、2 %BSA、0. 05% NaN3 ；
(b)0. 05M Borax,0. OlMPBS (pH 7. 0)、0. I % Sodium CaseinU % PEG20000、2 %Casein,0. 05% NaN3 ；(c)0. 05M Tris-cl(pH 7. 0)、0. 01MPBS、0. I % Sodium CaseinU % PEG20000,2%Casein、0. 05% NaN3。優(yōu)選的緩沖液是緩沖液(a)，因為它具有區(qū)別陰陽性樣品的最大分辨率，NaN3起防腐作用。步驟4首先進行原材料預(yù)裁剪樣品墊的裁切用裁切機將樣品墊切成與PVC制成的底板等長度即長28cm，寬
2.4cm,置干燥房間備用。吸水墊的裁切用裁紙機將吸水紙切成與PVC制成的底板等長度即長28cm，寬3cm制成吸水墊，置干燥房間備用。結(jié)合墊的裁切用裁切機將結(jié)合墊切成與PVC制成的底板等長度即長28cm，寬
2.4cm,置干燥房間備用。硝酸纖維素包被膜的裁切用裁紙機將硝酸纖維素包被膜切成與PVC制成的底板等長度即長28cm,寬Icm,置干燥房備用。將硝酸纖維素包被膜3、結(jié)合墊2、樣本墊I、吸水墊6按圖I所示依次層疊在PVC塑料制成的底板7上，組成大板。組裝車間溫度應(yīng)控制在25°C 37°C，濕度20% 30%。步驟5切條用切條機將大板切成單人份,每人份寬度按照一定要求切成2. 5mm 4mm的寬度，隨機抽檢，靈敏度能檢出室內(nèi)質(zhì)控樣品(即弱陽性樣本)，條帶顯色程度達到如圖2d，且無非特異性條帶，則產(chǎn)品通過質(zhì)控規(guī)定成為合格產(chǎn)品。組裝、包裝將I人份已切好的試紙組裝在備好的試紙卡里，使加樣窗對應(yīng)試紙的樣品墊，結(jié)果顯示窗對應(yīng)檢測區(qū)和控制區(qū)，組裝車間溫度應(yīng)控制在25°C 37°C，濕度20% 30%。再與干燥劑、說明書、樣品加樣器封裝在外包袋里，于4 25°C避光保存。在上述膠體金層析法抗Cenp-B抗體檢測試紙的制備過程中，各溶液的配置方法如下1.0. IM碳酸鉀的配制用超純水配制，0.22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期一個月。IOOOmL O. IM K2CO3 溶液配方13. 8g K2CO3 ;超純水定容至 IOOOmL02. 10% BSA的配制:用超純水配制，O. 05%疊氮鈉(NaN3)，O. 22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期兩周。IOOOmL 10 % BSA溶液配方IOOg BSA, O. 5g NaN3 ;超純水定容至1000mL。3、包被緩沖液的配制:9gNacl、l. 15gNa2HP04、0. 23g NaH2P04、IOgSucrose、
0.5gEDTA溶于IL超純水中，過濾置于4°C備用。4.洗滌液也即保存液的配制2% BSA,0. 05% (NaN3)、0· OlM pH 7. 2PBS，0. 22 μ m 膜濾過，置 4°C備用，有效期兩周。IOOOmL 標(biāo)記洗滌保存液配方20g BSA,0. 5g NaN3、0. OlMpH 7. 2PBS 定容至 IOOOmL05.金標(biāo)稀釋液的配制IOOOmL 稀釋液的配制2. 423g tris，lOgBSA，0. 2gNaN3 溶于超純水中，調(diào) pH 8.0，定容至Ij IOOOmL0用稀釋液將金標(biāo)稀釋到工作濃度后，加入20% Sucrose和5%的海藻糖。

實施例5該實施例的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實施例4相同 ，只是將該實施例的步驟2中(I)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體的制備，具體如下用pH 9. 00. 2M硼酸緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 ii gSPA蛋白，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存
液將沉淀重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。實施例6該實施例的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實施例4相同，只是將該實施例的步驟2中(I)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為鼠抗人IgG金標(biāo)抗體的制備，具體如下用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.0 8.0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 u g鼠抗人IgG,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min,離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的鼠抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。實施例7該實施例的膠體金免疫層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實施例4相同，只是將該實施例的步驟2中(I)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體的制備，具體如下用pH 9. 0 0. 2M硼酸緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 ii g鏈球菌G蛋白，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min,離心,棄上清,將沉淀用洗漆液洗漆2 3次,末次用十分之一初始體積的
保存液將沉淀重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。本發(fā)明將重組表達的Ro52抗原蛋白引入到膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，能實現(xiàn)血液樣本中的抗R052抗體的檢測，能快速、便捷地輔助診斷干燥綜合癥。實施例8樣本處理取全血I 5ml，自然凝集5分鐘后，3000 5000g/5min lOmin，取上清即得到待測樣品溶液，至少有IOOiil以上待測樣品溶液。用微量加樣器吸取以上血清50 70 Ul樣本于樣品墊，緩慢加樣?；蛘哂梦軐⒀鍢颖揪徛渭? 5滴于樣品墊上，5 IOmin觀察結(jié)果，根據(jù)條帶出現(xiàn)情況來判讀陰陽性結(jié)果。實施例9試劑盒的檢測和臨床性能評估
本發(fā)明的膠體金抗Ro52抗體檢測試紙的金標(biāo)抗體a的抗體A優(yōu)選為SPA，抗體b的抗體B為兔IgG，抗體c的抗體為羊抗兔IgG，對其試紙進行的臨床性能進行以下評估。I.穩(wěn)定性試驗I. I 37°C加速穩(wěn)定性將試紙置于37°C進行加速實驗，每天取出用室內(nèi)質(zhì)控品進行測試，通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內(nèi)精密度來判斷試紙的穩(wěn)定性。4個月后結(jié)果顯示，質(zhì)控品的檢測結(jié)果符合預(yù)期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。陰陽性參考品為10份抗R052抗體陽性血清和10份抗R052抗體陰性血清。I. 2 4°C穩(wěn)定性實驗將試紙置于4°C進行常規(guī)穩(wěn)定性實驗，每月取出用室內(nèi)質(zhì)控品測試，同樣通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內(nèi)精密度來判斷試紙的穩(wěn)定性。12個月后結(jié)果顯示，質(zhì)控品檢測結(jié)果符合預(yù)期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。18個月后結(jié)果顯示，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率仍為100%。24個月后檢測結(jié)果顯示，出現(xiàn)一例假陰性。綜合以上結(jié)果說明試紙在2 8°C貯存，2年內(nèi)是穩(wěn)定的。2.診斷靈敏度從臨床中收集到100份確診為原發(fā)性膽汁肝炎(SS)病人的血清，用自制的膠體金試紙按照說明書上的操作步驟對上面收集到的SS病人血清進行檢測。5min后統(tǒng)計結(jié)果如下
樣本數(shù)陰性陽性臨床確診SS病人---
1004258根據(jù)上面統(tǒng)計的結(jié)果，根據(jù)對100份確認(rèn)的SS病人血清的檢測，可以發(fā)現(xiàn)有抗R052抗體陽性的樣本數(shù)量為58例，陰性樣本數(shù)量為42例。因此通過計算得出診斷靈敏性(％) = 58/(42+58) X 100%= 58%3.診斷特異性從臨床中收集到健康獻血者血清和，用自制的膠體金試紙按照說明書上的操作步驟對上面收集到的健康獻血者進行檢測。5min后統(tǒng)計結(jié)果如下
樣本數(shù)陰性陽性健康獻血者血清---
3002964根據(jù)對健康獻血者300份血清的檢測的統(tǒng)計結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在健康獻血者中測得抗R052抗體陰性的樣本數(shù)量為296例，因此通過計算得出(健康獻血者)診斷特異性(％) = 296/300X 100%= 98. 66%以上是對本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實施方式，均在本發(fā)明的保護范 圍之中。
權(quán)利要求
1.膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，包括有樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)，所述樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)由底板(7)的一側(cè)依次向所述底板(7)的另一側(cè)相互搭接粘貼在所述底板(7)上，其特征在于 所述的結(jié)合墊(2)包被有金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b ； 所述的硝酸纖維素包被膜(3)上設(shè)置有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，所述的檢測線(4)包被有Ro52抗原蛋白，所述的質(zhì)控線(5)包被有金標(biāo)抗體C。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述金標(biāo)抗體a中的抗體A為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種；所述的抗人IgG單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述金標(biāo)抗體a中的抗體A為葡萄球菌A蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述的金標(biāo)抗體b中的抗體B和金標(biāo)抗體c中的抗體C同時或不同時為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中金標(biāo)抗體b中的抗體B和金標(biāo)抗體c中的抗體C可發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，所述的單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，其特征在于所述的檢測線上包被的Ro52抗原蛋白為通過原核表達克隆化基因獲得的Ro52抗原蛋白。
8.一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟 步驟1，硝酸纖維素包被膜的制備 (1)Ro52抗原蛋白的制備，通過原核表達克隆化基因獲得Ro52抗原蛋白； (2)金標(biāo)抗體c的制備用0.IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體C，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用； (3)硝酸纖維素包被膜的制備，用包被膜緩沖液稀釋步驟(I)制備的Ro52抗原蛋白至濃度為0. 5 I. 5mg/mL，包被于硝酸纖維素包被膜的檢測線上；用包被膜緩沖液稀釋將抗體c稀釋到0. 8 2. Omg/mL,以I 10 y 1/cm包被于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線上，硝酸纖維素包被膜制備好以后置放于37°C烘干備用； 步驟2，結(jié)合墊的制備 (I)金標(biāo)抗體a的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體A，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用； (2)金標(biāo)抗體b的制備用0.IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體B，攪 拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用； (3)結(jié)合墊的制備經(jīng)處理液浸潰處理的聚脂膜，烘干后，將金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b混合后，以0. 5 4ia/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥后得結(jié)合墊，結(jié)合墊置于2°C 8°C的環(huán)境下備用； 步驟3，樣品墊的制備 將玻璃纖維膜經(jīng)處理液浸潰處理后制成樣品墊，樣品墊于37°C烘干后備用； 步驟4，在底板上順次相互搭接粘貼經(jīng)前述步驟1-3所制作完成的硝酸纖維素包被膜、結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊； 步驟5，對步驟4所制作完成的材料，切割成試紙條。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟I的(2)中，金標(biāo)抗體c的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 ii g抗體C，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；其中抗體C為羊抗兔IgG。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 ii g抗體A,,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；其中抗體A為羊抗人IgG。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 ii g抗體A,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。然后將金標(biāo)SPAOD 302 4 ii 1/cm噴涂于結(jié)合墊,干燥后備用；其中抗體A為鼠抗人IgG。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 ii g抗體A,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。然后將金標(biāo)SPA OD 202 4 ii 1/cm噴涂于結(jié)合墊,干燥后備用；其中抗體A為葡萄球菌A蛋白。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟2的(2)中，金標(biāo)抗體b的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 ii g抗體B,兔IgG,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4 °C備用，其中抗體B為兔I gG。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步驟2的(3)中，將制備好的金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b按體積比20 40 15 20比例混合，用BIO-Dot噴膜機以2.0 4iil/cm噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥得結(jié)合墊，結(jié)合墊封袋后置于2 V 8 V的環(huán)境下備用；其中金標(biāo)抗體a中的抗體A為葡萄球菌A蛋白，金標(biāo)抗體b為金標(biāo)兔IgG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙以及制備方法。其膠體金層析法抗Ro52抗體檢測試紙，包括有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側(cè)依次向所述底板的另一側(cè)粘貼在所述底板上，其結(jié)合墊包被有金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b；硝酸纖維素包被膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，檢測線包被有Ro52抗原蛋白，質(zhì)控線包被有金標(biāo)抗體c。本發(fā)明采用間接免疫測定法，引入Ro52抗原蛋白，對結(jié)合墊和樣品墊進行了工藝優(yōu)化，來實現(xiàn)抗Ro52抗體的高靈敏度、高特異、高準(zhǔn)確性的檢測性能，為輔助診斷干燥綜合癥提供參考依據(jù)。
文檔編號G01N33/532GK102621315SQ20111003236
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者孫宏彬, 張玥, 葛文斌, 錢杰, 韓永俊, 高成秀 申請人:上海科新生物技術(shù)股份有限公司