專利名稱：一種檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種ELISA方法，特別涉及一種檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的 ELISA方法。
背景技術(shù)：
葡萄球菌產(chǎn)生的脫落毒素可以引起人和動物發(fā)生嚴重的皮膚性疾病。例如金黃色葡萄球菌可引起人的燙傷樣皮膚綜合癥，豬葡萄球菌可引起仔豬發(fā)生滲出性皮炎。目前發(fā)現(xiàn)的脫落毒素有8種，包括金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的ETA、ETB和ETD，以及豬葡萄球菌產(chǎn)生的 EXHA、EXHB、EXHC 和 EXHD、SHETA、SHETB。豬葡萄球菌S. hyicus可以引起豬群發(fā)生大規(guī)模的滲出性皮炎病(Exudative Epidermitis, EE)，它是一種急性、高度接觸性的豬傳染病，患豬以急性全身性滲出性皮炎為主要特征，該病又稱溢脂性皮炎或煤煙病。本病主要感染5-6日齡的初生哺乳仔豬、剛斷奶的仔豬以及母豬乳房上。該病原可通過各種途徑感染，主要以破裂和損傷的皮膚黏膜引起動物的感染。據(jù)國內(nèi)外的研究結(jié)果表明它的發(fā)病率為80% ；死亡率5% 90%不等；少數(shù)存活的病豬常導(dǎo)致生長發(fā)育障礙形成“僵豬”。豬葡萄球菌首先在丹麥被研究人員發(fā)現(xiàn)， 到目前為止已經(jīng)波及到歐洲和亞洲的各個國家，并且有上升的趨勢。據(jù)泰國對規(guī)模化豬場保育豬的10種主要疾病統(tǒng)計，滲出性皮炎發(fā)生率為25.3%，僅次于鏈球菌病(31.6% )，名列第2位。在美國最常見的保育豬疾病是鏈球菌病、滲出性皮炎。據(jù)相關(guān)報道，鄧朝陽，甘海霞等于2001年報道了廣西某豬場發(fā)生的滲出性皮炎的流行狀況及治療情況；殷鳳斌，米瑞娟等在2002年報道了發(fā)生在東北的豬滲出性皮炎的病原鑒定；鄭金燥于2005年報道了福建省德化縣兩例豬滲出性皮炎中西醫(yī)結(jié)合的診治情況；睢艷平，徐鑌蕊等在2006年報道該病在北京的發(fā)病情況；包小華、操傳斌等于2008年報道了豬葡萄球菌引起人的多器官功能衰竭的病例；楊先富[1°]等于2009年報道了豬葡萄球菌病的診斷與治療情況，所有報道均顯示該病已成為一種新的影響人類健康和養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。豬葡萄球菌所產(chǎn)生的這些脫落毒素是造成豬滲出性皮炎的主要致病因子之一，它是一種細胞外分泌的蛋白質(zhì)，分子量大約30KD。丹麥研究者首先通過PCR和ffestern-blot 對產(chǎn)生的脫落毒素進行了分析和研究，將脫落毒素分為4種類型，并分別命名為EXHA、 EXHB、EXHC、EXHD，其中EXHD的抗原性不同于其他3種毒素的抗原性。研究結(jié)果還表明EXHA、 EXHB這兩種毒素蛋白是一種金屬蛋白，他們的分泌和一些二價金屬離子有密切的關(guān)系，在培養(yǎng)基中加入二價金屬離子比未加入二價金屬離子產(chǎn)生的EXHA、EXHB毒素蛋白的量高一倍。這4種脫落毒素的基因大小約為816bp 834bp，這些基因攜帶一些質(zhì)粒，并受這些質(zhì)粒的調(diào)控。在日本，研究人員在對豬葡萄球菌的研究中發(fā)現(xiàn)了另外兩種毒素蛋白，分別命名為SHETA、SHETB。另外，豬葡萄球菌引起的滲出性皮炎主要與DSGl (橋粒核心蛋白)有關(guān)， DSGl是一種鈣依賴性蛋白，EXHA、EXHB, EXHC和EXHD可以將這種靶蛋白裂解，從而導(dǎo)致真皮表面的角化細胞發(fā)生脫落，引起豬群發(fā)生滲出性皮炎。豬葡萄球菌的這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)可能在不久的將來成為我們關(guān)注的一個熱點。雖然，在丹麥和日本已經(jīng)有了一些相關(guān)的研究，大多都是研究其致病機理，對該病在臨床上的診斷研究還較少，特別是在鑒別診斷上還難以將其他的皮膚病區(qū)分開。臨床上缺少一種快速高效、簡便易操作的診斷方法。因此，本研究通過對這六種脫落毒素基因的克隆表達，純化出純度在90%以上的重組蛋白質(zhì)，以此為抗原來包被具有高吸附性的材料上，建立一種檢測ExhA、ExhB、ExhC、ExhD、SietAjhetB等毒素抗體的診斷試劑盒，從而解決該病在臨床上診斷的不便之處。目前，采用的診斷方法有臨床癥狀、病理變化、細菌學(xué)的分離鑒定、生化試驗、冰凍組織切片、PCR、免疫印跡分析和ELISA等。根據(jù)癥狀和病理變化的診斷是臨床診斷中最基本的方法。通常發(fā)病豬的表現(xiàn)為不發(fā)熱，全身皮膚粘膠樣滲出，惡臭，形成黑色痂皮，肥厚干裂等，其外觀和在同一窩小豬中嚴重程度不同，這些都是該病的特征。細菌學(xué)方法如下通常是采取化膿的皮膚、組織或膿性滲出物等做涂片和分離培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色后，用顯微鏡觀察，并依據(jù)細菌的形態(tài)、排列和染色特性等進行診斷；另外，豬葡萄球菌具有一個獨特的生物學(xué)特性，在血平板上不發(fā)生溶血現(xiàn)象，在麥康凱培養(yǎng)基上不生長。生化試驗過程如下豬葡萄球菌可以發(fā)酵大多數(shù)糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為兼性厭氧菌。 取ImL 3%的過氧化氫傾注于含有大量菌落的普通瓊脂平板上，有氣泡產(chǎn)生；凝血酶陰性， DNA酶、酯酶、透明質(zhì)酸酶陽性，甘露醇和羥基丁酮陰性；在有條件的情況下可以采用選擇性指示培養(yǎng)基(Devriese，1977)或者Maph-Zyum試驗(LammLer，1989)來確定分離的葡萄球菌是否為豬葡萄球菌。RT-PCR擴增方法如下國外有很多研究者對豬葡萄球菌產(chǎn)生的脫落毒素設(shè)計了 6 對特異性引物，對疑似發(fā)生豬滲出性皮炎的病豬分離細菌，抽提全基因組DNA，以此為模板， 進行擴增；然后克隆測序在NCBI上進行比對，從而來對6種毒素基因進行檢測。但它也有一定的局限性，那就是對樣本DNA的純度要求很高，為了提高多重PCR方法的敏感性必須用專用的DNA提取試劑盒。免疫印跡試驗過程如下通過PCR鑒定出的含有毒素的菌株，利用這些有毒菌株制備單克隆抗體和多克隆抗體，分析各種毒素蛋白的免疫學(xué)特性。現(xiàn)有的ELISA方法如下所述在丹麥，研究人員通過PCR鑒定出含有毒素基因的菌株后，經(jīng)分離培養(yǎng)后進行滅活，以滅活的全菌作為抗原來建立一種ELISA鑒定方法，雖取得了一定效果，但是該方法可靠性差。另外，由于豬葡萄球菌在嗜菌型、血清型和DNA指紋型方面具有多型性 (Andresene tal，1993)，發(fā)病豬中同時存在不同型的S. hyicus，從而使診斷變得復(fù)雜。 Wegener發(fā)現(xiàn)從每個病豬的皮膚上任選分離出的10株S. hyicus中，平均包含1. 9種不同的噬菌體型和2. 3種不同的抗生素型。從動物肝、脾中分離到的菌株的多樣性則稍低一些。 目前，在實驗室診斷中缺少簡易方法來區(qū)分毒力型和非毒力型菌株，所以各型S. hicus都應(yīng)被看做潛在的毒力型菌株。但是，由于引起該病的病因很復(fù)雜，而且易與其它皮膚病變混淆，如脂痘，疥癬，癬，玫瑰糖疹，缺鋅，增生性皮膚病等。因此，在診斷過程中要選擇特異性強、靈敏度高的檢測方法進行鑒別診斷?？傊陨线@些方法雖然已經(jīng)得到了推廣應(yīng)用，但是都存在一定的缺陷，對實際生產(chǎn)的指導(dǎo)意義不大。因此，建立一種快速、有效、簡便的抗體診斷方法已迫在眉睫。為預(yù)防和控制該病在我國的蔓延以及對人類健康和養(yǎng)豬生產(chǎn)造成的威脅奠定基礎(chǔ)。同時為制定合理的免疫程序提供有力保證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的 ELISA方法，包括以下步驟將一種豬葡萄球菌脫落毒素包被在基材上，用封閉液進行封閉，然后加入被檢樣品進行反應(yīng)；再加入標(biāo)記物標(biāo)記的二抗，然后加入底物顯色，最后根據(jù) P/N值來判定抗體的高低。所述的豬葡萄球菌脫落毒素為EXHA、EXHB, EXHC和EXHD、SHETA或SHETB ；所述的基材包括96孔ELISA酶標(biāo)板、洗板槽、封口膜、吸水材料等；所述包被的條件優(yōu)選為于0. 05mol/L、pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液中4°C包被12 16h，然后再于37°C包被2h;所述的封閉液優(yōu)選為質(zhì)量體積比3%的牛血清白蛋白；所述封閉的條件優(yōu)選為4°C封閉過夜；所述的被檢樣品優(yōu)選按體積1 80稀釋后再加入基材中；所述的標(biāo)記物優(yōu)選為辣根過氧化物酶；所述標(biāo)記物標(biāo)記的二抗優(yōu)選為HR標(biāo)記物標(biāo)記的IgG ；所述的底物為能與標(biāo)記物發(fā)生反應(yīng)顯色的化學(xué)藥品。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明敏感性好、重復(fù)性好、特異性高、操作方便。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1(1)基因工程方法制備脫落毒素EXHB，具體步驟如下豬葡萄球菌ExhB基因的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化見參考文獻(楊彩娟等.豬葡萄球菌ExhB基因在E. coli中的表達及生物學(xué)活性分析.中國獸醫(yī)學(xué)報，2009, ) :399 402)。融合蛋白的大量誘導(dǎo)表達挑單個E. coli BL21轉(zhuǎn)化體接入3mL含100 μ g/mLAmp 的LB液體培養(yǎng)基中，370C 200rpm培養(yǎng)過夜進行活化，按體積百分比1 %的量接種500mL含 100 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37°C 200rpm培養(yǎng)至其OD6tltl值為0. 6左右，加入IPTG使其終濃度為lmmol/L。然后再在37°C恒溫振蕩器上以200rpm繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，12000rpm離心lOmin，收集菌體，棄上清，盡量去除培養(yǎng)基，再用預(yù)冷的PBS洗滌一次，12000rpm離心lOmin，收集菌體并稱量菌體濕重克(g)數(shù)。重組蛋白的純化將收集的濕菌按每IOOmL培養(yǎng)基所得菌體加入40mL平衡緩沖液 (Buffer A :0. IM NaH2P04、0. OlM Tris_Cl，pH 8.0)比例重懸菌體。細胞懸液中加入溶菌酶 (終濃度為100mg/mL)，上下吹打混勻，37°C孵育15min。將重懸菌液至于合適容器中，超聲波破碎。超聲過程中保持菌液處于冰浴或者鹽冰浴中。超聲條件每次超聲4s，間隔10s，共25min(裂解次數(shù)根據(jù)菌體濃度和體積來確定)，功率300W。裂解后的菌液于4℃10000rpm離心20min，包涵體和細胞碎片位于沉淀中。移去上清，按每lOOmL培養(yǎng)基加5mL緩沖液比例，加入Buffer B緩沖液重懸沉淀(Buffer B8M尿素、0．1M NaH，PO。、0．01MTriS—Cl，pH 8．0)，然后用0．45 u M濾膜過濾上清，得到細菌粗提物。將細菌粗提物和樹脂(Ni—NTAAgarose，506428A，invitrogen)按ll的體積比混合，孵育lo分鐘。分別用BufferC(Buffer C8M尿素、0．1M NaH，PO。、0．01M TriS—Cl pH6．3)、Bufer D(Buffer D8M尿素、0．1M NaH，PO。、0．01M TriS—Cl pH 5．9)洗脫雜蛋白，改用Buffer E(Buffer E8M尿素、0．1MNaH，PO。、0．01M TriS—Cl pH4．5)洗脫目的蛋白。取少量的洗滌上清和重懸的沉淀，加入等量的2×SDS電泳上樣緩沖液進行SDS—PAGE分析檢查包涵體的洗滌情況。
包涵體的復(fù)性純化后的蛋白用PBS緩沖液(0．0lmol／L)透析去除尿素，蛋白質(zhì)重新形成包涵體，離心，去上清，收集沉淀。用適量的Buffer E重新溶解蛋白，以濃縮蛋白。
A、將濃縮蛋白溶于包涵體復(fù)性緩沖液(0．0lmol／L PBS、lmmol／L EDTA，pH 8．0)中，加入3一環(huán)已胺一卜丙磺酸(CAPS Merker protein Refolding kit)，使其質(zhì)量體積比為1％，加二硫蘇糖醇(D／／)至終濃度lmmol／L；
B、將蛋白轉(zhuǎn)移到透析袋中，加入l×透析液(1M／riS—Cl，pH 8．0)和D／／(0．1mmol／L)4℃透析，透析6h以上；
C、倒掉透析液，重新加入l×透析液進行透析；
D、按照步驟C重復(fù)一次
E、12000rpm離心5min，去沉淀，測定上清中的蛋白濃度。
分別取少量的上清和重懸的沉淀，加入等量的2×SDS電泳上樣緩沖液進行SDS—PAGE電泳檢查包涵體的復(fù)性，經(jīng)Western blot檢測表明，復(fù)性后的重組蛋白能被豬葡萄球菌多克隆陽性血清所識別具有良好的反應(yīng)原性。
蛋白質(zhì)濃度、純度的測定及保存
蛋白質(zhì)濃度的測定用紫外分光光度計測定樣品在260nm和280nm波長的光吸收值，按下式計算樣品中的蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度(mg／mL)一(1．45×A280-0．74×A，。。)×稀釋倍數(shù)。蛋白質(zhì)純度的測定SDS—PAGE電泳檢查純化的蛋白。復(fù)性后蛋白的保存將復(fù)性后的脫落毒素EXHB蛋白溶液過濾除菌，小量分裝凍存于一70℃冰箱。
得到純度為85％，濃度為0．375mg／ml脫落毒素EXHB蛋白。
1、包被液(0．05mol／L，pH 9．6的碳酸鹽緩沖液)
II、PBST洗滌緩沖液(0．0lmol／L PBS—T，含0．05％Tween一20，pH7．4)
Na，HPO。．12H，02．9lg
NaCl8．50g
Tween-200. 5mL加蒸餾水至IOOOmLII I、封閉液液質(zhì)量體積比3 %牛血清白蛋白(BSA)準(zhǔn)確量取后，分別溶于PBS-T洗滌緩沖液中。IV、底物緩沖液(PH5. 0磷酸檸檬酸)0. 2M Na2HPO4 (28. 4g/L) 25. 7ml0. IM 檸檬酸(19. 2g/L) 24.3ml加蒸餾水50ml。V、TMB (四甲基聯(lián)苯胺)使用液TMB (10mg/5ml 無水乙醇)0. 5ml底物緩沖液(PH5.5) IOml0. 75% H2O232 μ 1VI、終止液 Qmol/L H2SO4)蒸餾水177. 8mL濃硫酸(濃度為98% ) 22. 2mL0②ELISA操作步驟I、將步驟(1)得到的重組純化的脫落毒素EXHB蛋白包被在96孔酶標(biāo)板上每孔 100 μ L的脫落毒素EXHB，4°C過夜+37°C 2h ；II、次日甩去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌緩沖液在振蕩器上振蕩洗滌96孔酶標(biāo)板3_5 次，每次3min，每洗完一次在吸水材料上拍干，加入200 μ L的質(zhì)量體積比為3% BSA封閉液 4°C封閉過夜；III、甩去孔內(nèi)的液體，用PBST洗滌緩沖液在振蕩器上洗滌96孔酶標(biāo)板3 5次， 每次3min，每洗完一次在吸水材料上拍干；IV、加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清(健康豬免疫前抽的血清)和陽性血清(用純化后的脫落毒素EXHB蛋白免疫豬后的血清)，用含有體積比為3%的BSA和10%的胎牛血清的PBS-T作為血清稀釋液，按1 80倍稀釋后每孔IOOyL作對照，取上述血清稀釋液以 1 80倍稀釋后的被檢血清每孔加入100微升，37°C反應(yīng)Ih;V、洗去未反應(yīng)的抗體，洗滌步驟同步驟II ；VI、加入HRP標(biāo)記的羊抗豬源IgG抗體(純度>90%，濃度大于ang/ml此，二抗?jié)舛仁? 10000稀釋，每孔的用量是100yL)，37°C孵育30min，用PBST洗滌緩沖液振蕩洗滌96孔酶標(biāo)板3 5次，每洗完一次在吸水材料上拍干。同時加入底物顯色液，A液(A液是pH5. 0的磷酸檸檬酸)50微升，B液(B液是TMB使用液50微升，37。C反應(yīng)15min。顯色后加入50微升體積的終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上用0D450讀數(shù)，計算P/N 值。應(yīng)用該ELISA方法對送檢的5個豬場的30份血清進行檢測，結(jié)果顯示10份血清呈陽性，血清的陽性率為33.3%。同時，進行批內(nèi)重復(fù)性試驗，試驗結(jié)果(表1)顯示本發(fā)明的重復(fù)性良好。表1批內(nèi)ELISA重復(fù)性試驗
權(quán)利要求
1.一種檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于包括以下步驟將一種豬葡萄球菌脫落毒素包被在基材上，用封閉液進行封閉，然后加入被檢樣品進行反應(yīng)；再加入標(biāo)記物標(biāo)記的二抗反應(yīng)，然后加入底物顯色，最后根據(jù)P/N值來判定抗體的高低。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于所述豬葡萄球菌脫落毒素為EXHA、EXHB, EXHC和EXHD、SHETA或SHETB。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于所述的基材為96孔ELISA酶標(biāo)板、洗板槽、封口膜或吸水材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于所述包被的條件為于0. 05mol/L、pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液中4°C包被12 16h，然后再于37°C包被2h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于所述的封閉液為質(zhì)量體積比3%的牛血清白蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于所述封閉的條件為4°C封閉過夜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于所述的被檢樣品按體積1 80稀釋后再加入基材中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于所述的標(biāo)記物為辣根過氧化物酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法，其特征在于所述標(biāo)記物標(biāo)記的二抗為HRP標(biāo)記物標(biāo)記的IgG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測豬葡萄球菌脫落毒素抗體的ELISA方法。該ELISA方法是將一種豬葡萄球菌脫落毒素包被在基材上，用封閉液進行封閉，然后加入被檢樣品進行反應(yīng)；再加入標(biāo)記物標(biāo)記的二抗反應(yīng)，然后加入底物顯色，最后根據(jù)P/N值來判定抗體的高低。本發(fā)明所述的ELISA方法敏感性好、重復(fù)性好、特異性高、操作方便。
文檔編號G01N33/569GK102175862SQ20111003018
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者劉燕玲, 宋長緒, 張樂宜, 李艷, 蔡汝健, 陳亞強 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所