專利名稱：一種葡萄球菌腸毒素探測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化探測領(lǐng)域，涉及一種新型的葡萄球菌腸毒素探測方法，特別涉及一種利 用LSPR技術(shù)的快速高靈敏度葡萄球菌腸毒素探測方法。
背景技術(shù)：
快速檢測并確定生物病菌的種類是各國發(fā)展檢測手段的主要目的，面對多種類型的生化 戰(zhàn)劑，基于各種原理的探測方法相繼問世，即便是對于同一病菌來說，也出現(xiàn)了多種檢測方 法。以B型葡萄球菌腸毒素(SEB)為例，它是金黃色葡萄球菌腸毒素系列(SEA SEE)之一， 具有極強(qiáng)的耐熱性和抗藥性，檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR) 等。ELISA法是檢測SEB最常用的方法，優(yōu)點是操作簡便、檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化，所需試劑易得， 目前商用的ELISA試劑盒檢測水平普遍為1 20ng/mL，但其主要缺點是檢測時間較長(約4 小時)，需用試劑較多。PCR反應(yīng)檢測優(yōu)點是對于活體和死體均能檢測，能檢測多個樣品，缺 點是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生，導(dǎo)致結(jié)果的誤判，此外還需使用擴(kuò)增 儀等專業(yè)儀器，普及化的檢驗工作帶來困難。目前PCR分析技術(shù)檢測限為檢測水平小于lng/mL 左右，檢測時間根據(jù)實驗方法和對象在2 5小時不等，同樣不能滿足短時間內(nèi)檢測的需求。 迫切需要發(fā)展一種快速高靈敏度的檢測方法，該方法不僅可以應(yīng)用于金葡萄球菌感染檢測和 食品檢測中，而且在對病菌的抗藥性、耐熱性分析中都有重要應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是克服現(xiàn)有葡萄球菌腸毒素探測需要特殊設(shè)備、探測時間長等缺
點，利用LSRP (局域表面等離子體技術(shù))及生化分子間的特異性反應(yīng)，通過觀察光譜移動實
現(xiàn)葡萄球菌腸毒素快速、高靈敏度、免標(biāo)記探測。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是 一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在 于包含以下步驟
(1) 制備葡萄球菌腸毒素LSPR探測芯片；
(2) 對芯片金屬結(jié)構(gòu)表面進(jìn)行活化，形成特異性生物分子膜；
(3) 測試該芯片的消光譜獲得結(jié)合前的基準(zhǔn)值；
(4) 然后滴上待測樣品，待其充分反應(yīng)后，放入LSPR傳感器中進(jìn)行測試，利用抗原一抗體分子間的特異性反應(yīng)，觀察光譜移動狀況，判斷待測樣品中是否含有葡萄球菌腸毒素。 所述的探測芯片上可附帶的探測對象為金黃色葡萄球菌腸毒素系列SEA SEE中的一種、
或多種；所述的葡萄球菌腸毒素濃度探測下限可優(yōu)于lng/ml。 所述探測芯片的通過以下歩驟制各-
(a) 選用探測芯片基底、清洗并作親水處理；
(b) 在基底表面通過納米球自組裝、或光刻、或納米壓印制作M1納米結(jié)構(gòu)；
(c) 將納米結(jié)構(gòu)金屬化，獲得在基底表面有納米金屬結(jié)構(gòu)的探測芯片。 上述所述歩驟(a)中的芯片基底的材料為玻璃、或石英、或硅、或鍺。 所述探測構(gòu)芯的結(jié)構(gòu)可以根據(jù)探測對象的特點設(shè)計、制作成三角形、或菱形、或五角雖
形、或圓柱形、或雙層復(fù)合結(jié)構(gòu)；其中將納米結(jié)構(gòu)金屬化所采用的金屬材料為金、或銀、或 銀表面復(fù)合金。
所述的探測芯片為陣列化芯片，其結(jié)構(gòu)特征尺寸為30nm 1000nm;列陣數(shù)從"1 10x10，通過點樣等方式針對不同種類的葡萄球菌腸毒素活化不同子單元，實現(xiàn)高效、多通道 并行檢測。
所述步驟(2)中的活化步驟如下首先采用亞二硫基二乙酸活化金屬結(jié)構(gòu)表面；然后采 用乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC與羥基硫代琥鉑酰亞胺NHS混合溶液活化羧基基團(tuán)，使金屬表 面帶上活性的羧基基團(tuán)；最后通入抗葡萄球菌腸毒素羊單克隆抗體IgG，并且利用乙醇胺水 溶液封閉多余的活性酯基團(tuán)，完成整個芯片的活化過程。
所述步驟(4)中的檢測環(huán)境為大氣環(huán)境下，同時溫度在一50。C 80。C。
所述步驟(4)中的待測物反應(yīng)時間為1分鐘到1小時。
所述的分析光譜移動狀況是指光譜譜峰位置移動量大于10nm。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的優(yōu)點是本方法具有不需要復(fù)雜設(shè)備、不需要使用放射 性同位素、酶或熒光等做為標(biāo)識物，芯片制備完成后，可長吋間放置，所需的探測時間短。 具有快速、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣、安全、穩(wěn)定性高等顯著特點，為快速檢測葡萄球菌腸毒 素提供一種簡單實用的新方法。


圖1是本發(fā)明快速高靈敏度葡萄球菌腸毒素測試的流程示意圖； 圖2是本發(fā)明實施例1中芯片活化前測試所得的基準(zhǔn)值； 圖3是本發(fā)明實施例1中濃度為10嗎/ml的SEB的檢測結(jié)果示意圖； 圖4是本發(fā)明實施例2中濃度為0.1 u g/ml的SEB的檢測結(jié)果示意圖；圖5是是本發(fā)明實施例3中濃度為lng/ml的SEB的檢測結(jié)果示意圖；
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及具體實施方式
詳細(xì)介紹本發(fā)明。
'本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素探測方法，其具體探測流程圖如圖1所示；包含以下歩驟 (1 )制備葡萄球菌腸毒素LSPR探測芯片；
(2) 對芯片金屬結(jié)構(gòu)表面進(jìn)行活化，形成特異性生物分子膜；
(3) 測試該芯片的消光譜獲得結(jié)合前的基準(zhǔn)值；
(4) 然后滴上待測樣品，待其充分反應(yīng)后，放入LSPR傳感器中進(jìn)行測試，利用抗原一 抗體分子間的特異性反應(yīng)，觀察光譜移動狀況，判斷待測樣品中是否含有葡萄球菌腸毒素。
實施例1
本實施例是采用石英材料基底上，特征尺寸為1000nm的金屬銀結(jié)構(gòu)的探測芯片，采用 本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素探測方法實現(xiàn)對濃度為i0p g/ml的SEB的探測。
首先采用石英材料作為芯片基底、清洗并作親水處理；在基底表面通過光刻制作出面積 約10mmX10mm，特征尺寸為1000nm，列陣數(shù)為10x10的圓柱形結(jié)構(gòu)；通過鍍金，將納米 結(jié)構(gòu)金屬化，獲得在基底表面有納米金結(jié)構(gòu)的芯片。然后將2mM的亞二巰基二乙酸水溶液滴 加在樣片表面，反應(yīng)2(kiin;將0.4M的乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC與0. 1M的羥基硫代琥鉑酰 亞胺NHS混合溶液滴加在探測芯片表面，活化羧基基團(tuán)20min;然后用0. 01M磷酸鹽PBS緩 沖液進(jìn)行徹底沖洗，用高壓氮氣吹干；滴加10 ug/ml的抗SEB的羊單克隆抗體IgG在基底 表面，IgG通過堿性氨基酸(Arg和Lys)側(cè)鏈上的氨基基團(tuán)與活化的羧基反應(yīng)，從而被固定在 膜上；然后1M乙醇胺水溶液封閉多余的活性酯基團(tuán)；最后用緩沖液清洗備用。在室溫大氣 環(huán)境內(nèi)，測試出該芯片的基準(zhǔn)光譜峰值為608咖，滴加濃度為10tig/rnl的SEB溶液200 p 1 在芯片表面，反應(yīng)20rain后，用高壓氮氣吹干。放入LSPR傳感器中進(jìn)行測試，利用抗原一 抗體分子間的特異性反應(yīng)，在室溫大氣環(huán)境內(nèi)，觀察光譜移動狀況，測試出反應(yīng)后的芯片光 譜峰值為582nm，如圖3所示。光譜峰值移動大于10nm。
實施例2
本實施例是采用鍺材料基底上，特征尺寸為500nm金銀復(fù)合結(jié)構(gòu)的探測芯片，采用本發(fā) 明的葡萄球菌腸毒素探測方法實現(xiàn)對濃度為0. 1 u g/ml的SEB的探測。
首先釆用鍺材料作為芯片基底、清洗并作親水處理；在基底表面通過納米壓印制作出面 積約500timX500jini，特征尺寸為500nm，列陣數(shù)為4x4的五角星形結(jié)構(gòu)；通過鍍銀將納米 結(jié)構(gòu)金屬化，獲得在基底表面有納米銀結(jié)構(gòu)的芯片；然后，再結(jié)構(gòu)上蒸鍍一層10nm厚的金，
6形成雙層復(fù)合結(jié)構(gòu)。然后將2mM的亞二巰基二乙酸水溶液滴加在樣片表面，反應(yīng)20min;將 0.4M的乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC與0. 1M的羥基硫代琥鉑酰亞胺NHS混合溶液滴加在探測 芯片表面，活化羧基基團(tuán)20min;然后用O.OIM磷酸鹽PBS緩沖液進(jìn)行徹底沖洗，用高壓氮 氣吹干；滴加10 U g/ml的抗SEB的羊單克隆抗體IgG在基底表面，Tg(;通過堿性氨基酸(Arg 和Lys)側(cè)鏈上的氨基基團(tuán)與活化的羧基反應(yīng)，從而被固定在膜上；然后m乙醇胺水溶液封 閉多余的活性酯基團(tuán)；最后用緩沖液清洗，形成特異性生物分子膜。在一10。C的大氣環(huán)境下， 測試芯片的基準(zhǔn)光譜峰值為611nm，滴加濃度為0. lug/ml的SEB溶液反應(yīng)后，芯片光譜峰 值為528nm,如圖4所示。 實施例3
本實施例是采用硅材料基底上，特征尺寸為30nm的金結(jié)構(gòu)的探測芯片，采用本發(fā)明的 葡萄球菌腸毒素探測方法實現(xiàn)對濃度為lng/ml的SEB的探測。
首先采用硅材料作為芯片基底、清洗并作親水處理；在基底表面通過納米球自組裝制作 出面積約20MmX2(^im，特征尺寸為30nm，列陣數(shù)為lxl的四邊形排布的菱形納米結(jié)構(gòu)；通 過鍍銀將納米結(jié)構(gòu)金屬化，獲得在基底表面有納米金厲結(jié)構(gòu)的芯片。然后將2mM的亞一巰基 二乙酸水溶液滴加在樣片表面，反應(yīng)20min;將0.4M的乙基碳二亞胺鹽酸.鹽EDC與0. 1M的 羥基硫代琥鉑酰亞胺NHS混合溶液滴加在探測芯片表面，活化羧基基團(tuán)20min;然后用0. O]M 磷酸鹽PBS緩沖液進(jìn)行徹底沖洗，用高壓氮氣吹干；滴加10 y g/ml的抗SEB的羊單克隆抗 體IgG在基底表面，IgG通過堿性氨基酸(Arg和Lys)側(cè)鏈上的氨基基團(tuán)與活化的羧基反應(yīng)， 從而被固定在膜上；然后1M乙醇胺水溶液封閉多余的活性酯基團(tuán)；最后用緩沖液清洗，形 成特異性生物分子膜。經(jīng)測試，芯片的基準(zhǔn)光譜峰值為539nm。滴加濃度為lng/ml的SEB溶 液反應(yīng)后，待其充分反應(yīng)后，放入LSPR傳感器中進(jìn)行測試，利用抗原一抗體分子間的特異 性反應(yīng)，觀察光譜移動狀況，芯片光譜峰值為573nm，如圖5所示。光譜峰值移動大于10nra。
實施例4
本實施例是采用玻璃基底上的陣列芯片，采用本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素探測方法對不同 類型的葡萄球菌腸毒素進(jìn)行探測。
首先采用玻璃作為芯片基底、清洗并作親水處理；通過光刻分區(qū)的方法在玻璃基底上制 作出7X7多孔陣列芯片，根據(jù)探測對象的不同，每個子單元內(nèi)的納米結(jié)構(gòu)可以各不相同，然 后通過鍍膜將結(jié)構(gòu)金屬化。采用5mM的亞二硫基二乙酸對金屬金表面進(jìn)行活化，然后將乙 基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) (0.8M)與羥基硫代琥鉑酰亞胺(NHS) (0.3M)混合溶液活化羧 基基團(tuán)，使金屬表面帶上活性的羧基基團(tuán)，羧基基團(tuán)可以與生物分子的活性成分發(fā)生反應(yīng)，
7以固定生物分子。通入抗葡萄球菌腸毒素抗體，利用乙醇胺水溶液(1M)封閉多余的活性酯 基團(tuán)，完成整個芯片的活化過程。在大氣環(huán)境下，測試芯片各列陣單元的基準(zhǔn)值。然后通過 點樣的方法在不同的列陣單元中引入待測的不同類型的腸毒素。不同類型的腸毒素反應(yīng)時間 約在1分鐘到1小時。待其充分反應(yīng)后，在大氣環(huán)境下，放入LSPR傳感器中進(jìn)行測試，利 用抗原一抗體分子間的特異性反應(yīng)，通過掃描的方式，測試不同子單元的光譜峰值，如果與 前面測試所得的基準(zhǔn)值相比較光譜峰值移動量大于lOnm,則可以判斷待測樣品中的抗原與其 抗體間發(fā)生特異性反應(yīng)，待測樣品含有相應(yīng)的腸毒素成分。
權(quán)利要求
1、一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在于包含以下步驟(1)制備葡萄球菌腸毒素LSPR探測芯片；(2)對芯片金屬結(jié)構(gòu)表面進(jìn)行活化，形成特異性生物分子膜；(3)測試該芯片的消光譜獲得結(jié)合前的基準(zhǔn)值；(4)然后滴上待測樣品，待其充分反應(yīng)后，放入LSPR傳感器中進(jìn)行檢測，利用抗原-抗體分子間的特異性反應(yīng)，觀察光譜移動狀況，判斷待測樣品中是否含有葡萄球菌腸毒素。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在于所述的探測芯片上可附帶的探測對象為金黃色葡萄球菌腸毒素系列SEA SEE中的一種、或多種；所述的葡萄 球菌腸毒素濃度探測下限可優(yōu)于lng/ml。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在于所述探測芯片的 通過以下步驟制備(a) 選用探測芯片基底、清洗并作親水處理；(b) 在基底表面通過納米球自組裝、或光刻、或納米壓印制作出納米結(jié)構(gòu)；(c) 將納米結(jié)構(gòu)金屬化，獲得在基底表面有納米金屬結(jié)構(gòu)的探測芯片。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的探測芯片，其特征在于所述步驟(a)中的芯片基底的材料 為玻璃、或石英、或硅、或鍺。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的探測芯片，其特征在于所述探測構(gòu)芯的結(jié)構(gòu)可以根據(jù)探測對 象的特點設(shè)計、制作成三角形、或菱形、或五角星形、或圓柱形、或雙層復(fù)合結(jié)構(gòu)；其中將 納米結(jié)構(gòu)金屬化所采用的金屬材料為金、或銀、或銀表面復(fù)合金。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的探測芯片，其特征在于所述的探測芯片為陣列化芯片，其結(jié) 構(gòu)特征尺寸為30nm 1000nm;列陣數(shù)從lxl 10x10，通過點樣等方式針對不同種類的葡萄 球菌腸毒素活化不同子單元，實現(xiàn)高效、多通道并行檢測。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在于所述步驟(2) 中的活化步驟如下首先采用亞二硫基二乙酸活化金屬結(jié)構(gòu)表面；然后采用乙基碳二亞胺鹽 酸鹽EDC與羥基硫代琥鉑酰亞胺NHS混合溶液活化羧基基團(tuán)，使僉屬表面帶上活性的羧基 基團(tuán)；最后通入抗葡萄球菌腸毒素羊單克隆抗體IgG，并且利用乙醇胺水溶液封閉多余的活 性酯基團(tuán)，完成整個芯片的活化過程。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在于所述步驟(4)中的檢測環(huán)境為大氣環(huán)境下，同時溫度在一50。C 80。C。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在于所述歩驟(4) 中的待測物反應(yīng)時間為1分鐘到1小時。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在于所述的分析光 譜移動狀況是指光譜譜峰位置移動量大于10nm。
全文摘要
一種葡萄球菌腸毒素探測方法，其特征在于包含以下步驟(1)制備葡萄球菌腸毒素LSPR探測芯片；(2)對芯片金屬結(jié)構(gòu)表面進(jìn)行活化，形成特異性生物分子膜；(3)測試該芯片的消光譜獲得結(jié)合前的基準(zhǔn)值；(4)然后滴上待測樣品，待其充分反應(yīng)后，放入LSPR傳感器中進(jìn)行測試，利用抗原—抗體分子間的特異性反應(yīng)，觀察光譜移動狀況，判斷待測樣品中是否含有葡萄球菌腸毒素，達(dá)到無標(biāo)記、高靈敏度、快速檢測。本發(fā)明方法不需要復(fù)雜設(shè)備、不需要使用放射性同位素、酶或熒光等做為標(biāo)識物，具有快速、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣、安全、穩(wěn)定性高等顯著特點，為快速檢測葡萄球菌腸毒素提供一種簡單實用的新方法。
文檔編號G01N33/569GK101514988SQ20091007819
公開日2009年8月26日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日
發(fā)明者史立芳, 朱少麗, 杜春雷, 歡 楊, 羅先剛, 鄧啟凌 申請人:中國科學(xué)院光電技術(shù)研究所