專利名稱：一種霍亂毒素檢測免疫傳感器及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種傳感器，具體涉及一種檢測霍亂毒素的免疫傳感器及制備方法和應用。
背景技術：
人類歷史上已有七次世界性的霍亂大流行。在南亞、非洲和拉丁美洲的部分地區(qū),霍 亂已呈現(xiàn)地方性流行,季節(jié)性暴發(fā)很普遍，與貧困和較差的衛(wèi)生狀況密切相關。所以對于 霍亂毒素的及時檢測對人類具有重大意義?，F(xiàn)在使用的檢測方法有酶聯(lián)免疫法，PCR 法、山梨醇發(fā)酵試驗和CT平板測定法等。這些檢測方法大都步驟繁瑣，檢測所需時間都 在5小時以上，所需儀器成本高。不適宜在疫情現(xiàn)場對霍亂弧菌的快速檢測。而基于脂 質(zhì)體的霍亂毒素免疫傳感器可以更快速準確的檢測霍亂毒素，實驗所需儀器便攜且價格 低廉。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種簡單、靈敏、快速、耗費低 且可以反復使用的霍亂毒素檢測免疫傳感器以及它的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種利用霍亂毒素檢測免疫傳感器快速檢測霍亂病毒 的方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案一種霍亂毒素檢測免疫傳感器，包括石英晶振、石英晶振上的疏水層和疏水層上的 磷脂膜。所述疏水層為十八垸基硫醇，磷脂膜為修飾了神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體磷脂膜。 一種制備上述霍亂毒素檢測免疫傳感器的方法，包括以下步驟1、 將石英晶振浸入十八垸基硫醇溶液中，組裝過夜，從而在石英晶振的金盤表面自 組裝一層疏水層；2、 將自組裝了疏水層的石英晶振置于修飾了神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體溶液中，修飾了神 經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體會自發(fā)的鋪展在石英晶振表面，進而形成一層磷脂膜，制得本發(fā)明霍 亂毒素檢測免疫傳感器。所述表面修飾了神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體溶液的制備方法為將二棕櫚酸磷脂(DPPC) 和神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)按照摩爾比為97. 5 : 2. 5的比例稱取，溶于甲醇和氯仿的混合溶液 中，所述甲醇和氯仿的體積比為1 : 6;真空旋轉蒸發(fā)，除去有機溶劑后在燒瓶壁上留下 一層均勻的磷脂膜，加入磷酸緩沖溶液(pH=7.4)，然后將磷脂膜在5(TC的水浴中溶漲 半小時，最后用探頭超聲儀超聲則得到大小均勻的修飾了GM1的脂質(zhì)體溶液。 一種利用霍亂毒素免疫傳感器檢測霍亂病毒的方法，包括以下步驟 將霍亂毒素檢測免疫傳感器浸入磷脂濃度為0. 5mg/mL的脂質(zhì)體分散的磷酸鹽緩沖溶 液中；當壓電儀器的頻率達到穩(wěn)定后加入霍亂毒素，用實時檢測觀察到最初階段頻率下 降非常迅速，在10分鐘內(nèi)可以完成90%的反應，壓電響應頻率和霍亂毒素在1 6Pg/mL 的范圍內(nèi)成線性關系，檢測下限為100ng/mL。本發(fā)明的優(yōu)點是1、所制備的霍亂毒素檢測免疫傳感器再生十分簡單，檢測后分別 用己醇和水，將石英晶振表面徹底沖洗干凈，就可以恢復到自組裝的疏水層界面，然后 再鋪展磷脂膜進行新的霍亂毒素檢測即可；自組裝的疏水層十分穩(wěn)定，可以反復使用20 次而無明顯信號下降，并且疏水層放置于空氣中數(shù)天天使用也不影響檢測信號。2、解決 了霍亂毒素快速檢測的系列問題由于GM1 (神經(jīng)節(jié)苷脂)對霍亂毒素B亞單位的特異性 識別，利用支撐磷脂膜將不溶于水的GM1固定在傳感界面和脂質(zhì)體上，脂質(zhì)體是磷脂雙 層膜在水相中均勻分散的微囊，磷脂膜與生物膜類似，除了可以很好的降低界面上的非 特異性吸附外，還能很好的保持所固定的生物分子的活性，真實的模擬生物分子之間的 相互作用。3、檢測步驟簡單，檢測時間不超過0.5小時，檢測所需的壓電儀器便攜且價 格低廉。4、本傳感器對霍亂毒素的響應效果十分明顯，但對其他蛋白質(zhì)幾乎沒有頻率響 應，表面用磷脂膜修飾石英晶振表面起了很好的抑制非特異性吸附的效果。5、利用磷脂 膜固定捕獲探針并在同時引發(fā)脂質(zhì)體特異性凝集的方法檢測霍亂毒素，是文獻從未報道 過的。6、本發(fā)明應用了壓電石英晶振微天平作為檢測手段，壓電石英晶振不僅可以響應 晶體表面的質(zhì)量負載，既霍亂毒素在晶陣表面的特異性識別；還可以響應由于脂質(zhì)體特 異性凝集而產(chǎn)生的體系(溶液)的密度、粘度等多種參數(shù)的變化。并且均相溶液中特異 型凝集的脂質(zhì)體會自組裝到捕獲了霍亂毒素的石英晶振傳感界面，進而使界面的質(zhì)量響 應大大的提高，明顯地放大了檢測信號，提高了傳感器的靈敏度。
圖1:響應頻率與不同濃度的霍亂毒素的標準曲線。
具體實施方式
實施例l:霍亂毒素檢測免疫傳感器的制備 1、 石英晶振用新配的Piranha洗液(VH2SM : VH2。2 = 7 : 3)洗滌三次，每次三分鐘， 以清潔晶振表面，然后用純水洗凈，于氮氣下干燥備用。2、 將處理好的石英晶振浸入2mM的十八垸基硫醇的乙醇溶液中，組裝過夜，從而在 石英晶振的金盤表面自組裝一層均勻致密的疏水層；3、 制備表面修飾了 GMl的脂質(zhì)體溶液分別稱取2mg的DPPC和0. 247mg的GMl， 溶于甲醇和氯仿的混合溶液(1 : 6v/v)，真空旋轉蒸發(fā)，除去有機溶劑后在燒瓶壁上留 下一層均勻的磷脂膜，加入4mL的磷酸緩沖溶液(pH=7.4)，將磷脂膜在50°C的水浴中 溶漲半小時，最后用探頭超聲儀超聲則得到大小均勻的修飾了 GMl的脂質(zhì)體顆粒的水溶 液。4、 將上述自組裝了疏水層的石英晶振置于上述制備好的修飾了 GMl的脂質(zhì)體水溶液 中，修飾了GM1的脂質(zhì)體會自發(fā)的鋪展在石英晶振表面，即制得本發(fā)明傳感器。實施例2:霍亂疫苗的檢測將本發(fā)明霍亂毒素檢測免疫傳感器浸入磷脂濃度為0. 5mg/mL的脂質(zhì)體分散的磷酸鹽 緩沖溶液U/15M的Na2HP04和1/15 M的KH2P04按照體積比4 : 1混合配制，PBS， pH=7.4)中，并用壓電儀器檢測其頻率。在壓電儀器輸出電壓為(-10V 10V)的作用 下，電子計數(shù)儀可以顯示AT切割的9M石英晶振產(chǎn)生的響應頻率。通過與電腦相連和數(shù) 據(jù)處理軟件，每秒種讀取一個頻率響應數(shù)據(jù)，并將其頻率響應與時間作圖可以得到頻率 響應的實時響應曲線。當頻率達到穩(wěn)定后加入由上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司提供的 L霍亂毒素疫苗終濃度為1 U g/mL的霍亂疫苗溶液到檢測溶液中，用實時檢測觀察到 最初階段頻率下降非常迅速。在10分鐘內(nèi)可以完成90%的反應，整個檢測響應過程不超 過半小時。加入牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人免疫球蛋白等樣品溶液(3uL，終濃 度為50ug/mL，購于鼎國生物有限公司)所引起的頻率響應小于10Hz，為背景頻率響應。 lwg/mL霍亂疫苗溶液的響應頻率為770Hz，根據(jù)工作曲線(圖1，圖中各點分別用已知 濃度的霍亂毒素純抗原檢測溶液按上述方法測定)上響應頻率770Hz對應的濃度值，得 到霍亂毒素的濃度為0.96ixg/mL。結果表明，本傳感器可以對霍亂疫苗溶液中霍亂毒素 進行快速檢測。實施例3:霍亂病人血液樣品的檢測將本發(fā)明霍亂毒素檢測免疫傳感器浸入磷脂濃度為0. 5mg/mL的脂質(zhì)體分散的磷酸鹽
緩沖溶液中，并用壓電儀器檢測其頻率。在壓電儀器輸出電壓為(-iov iov)的作用下,電子計數(shù)儀可以顯示AT切割的9M石英晶振產(chǎn)生的響應頻率。通過與電腦相連和數(shù)據(jù)處 理軟件，每秒種讀取一個頻率響應數(shù)據(jù)，并將其頻率響應與時間作圖可以得到頻率響應 的實時響應曲線。當壓電儀器的頻率達到穩(wěn)定后加入血槳樣品3"L，由湖南大學校醫(yī)院 提供，用實時檢測觀察到最初階段頻率下降非常迅速，在10分鐘內(nèi)可以完成90%的反應, 整個檢測響應過程不超過半小時，正常血漿樣品所引起的頻率響應為10Hz，為背景頻率 響應。病人血槳樣品1的響應頻率為920Hz,根據(jù)工作曲線上(如圖1可知)響應頻率 920Hz對應的濃度值，得到霍亂毒素的濃度為2.25ng/mL。與酶聯(lián)免疫方法得的檢測結 果2. 34ix g/mL基本一致；病人血漿樣品2的檢測頻率響應為596Hz，根據(jù)工作曲線上(如 圖1可知)響應頻率596Hz對應的濃度值，得到的霍亂毒素濃度為0. 9ix g/raL，與酶聯(lián)免 疫法得出的檢測結果0.96pg/mL基本一致。對比結果表明，本傳感器可以快速準確的對 霍亂毒素進行檢測。
權利要求
1、一種霍亂毒素檢測免疫傳感器，包括石英晶振，其特征在于還包括石英晶振上的疏水層和疏水層上的磷脂膜。
2、 根據(jù)權利要求1所述的霍亂毒素檢測免疫傳感器，其特征在于所述疏水層為十八 烷基硫醇，所述磷脂膜為修飾了神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體磷脂膜。
3、 一種制備權利要求1或2所述霍亂毒素檢測免疫傳感器的方法，其特征在于包括以下步驟a、 將石英晶振浸入十八烷基硫醇溶液中，組裝過夜，從而在石英晶振的金盤表面自 組裝一層疏水層；b、 將自組裝了疏水層的石英晶振置于修飾了神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體溶液中，修飾了神 經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體會自發(fā)的鋪展在石英晶振表面，進而形成一層磷脂膜，制得本發(fā)明霍 亂毒素檢測免疫傳感器。
4、 根據(jù)權利要求3所述制備霍亂毒素檢測免疫傳感器的方法，其特征在于，所述表 面修飾了神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體溶液的制備方法為將二棕櫚酸磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂按照摩 爾比為97.5 : 2.5的比例稱取，溶于甲醇和氯仿的混合溶液中；真空旋轉蒸發(fā)，除去有 機溶劑后在燒瓶壁上留下一層均勻的磷脂膜，加入磷酸緩沖溶液，然后將磷脂膜在水浴 中溶漲半小時，最后用探頭超聲儀超聲則得到大小均勻的修飾了神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體溶 液。
5、 根據(jù)權利要求4所述制備霍亂毒素檢測免疫傳感器的方法，其特征在于，所述甲 醇和氯仿的體積比為1 : 6。
6、 一種利用權利要求1或2所述的霍亂毒素檢測免疫傳感器檢測霍亂病毒的方法， 其特征在于包括以下步驟將霍亂毒素檢測免疫傳感器浸入含磷脂的脂質(zhì)體分散的PBS 中；當壓電儀器的頻率達到穩(wěn)定后加入霍亂毒素，用實時檢測觀察到最初階段頻率下降 非常迅速，在10分鐘內(nèi)可以完成90%的反應，壓電響應頻率和霍亂毒素在1 6Pg/mL 的范圍內(nèi)成線性關系，檢測下限為100ng/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種霍亂毒素檢測免疫傳感器，包括石英晶振，石英晶振上的疏水層和疏水層上的磷脂膜；本發(fā)明還給出了所述霍亂毒素檢測免疫傳感器的制備方法。本發(fā)明霍亂毒素檢測免疫傳感器制備簡單、反應靈敏、檢測快速、耗費低且可重復使用。
文檔編號G01N33/53GK101149378SQ20071003606
公開日2008年3月26日 申請日期2007年11月7日 優(yōu)先權日2007年11月7日
發(fā)明者俞汝勤, 吳海龍, 沈國勵, 蔣健暉, 歡 陳 申請人:湖南大學