專利名稱：抗ehec o157志賀樣毒素ⅱa亞單位單克隆抗體5f3輕、重鏈可變區(qū)基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及抗腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3重鏈和輕鏈可變區(qū)基因和多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自EHEC O157于1982年被確認(rèn)為致病菌以來，其引發(fā)的食物中毒在世界各地包括中國(guó)均發(fā)生了暴發(fā)流行。該菌的感染已經(jīng)成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題，無論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，都受到廣泛關(guān)注。我國(guó)已將腸出血性大腸桿菌列為21世紀(jì)可能對(duì)國(guó)人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。O157:H7感染可以引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥如溶血性尿毒綜合征(Hemolyticuremicsyndrom，HUS)、血栓形成性血小板減少性紫癜(Thromboricthromobocytopenicporpura，TTP)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，致死率可達(dá)5-10％。O157菌培養(yǎng)容易、繁殖迅速、感染力強(qiáng)、感染途徑廣泛，使之極有可能作為未來軍事斗爭(zhēng)中的細(xì)菌戰(zhàn)劑和生物恐怖戰(zhàn)劑。美國(guó)疾病控制中心(CDC)已將EHEC O157菌列為B類生物恐怖病原體嚴(yán)加防范。然而目前對(duì)其感染尚缺乏有效的治療方法，臨床上針對(duì)O157菌的感染主要采用抗生素治療及相應(yīng)的對(duì)癥治療。新近的研究發(fā)現(xiàn)，抗生素使菌體破裂，導(dǎo)致O157菌志賀毒素(Shiga toxin，ST)的釋放水平大大提高，使得抗生素對(duì)病程無明顯影響甚至導(dǎo)致病程的延長(zhǎng)，從而可能增加發(fā)生并發(fā)癥的危險(xiǎn)并引起死亡。2002年國(guó)家衛(wèi)生部制定的“腸出血性大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉應(yīng)急處理預(yù)案(試行)”第5條病人的隔離治療規(guī)定對(duì)腸出血性大腸桿菌O157:H7病人和疑似病人進(jìn)行隔離治療。病人的治療以對(duì)癥支持療法為主，可以使用微生態(tài)制劑，原則上不用止瀉藥和抑制腸蠕動(dòng)的藥物。腸出血性大腸桿菌O157病人和疑似病人(包括糞便標(biāo)本O157抗原膠體金方法檢測(cè)陽性的腹瀉病人)禁止使用抗生素，疫區(qū)內(nèi)的其他一般腹瀉病人應(yīng)慎用抗生素。因此，無論從公共衛(wèi)生還是生物反恐的需要出發(fā)，加強(qiáng)EHEC O157:H7的治療研究已顯得非常緊迫。
EHEC O157可以產(chǎn)生兩種毒素，分別稱為志賀毒素I(Stx1)和志賀毒素II(Stx2)。在細(xì)菌體內(nèi)，Stx2為分泌型表達(dá)，Stx1為胞內(nèi)表達(dá)。兩種毒素均由1個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位組成，A亞單位具有細(xì)胞內(nèi)毒性，能與28SrRNA作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成停止，是大腸桿菌O157:H7引起臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)；B亞單位具有細(xì)胞結(jié)合特性，能與具有特定受體(Gb3)的細(xì)胞結(jié)合，從而引導(dǎo)A亞單位發(fā)揮作用。多數(shù)O157:H7細(xì)菌產(chǎn)生Stx2，Stx2比Stx1與臨床上重癥并發(fā)癥的關(guān)系更加密切，Stx2比Stx1的毒性大1000倍。Stx2可以進(jìn)入血液循環(huán)，引起目標(biāo)組織器官，如腎小球和胃腸道內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。因此Stx2是該菌致病性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
在HUS發(fā)生前，一般有3～5d的出血性結(jié)腸炎(HC)的前驅(qū)癥狀，發(fā)生HC后，在Stx結(jié)合到腎內(nèi)皮細(xì)胞之前，有一段阻止Stx/Gb3結(jié)合的時(shí)間。研究證明使用能中和Stx2的特異性抗體可以預(yù)防HUS和血栓形成的血小板減少性紫癜等并發(fā)癥的出現(xiàn)。因此實(shí)踐中要求在未發(fā)生并發(fā)癥之前對(duì)EHEC感染作出迅速診斷，及時(shí)使用抗體治療。自1975年Kohler和Milstein創(chuàng)建B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以來，各種單克隆抗體相繼出現(xiàn)，這些單克隆抗體不僅在疾病的基礎(chǔ)研究方面發(fā)揮了積極的作用，同時(shí)也為多種疾病的診治帶來了新的希望。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚無可用于治療O157感染的抗體類藥物，我們經(jīng)過長(zhǎng)期的大量的克隆篩選，獲得了一株針對(duì)St×2A的高親和性和高特異性的雜交瘤細(xì)胞株，其具有較高的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供抗志賀樣毒素II(Shiga like toxin 2)毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因極其編碼的多肽，其重組后可表達(dá)出特異性識(shí)別和結(jié)合Stx2A的抗體活性片段。
本發(fā)明的另一目的在于所述抗體5F3的基因或多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種抗志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。本發(fā)明所述抗Stx2A單克隆抗體5F3的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因是從能夠穩(wěn)定分泌高親和性和高特異性的鼠源性抗Stx2A的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5F3中克隆獲得的。獲得方式是從抗Stx2A的雜交瘤細(xì)胞株5F3中提取總RNA，以oligo(dT)15為隨機(jī)引物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物特異性分別擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，經(jīng)過序列測(cè)定和在NCBI中BLAST比較分析后，確認(rèn)5F3重鏈可變區(qū)核苷酸序列是序列表<400>1所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列是序列表<400>3所示的氨基酸序列。輕鏈可變區(qū)基因基因序列是序列表<400>2所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列是序列表<400>4所示的氨基酸序列。上述兩個(gè)基因經(jīng)重組后可表達(dá)出特異性識(shí)別和結(jié)合抗志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A蛋白的抗體ScFv活性片段。
對(duì)于本發(fā)明人成功克隆的抗Stx2A特異性單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因，分別應(yīng)用專業(yè)性的已知抗體基因序列數(shù)據(jù)庫(IMGT)和(NCBI)對(duì)所得序列進(jìn)行同源性比較和其胚系基因來源分析表明，所獲得的基因序列的確來自小鼠胚系基因，和現(xiàn)有報(bào)道的各種抗體基因序列均不完全一致。所得VH與VL基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體5F3的基因及其編碼的多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明人采用通用的兼并性引物成功地從培養(yǎng)的一株抗Stx2A特異性單克隆抗體5F3的雜交瘤細(xì)胞株中克隆了其對(duì)應(yīng)抗體輕、重鏈可變區(qū)基因?；谏鲜龅膯慰寺】贵w5F3的輕、重鏈可變區(qū)基因，可以采用基因工程方法，構(gòu)建和表達(dá)多種形式的小分子基因工程抗體，如ScFv抗體、嵌合抗體、抗體融合蛋白等，制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物，將對(duì)診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥提供新的途徑。


圖1為從抗Stx2A的雜交瘤細(xì)胞株5F3中提取總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖2為5F3中提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3為PCR擴(kuò)增的抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4為PCR擴(kuò)增的抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因藉LinkerDNA連接后瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖5為利用獲得的5F3輕、重鏈可變區(qū)基因所構(gòu)建的ScFv抗體表達(dá)載體的測(cè)序圖譜。
圖6為Western blot檢測(cè)ScFv抗體與抗原結(jié)合。
具體實(shí)施方案1.鼠抗Stx2A單克隆抗體的制備2.抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆從抗Stx2A雜交瘤細(xì)胞株5F3中提取總RNA，以oligo(dT)15為隨機(jī)引，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物特異性分別擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。
3.抗Stx2A單克隆抗體5F3的ScFv形式抗體的構(gòu)建、表達(dá)和純化將抗體輕、重鏈可變區(qū)基因用一編碼(G4S)3短肽的DNA片段連接成5’VH-Linker-VL3’片段，PCR擴(kuò)增該片段。純化后的ScFv片段與已改造的載體pCANTAB6His相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用固相鎳離子親和層析對(duì)ScFv進(jìn)行初步純化。
4.抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物中的應(yīng)用實(shí)施例1抗腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體的制備1.免疫Balb/c小鼠目的蛋白Stx2A經(jīng)過純化后免疫Balb/c小鼠(鼠齡6～8周)，100ug/只，首次免疫，100μL抗原與等量完全福氏佐劑混合，注射小鼠腹部和腹股溝皮下免疫。14d后再次免疫，免疫劑量和途徑同首次免疫，采用不完全福氏佐劑。于第28d追加免疫，150ug/只，腹腔注射。
2.雜交瘤細(xì)胞的制備1)收集B淋巴細(xì)胞追加免疫后3天，摘除小鼠眼球放血，血清留作陽性對(duì)照。無菌操作取出脾臟，并將脾臟放在10ml預(yù)溫不完全培養(yǎng)基中，剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織，置100目不銹鋼網(wǎng)中，用注射器的內(nèi)芯研磨，邊研磨邊滴加不完全培養(yǎng)基沖洗。收集過濾后的細(xì)胞懸液于離心管中，計(jì)數(shù)，取1×108個(gè)細(xì)胞，離心，棄上清，置室溫待用。
2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前10天，將骨髓瘤細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不斷搖晃，直至冷凍液完全溶解。離心，棄上清，懸浮于8-AG培養(yǎng)基中置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，換液，丟棄一部分細(xì)胞。融合前2～3天，將一瓶細(xì)胞傳至4瓶，并改用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
3)滋養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備；取一只6～8周齡的健康BALB/c小鼠，脫臼處死。按無菌操作規(guī)程，剪開皮膚(注意不要剪破腹膜)，用一次性的5ml注射器吸取5ml不完全培養(yǎng)基，注入小鼠腹腔，用無菌棉球輕揉腹部，慢慢抽回，如此反復(fù)兩次。吸出的細(xì)胞懸液置于離心管中，離心，棄上清。加入20ml HAT培養(yǎng)基，混勻，接種至兩塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，若滋養(yǎng)細(xì)胞貼壁良好且無污染，即可用于接種融合細(xì)胞。
4)細(xì)胞融合融合前一天將PEG/DMSO放于CO2培養(yǎng)箱中調(diào)整pH值和溫度。將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞和脾臟B淋巴細(xì)胞移至一個(gè)50ml離心管中，加30ml不完全培養(yǎng)基，離心，吸去上清。將離心管放在掌心搖動(dòng)，使細(xì)胞團(tuán)成松散的糊狀。將離心管置于37℃水浴中，吸取0.7ml預(yù)溫的PEG/DMSO溶液，在離管底約2cm處沿管壁慢慢加入細(xì)胞中，邊加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，1min加完。靜置1min，再吸取25ml不完全培養(yǎng)基，緩慢加入。邊加邊緩慢攪拌，先慢后快，前2min加入2ml，后2min加入剩余的培養(yǎng)基。離心，吸去上清。將細(xì)胞團(tuán)搖散，加入10ml HAT培養(yǎng)基，輕輕吹打，混勻。將融合細(xì)胞接種至已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5)雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)接種后第一天，加入HAT培養(yǎng)基100μl/孔，在第2，3，5，8和11天，各孔吸出半量培養(yǎng)上清，然后再加入新鮮HAT培養(yǎng)基100μl/孔。同時(shí)鏡下觀察細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況。
6)雜交瘤細(xì)胞的篩選融合后2周，ELISA法檢測(cè)各細(xì)胞培養(yǎng)孔上清液，方法同血清抗體檢測(cè)。篩選分泌目的抗體的陽性細(xì)胞克隆，以進(jìn)行克隆化。
7)陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選出陽性克隆后，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用不完全培養(yǎng)基按105、104、103、102對(duì)細(xì)胞作系列稀釋，然后取后者用HT培養(yǎng)基稀釋至10個(gè)/ml。取一塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，預(yù)先按每孔105～106個(gè)/100μl HT培養(yǎng)基加好滋養(yǎng)細(xì)胞，然后加入10個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，100μl/孔。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10天。在第2天和第5天分別加入HT培養(yǎng)基2滴/孔，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，對(duì)確為只有一個(gè)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的孔作好標(biāo)記。對(duì)抗體陽性的單克隆細(xì)胞，經(jīng)3～4次單細(xì)胞分離培養(yǎng)，直至抗體陽性的單克隆細(xì)胞培養(yǎng)孔達(dá)到100％，即可初步定株并命名。
實(shí)施例2抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆1.所用細(xì)胞株為本發(fā)明人采用上述方法獲得的一株高親和力、高特異性的抗Stx2A單克隆抗體5F3雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的抗體不與CT、LT等多種大腸桿菌腸毒素抗原結(jié)合，其分泌的抗體分子亞型為IgG1k。
2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5F3雜交瘤細(xì)胞(2×106)，采用異硫氰酸胍一步法(TaKaRa公司)提取總RNA，取少量進(jìn)行紫外分光光度計(jì)定量及1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。隨后以oligo(dT)15(TaKaRa公司)為隨機(jī)引物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。然后采用通用的兼并性引物(Amersham公司)特異性分別擴(kuò)增單抗5F3的輕、重鏈可變區(qū)基因。將含有可變區(qū)基因(VH，VL)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分離目的片段。通過膠回收試劑盒(Promega公司)純化目的片段后，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，參見附圖1-3。之后，將抗體輕、重鏈可變區(qū)基因克隆至pMD-18T載體，測(cè)序分析。
有關(guān)操作具體步驟如下1.總RNA提取(使用TaKaRa公司RNA提取試劑盒)1)取2×106雜交瘤細(xì)胞，加入1ml的Catrimox-14TM溶液，充分混勻。離心，3000rpm，5min。
2)除去溶液，加入1ml的DEPC處理H2O，上下顛倒混合數(shù)次后，離心，12,000rpm，2min。
3)除去溶液，激烈振蕩使沉淀松動(dòng)，加入1ml的2M LiCl溶液，激烈振蕩后，離心，12,000rpm，5min。
4)除去溶液，沉淀用70％的冷乙醇洗一次，溶于1ml的DEPC處理H2O中。
2.RT-PCR擴(kuò)增VH和VL1)以提取的總RNA為模板，oligo(dT)15(TaKaRa公司)為隨機(jī)引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈的方案如下總RNA 2μl10×RT-PCR緩沖液 1μldNTPs(10mmol/L) 1μlMgCl2(0.025mmol/L) 4μloligo(dT)15 Primer(2.5pmol/μl) 0.5μlAMV Reverse Transcriptase(5U/μl) 0.5μlRNase Inhibitor(40U/μl) 25μlRNase Free dH2O至終體積11μl，混合后加入石蠟油3滴。
反應(yīng)條件30℃，1min；42℃，0.5min；99℃，5min；5℃，5min；1個(gè)循環(huán)周期。
2)以第一鏈為模板采用如下PCR體系和程序擴(kuò)增VH和VL模板cDNA 11μl5×PCR緩沖液(含氯化鎂) 10μl輕、重鏈引物(0.025mmol/L)各 1μlEx Taq HS(5u/μl) 0.25μl加去離子水至終體積50μl，混合后加入礦物油3滴。
反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min后，94℃，0.5min；55℃，0.5min；72℃，1min；30個(gè)循環(huán)周期。
3.PCR產(chǎn)物的克隆采用TA克隆方法克隆PCR產(chǎn)物，方法見文獻(xiàn)(于永利，麻彤輝，楊貴貞TA克隆及雙鏈DNA測(cè)序，介紹一種快速克隆及分析PCR產(chǎn)物的方法，中國(guó)免疫學(xué)雜志，1994，10(1)5)。
4.PCR產(chǎn)物的序列分析將TA克隆轉(zhuǎn)化菌株送至公司，按常規(guī)方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果參見附圖5。
進(jìn)一步對(duì)所克隆的抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行序列分析如下
分別應(yīng)用下列二個(gè)數(shù)據(jù)庫http://imgt.cines.fr:8104/cgi-bin/IMGTnap.jvhttp://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/Blast.cgi對(duì)所得序列與現(xiàn)有已報(bào)道的其它各種抗體基因進(jìn)行同源性比較，并分析其胚系基因來源，結(jié)果如下1)5F3重鏈的胚系基因來源V-GENEAF304558 IGHVlS137*01；D-GENEIGHD-SP2.8*01；J-GENEIGHJ4*01；通過FR-IGMT and CDR-IGMT分析顯示CDR1GGT TGC TAC ATG CACCDR2TAT ATT AGT TGT TAC AAT GGT GCT ACT AGC TAC AAC CAG AAG TTCAAG GGC AAGCDR3AAG GGC TAC GGT AGT AGT CAT TAC TAT GCT ATG GAC TACNCBI中同源性比較結(jié)果顯示Request ID 1132707495-31830-19491971776.BLASTQ1Sequence producing significant alinmentsgi|11611970|gb|AF303832.1|AF303832 540 1e-150gi|38348519|ref|NM_198640.1| 433 3e-118gi|430841|gb|S66092.1| 408 1e-1102)5F3輕鏈的胚系基因來源V-GENEAJ235950 IGKV12-89*01；J-GENEV00777 IGKJ2*01；通過FR-IGMT and CDR-IGMT分析顯示CDR1AGG GCC AGC CAA AGT ATT AGC AAC AAC CTACDR2TAT GCT TCC CAG TCC ATC TCTCDR3CAA CAG AGT AAC AGC TGG CCT CTC ACGNCBI中同源性比較結(jié)果顯示Request ID Request ID 1132709610-9086-134297927386.BLASTQ4DatabaseALL GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase0，1or2 HTGS sequences)
gi|7529622|emb|AJ277215.1|MMU2772154e-164 585gi|63543416|ref|XM_620323.1| 9e-143 514gi|809057|emb|X86544.1|MMVL1B101e-112 414上述分析結(jié)果表明所獲得的抗Stx2A單克隆抗體5F3基因序列的確來自小鼠胚系基因，和現(xiàn)有報(bào)道的各種其它己知抗體基因序列均不完全一致，是屬于一種新的有功能的針對(duì)Stx2A的抗體基因。
實(shí)施例3抗Stx2A單克隆抗體的ScFv形式抗體的構(gòu)建和表達(dá)(使用Pharmacia公司ScFv表達(dá)試劑盒)將VH、VL和Linker(G4S)3引物等摩爾混合后，進(jìn)行聚合和填充反應(yīng)，使VH和VL藉LinkerDNA連接到一起，形成ScFvDNA。然后加入限制酶切位點(diǎn)引物，擴(kuò)增聚合的ScFv并在5′端引入Sfi I限制酶切位點(diǎn)，3′端引入Not I限制酶切位點(diǎn)?？寺≈粮脑斓姆置谛员磉_(dá)載體pCANTAB6His之中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HB2151中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)限制性酶切鑒定及DNA測(cè)序分析，證實(shí)基因構(gòu)建正確。親和層析純化表達(dá)蛋白后以SDS-PAGE電泳、Westem-blot等方法分析檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，參見附圖6。SDS-PAGE電泳和Western-blot分析表明ScFv基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為27KD，與理論預(yù)期值相符，并且可與相應(yīng)的抗原特異結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了抗Stx2單鏈抗體的原核分泌表達(dá)，為其在診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥中的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
有關(guān)操作具體步驟如下1.質(zhì)粒DNA抽提(使用Omega公司質(zhì)粒抽提試劑盒)1)挑取平板上分隔良好的菌落轉(zhuǎn)種于帶相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。
2)取菌液分裝于1.5mL離心管中，12000g離心3min，留取沉淀。
3)每管加100μL Solution I懸浮，充分振蕩混勻。
4)加入100μL Solution II，輕柔混勻，冰水浴5min。
5)加入250μL Solution III，輕振混勻，室溫放置10min。
6)4℃、12000g離心10min，將上清移至分離管中。
7)12000g離心1min，傾倒收集管中的廢液。
8)加入500μL washing buffer于分離管中，同上離心并棄去收集管中的廢液。重復(fù)洗滌一次。
9)12000g離心1min，使乙醇完全揮發(fā)。
10)將分離管置于另一干凈EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g離心1min。
11)取一定量洗脫液進(jìn)行電泳，其余置于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.瓊脂糖凝膠電泳1.0％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，120-150mA，電泳20-40分鐘。
50×TAE儲(chǔ)存液配方2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na2EDTA；用冰醋酸調(diào)節(jié)pH8.3。
3.質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)1)1μg質(zhì)粒DNA1μL 10×M緩沖液(見Takara公司產(chǎn)品說明書)1μL 限制性內(nèi)切酶Sfi I(10u/μL)用雙蒸水補(bǔ)齊至10μL反應(yīng)條件50℃反應(yīng)4h。
1)在上述反應(yīng)體系內(nèi)依次加入2μL 10×H緩沖液(見Takara公司產(chǎn)品說明書)1μL 限制性內(nèi)切酶NotI(10u/μL)用雙蒸水補(bǔ)齊至20μL反應(yīng)條件37℃反應(yīng)4h。
4.瓊脂糖電泳膠的目的DNA回收純化(Promega公司)在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的目的DNA電泳帶，移入1.5mL EP管。加入Omega公司膠回收試劑盒的DNA binding buffer，65℃水浴使凝膠完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之間。將溶膠液移入分離管，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。加入配套的Washing buffer，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。重復(fù)洗滌1次。12000g離心1min，分離管移置另一干凈1.5mL EP管，加入一定體積的TE buffer，65℃孵育10min，12000g離心1min，取一定量電泳，UVP紫外掃描儀檢測(cè)回收純化效果。
5.連接反應(yīng)(使用Takara公司連接試劑盒)通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)目的DNA片段和載體片段的濃度，根據(jù)外源片段與載體摩爾數(shù)比一般為1∶2～10的原則，設(shè)計(jì)連接反應(yīng)體系如下目的DNA 1μL質(zhì)粒載體 1～2μLligation solution 5μLddH2O 2～3μLTotal volume 10μL
16℃連接12-16h。
6.感受態(tài)菌的制備(CaCl2法)1)無菌接種環(huán)蘸取-70℃凍存的細(xì)菌保種液，三線法劃線接種于LB平板，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)。
2)挑取單個(gè)菌落接種于2mL LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)12～16h。
3)將過夜培養(yǎng)的DH5a按1％比例轉(zhuǎn)種至LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.2～0.4時(shí)，8000g離心5min收集細(xì)菌。
4)加入1mL預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸沉淀，冰水浴3h。4℃8000g離心5min，棄上清。加入100μL預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀，冰水浴1h，備用。
7.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化1)取感受態(tài)菌液100μL，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物；冰水浴60min，42℃水浴熱休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。
20加100μL LB培養(yǎng)液，37℃搖床培養(yǎng)1h。
3)以8000g離心10min，吸棄100μL上清后混勻沉淀，各取50μL涂布平板，37℃孵箱培養(yǎng)過夜。
2.高效表達(dá)融合蛋白工程菌的構(gòu)建及篩選將含ScFv基因的重組質(zhì)粒pCANTAB6His轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151并提取質(zhì)粒酶切鑒定?；蚬こ檀竽c桿菌HB2151的感受態(tài)菌制備、轉(zhuǎn)化及重組菌的質(zhì)粒抽提酶切鑒定同前。
取鑒定無誤的重組菌接種于3mL含Amp的LB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按1％的比例轉(zhuǎn)種于20mL含Amp的LB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)2.5小時(shí)，以IPTG誘導(dǎo)24h，SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)形式和表達(dá)量，篩選高效表達(dá)菌株。
實(shí)施例4抗Stx2A單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物中的應(yīng)用。
1.以本發(fā)明所述的輕、重鏈可變基因出發(fā)，可以重構(gòu)并表達(dá)多種形式的抗體藥物，可以直接用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥。例如1)嵌合抗體是用鼠單抗的V區(qū)與人IgG的C區(qū)連接而成為人-鼠嵌合抗體。由于其完整地保留了鼠單抗的特異性和親和力，同時(shí)降低了HAMA等不良反應(yīng)。
2)人源化抗體是針對(duì)可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸殘基修飾、骨架區(qū)交換、定位保留和表位導(dǎo)向選擇等從而降低了可變區(qū)的鼠源性同時(shí)又保持了鼠單抗的特異性和親和力。
3)小分子抗體主要有VH-CH1和VL-C1組成Fab抗體、用一多肽(Gly4Ser)3接頭連接VH基因和VL基因而成的單鏈抗體、由VH基因和VL基因以非共價(jià)鍵結(jié)合而成Fv片段抗體、由VH或VL一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成的單域抗體、由單個(gè)CDR構(gòu)成的最小識(shí)別單位等。
多價(jià)微型抗體主要有雙鏈抗體、(ScFv)2、(ScFv)4等。由于有多價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)，親和力高，分子大小適中等特點(diǎn)而具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
5)雙特異性抗體是一類具有雙重特異性和雙重功能的抗體，又稱雙功能抗體。
6)重組抗體融合蛋白把ScFv基因片段，與非抗體的毒素或酶等其它蛋白基因連接形成的具有特定的生物活性導(dǎo)向靶部位的一種重組蛋白。
7)噬菌體抗體把Ig的V區(qū)基因與絲狀噬菌體DNA上基因III或基因VIII連接轉(zhuǎn)染宿主菌后，使其在膜表面外殼蛋白表達(dá)ScFv的融合蛋白產(chǎn)物。通過對(duì)此產(chǎn)物多輪相關(guān)抗原的親和吸附，從中淘選出所需的更高親和力及更特異性的新抗體。
2.以本發(fā)明所述的抗Stx2A單克隆抗體5F3，可以用于1)O157菌超聲上清攻毒-抗Stx2A單克隆抗體5F3中和保護(hù)實(shí)驗(yàn)以致死劑量(LD100)的O157菌超聲上清液(總蛋白0.05mg)注入小鼠腹腔，同時(shí)每組動(dòng)物經(jīng)腹腔注射給予如下所示不同劑量的抗體中和液，對(duì)照組每只小鼠給予10mmol/L PBS，最后每只小鼠注射的總液體量為0.5ml，動(dòng)物分組如表1。觀察各組小鼠的死亡情況，在10天的觀察期后計(jì)算小鼠的死亡/生存率如表2。
表1

表2 O157菌超聲上清攻毒-抗Stx2A單克隆抗體5F3中和保護(hù)效果

結(jié)果顯示0.15mg純化后的抗Stx2A單克隆抗體5F3對(duì)攻毒小鼠的中和保護(hù)率達(dá)到80％。
結(jié)論抗Stx2A單克隆抗體5F3可針對(duì)O157菌超聲上清毒素攻毒小鼠產(chǎn)生有效中和保護(hù)作用。
2)腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157志賀樣毒素相關(guān)抗原的基礎(chǔ)研究，或用于發(fā)現(xiàn)新的志賀樣毒素相關(guān)抗原或已知志賀樣毒素抗原的新表位。這些抗原均可進(jìn)一步用于臨床血清學(xué)檢查，具有一定的臨床診斷意義。
3)由于單克隆抗體有同抗原特異結(jié)合的特性，可以對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行分離純化?，F(xiàn)有的方法從EHEC O157野生菌株中提純天然志賀樣毒素，存在方法煩瑣、得率低等缺陷。可將抗Stx2A單克隆抗體5F3直接連于固相載體上，以親和層析方法對(duì)志賀樣毒素Stx2A進(jìn)行有效的分離和純化。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>抗EHEC O157志賀樣毒素II毒素亞單位單克隆抗體5F3輕、重鏈可變區(qū)基因及應(yīng)用<160>4<210>1<211>378<212>DNA<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(378)
<400>1CCAGCCATGG CCCAGGTCCA ACTGCAGCAG TCAGGACCTG AGCTAGTGAA GACTGGGGCT 60TCAGTGAAGG TATCCTGCAA GGCTTCTGGT TACTCATTCA CTGGTTGCTA CATGCACTGG120GTCAAGCAGA GCCATGGAAA GAGCCTTGAG TGGATTGGAT ATATTAGTTG TTACAATGGT180GCTACTAGCT ACAACCAGAA GTTCAAGGGC AAGGCCACAT TTACTGTAGA CACATCCTCC240AGCACAGCCT ACATGCAGTT CAACAGCCTG ACATCTGAAG ACTCTGCGGT CTATTACTGT300GCAAGAAAGG GCTACGGTAG TAGTCATTAC TATGCTATGG ACTACTGGGG CCAAGGGACC360ACGGTCACCG TCTCCTCA 378<210>2<211>376<212>PRT<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(126)<400>2Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu1 5 10 15Val Lys Thr Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly20 25 30Thr Ser Phe Thr Gly Cys Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His35 40 45Gly Lys Ser Leu Glu Trp Iie Gly Tyr Iie Ser Cys Tyr Asn Gly50 55 60Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thy65 70 75Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Phe Asn Ser Leu80 85 90Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Tyr95 100 105Gly Ser Ser His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
110 115 120Thr Val Thr Val Ser Ser125<210>3<211>327<212>DNA<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(327)<400>3GACATCGAGC TCACTCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTGTGA CTCCAGGAGA TAGCGTCAGT 60CTTTCCTGCA GGGCCAGCCA AAGTATTAGC AACAACCTAC ACTGGTATCA ACAAAAATCA120CATGAGTCTC CAAGGCTTCT CATCAAGTAT GCTTCCCAGT CCATCTCTGG GATCCCCTCC180AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTCACTCTCA GTATCAACAG TGTGGAGACT240GAAGATTTTG GAATGTATTT CTGTCAACAG AGTAACAGCT GGCCTCTCAC GTTCGGTGCT300GGGACCAAGC TGGAGCTGAA ACGGGCG327<210>4<211>109<212>PRT<213>鼠<220>
<221>V-region<222>(1)...(109)
<400>4Asp Iie Glu Leu Tyr Gln Ser Pro Ala Tyr Leu Ser Val Tyr Pro1 5 10 15Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Iie Ser20 25 30Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg35 40 45Leu Leu Iie Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Iie Ser Gly Iie Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Iie65 70 75Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln80 85 90Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105Leu Lys Arg Ala
權(quán)利要求
1.抗EHEC O157志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，其基因序列是序列表1和序列表3所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的基因編碼的多肽，其具有序列表2和序列4所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的基因在制備用于診斷或治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的多肽在制備用于診斷或治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及抗腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157志賀樣毒素II毒素亞單位Stx2A單克隆抗體5F3重鏈和輕鏈可變區(qū)基因及其所述基因編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人采用通用的兼并性引物成功地從培養(yǎng)的一株抗Stx2A特異性單克隆抗體5F3的雜交瘤細(xì)胞株中克隆了其對(duì)應(yīng)抗體輕、重鏈可變區(qū)基因?；谏鲜龅膯慰寺】贵w5F3的輕、重鏈可變區(qū)基因，可以采用基因工程方法，構(gòu)建和表達(dá)多種形式的小分子基因工程抗體，如ScFv抗體、嵌合抗體、抗體融合蛋白等，制備用于診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥方面藥物，將對(duì)診斷和治療EHEC O157感染及其并發(fā)癥提供新的途徑。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1847397SQ200610054048
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2006年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者鄒全明, 馬穎, 毛旭虎, 楊珺 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)