一種免疫親和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種免疫親和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)，固相萃取柱已得到實(shí)驗(yàn)室廣泛地應(yīng)用。隨著固相萃取 技術(shù)的不斷發(fā)展，一種新型萃取柱一一免疫親和柱正悄然代替?zhèn)鹘y(tǒng)固相萃取柱。免疫親和 柱（IAC)基于抗原抗體反應(yīng)，利用生物大分子具有對(duì)一類(lèi)生物大分子特異識(shí)別和可逆結(jié)合 的特性而制作的一種分離萃取柱，具有獨(dú)特的選擇專(zhuān)一性和良好的吸附凈化性能。處理過(guò) 的樣品提取液在緩慢通過(guò)免疫親和柱時(shí)，樣品提取液中的分析物與柱內(nèi)的抗體結(jié)合，而未 被結(jié)合的其它雜質(zhì)經(jīng)洗滌后除去，再用洗脫液沖洗柱體，收集分析物。較傳統(tǒng)固相萃取柱， 免疫親和柱對(duì)目標(biāo)物的選擇性更強(qiáng)，吸附凈化效果更好，且所消耗的試劑更少。
[0003] 利用上述免疫親和柱進(jìn)行免疫親和時(shí)存在以下幾個(gè)問(wèn)題： 1.免疫親和由于使用抗體基質(zhì)代替?zhèn)鹘y(tǒng)固相填料，為保持柱內(nèi)抗體活性，需將抗體置 于活性液中。而目前免疫親和柱通常體積較小，無(wú)法有足夠的體積儲(chǔ)存活性液，且活性液經(jīng) 常存在溢出、漏液等情況。
[0004] 2.單根免疫親和柱的抗體數(shù)量是固定的，這也決定了單根免疫親和的可容納目標(biāo) 物濃度是有限的。當(dāng)目標(biāo)物超過(guò)柱內(nèi)抗體所能結(jié)合的抗原限度，將導(dǎo)致目標(biāo)物流失，無(wú)法有 效定量分析目標(biāo)物濃度。
[0005] 3.在使用免疫親和柱的過(guò)程中，常出現(xiàn)分析樣品液較混濁導(dǎo)致親和柱堵塞的現(xiàn) 象，影響親和柱的抗體抗原結(jié)合能力，甚至無(wú)法正常開(kāi)展淋洗、洗脫等后續(xù)步驟。
[0006] 上述因素限制了免疫親和柱的推廣使用和商品化，需要一種簡(jiǎn)單、有效的裝置來(lái) 解決這些問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種免疫親和方法。
[0008] 本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為： 本發(fā)明方法具體是： 首先根據(jù)分析對(duì)象的具體目標(biāo)物，在免疫親和柱中填充相對(duì)應(yīng)的抗體基質(zhì)，具體是：首 先在空柱腔中放入下篩板，接著填入抗體基質(zhì)，再放入上篩板，下壓上篩板使抗體基質(zhì)分布 均勻，并起到固定抗體填充區(qū)的作用。
[0009] 其次灌入抗體活性液保持抗體活性，活性液的最高液面低于免疫親和柱的最高液 面刻度線，擰緊上下堵頭，置于合適的環(huán)境溫度待使用。
[0010] 然后根據(jù)目標(biāo)物的濃度范圍，選擇單根免疫親和柱或者多根免疫親和柱組合使 用，確定免疫親和柱的根數(shù)；具體是：將要使用的免疫親和柱取出，去掉上下堵頭，固定免 疫親和柱于合適位置；待活性液全流出后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入待分析樣品液；確認(rèn)分析樣 品液全流出后，加入適量淋洗液，并將其擠干棄去。
[0011] 最后加入目標(biāo)物洗脫液，收集分析免疫親和柱流出的洗脫液。
[0012] 所述的免疫親和柱采用伸縮型螺旋組合式免疫親和柱，所述伸縮型螺旋組合式免 疫親和柱包括上堵頭、下堵頭和上樣管。
[0013] 所述上堵頭周向帶有外螺紋，上堵頭與上樣管進(jìn)口螺紋配合。
[0014] 所述下堵頭周向帶有內(nèi)螺紋，下堵頭與上樣管出口螺紋配合。
[0015] 所述上樣管包括進(jìn)口、柱腔和出口，進(jìn)口周向帶有內(nèi)螺紋，用于結(jié)合固定上堵頭或 者組合固定另一免疫親和柱的出口；出口周向帶有外螺紋，用于結(jié)合固定下堵頭或者組合 固定另一免疫親和柱的進(jìn)口。
[0016] 所述柱腔包括伸縮區(qū)和免疫親和區(qū)；伸縮區(qū)設(shè)置于進(jìn)口下方，免疫親和區(qū)位于出 口上方，免疫親和區(qū)內(nèi)從上至下設(shè)置有上篩板、抗體填充區(qū)和下篩板；在柱腔外壁標(biāo)識(shí)有最 高液面刻度線，該最高液面刻度線位于伸縮區(qū)下方。
[0017] 進(jìn)一步說(shuō)，若分析樣品較混濁，則擰緊上堵頭，擠壓伸縮區(qū)。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于： 1.伸縮型螺旋組合式免疫親和柱由于柱腔容量大，并配有上下兩堵頭擰于進(jìn)出口，提 高了活性液體積，增強(qiáng)了免疫親和的整體密封性，在保證有充足的抗體活性液同時(shí)，又達(dá)到 了防溢出、漏液等情況的出現(xiàn)。
[0019] 2.采用多根伸縮型螺旋組合式免疫親和柱方式，使免疫親和過(guò)程中的抗體數(shù)量成 倍數(shù)增長(zhǎng)，從根本上解決了免疫親和方法中的可容納目標(biāo)物濃度有限的問(wèn)題。
[0020] 3.伸縮型螺旋組合式免疫親和柱帶有伸縮區(qū)，在使用免疫親和過(guò)程中可將上堵頭 擰緊進(jìn)口，可通過(guò)側(cè)面擠壓或者向下壓縮伸縮區(qū)，增大柱腔內(nèi)壓力，達(dá)到提高柱腔溶液流速 和充分排除殘留液的目的，同時(shí)還可防止柱腔堵塞。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為本發(fā)明中伸縮型螺旋組合式免疫親和柱結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本發(fā)明中使用單根免疫親和柱示意圖； 圖3為本發(fā)明中使用多根免疫親和柱示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0023] 如圖1所示，伸縮型螺旋組合式免疫親和柱主要包括以下部分：上堵頭1、下堵頭 2、上樣管3。上堵頭1高L5-L 8 cm，具外翻螺紋，外徑0.8-0. 9 cm，螺旋式擰于上樣管進(jìn) 口；下堵頭2高L 6-2.0 cm，具內(nèi)陷螺紋，內(nèi)徑0.4-0. 5 cm，螺旋式擰于上樣管出口。上樣管 3高9. 0-10.0 cm，外壁材料為聚乙烯，包括進(jìn)口 4、柱腔5和出口 6。進(jìn)口 4高0· 9-1.0 cm， 具內(nèi)陷螺紋，內(nèi)徑為0.9-1. 0 cm，外徑1.0 -Ll cm，用于結(jié)合固定上堵頭1或者組合固定另 一免疫親和柱的出口 6。出口 6高0.9-1. 0 cm，具外翻螺紋，內(nèi)徑0· 1-0.2 cm，外徑0.3-0. 4 cm，用于結(jié)合固定下堵頭2或者組合固定另一免疫親和柱的進(jìn)口 4。柱腔5高7. 0-8.0 cm， 內(nèi)徑L 4-1. 5 cm，外徑L 5-1. 6 cm，可容納分析體積為6-7 mL，柱腔5包括伸縮區(qū)7、免疫 親和區(qū)8及最高液面刻度線9。伸縮區(qū)7設(shè)置于離進(jìn)口 4距為0.7-0. 8 cm，未伸縮高度為 I. 1-1. 2 cm，厚度偏薄，為0.1-0. 2 cm。免疫親和區(qū)8位于出口 6上方，高度L 3-1. 4 cm， 從上至下設(shè)置有上篩板10、抗體填充區(qū)11和下篩板12。最高液面刻度線9位于柱腔外壁 具伸縮區(qū)7下方0. 9-1. 0 cm。
[0024] 利用上述免疫親和柱，進(jìn)行免疫親和的方法： 根據(jù)分析對(duì)象的具體目標(biāo)物，填充相對(duì)應(yīng)的抗體基質(zhì)，具體是：首先在空柱腔中放入下 篩板，接著填入抗體基質(zhì)，再放入上篩板，下壓上篩板使抗體基質(zhì)分布均勻，并起到固定抗 體填充區(qū)的作用。
[0025] 然后灌入抗體活性液保持抗體活性，活性液的最高液面要低于免疫親和柱的最高 液面刻度線，擰緊上下堵頭，置于合適的環(huán)境溫度待使用。根據(jù)目標(biāo)物的濃度范圍，選擇單 根免疫親和柱或者多根組合使用，確定免疫親和柱的根數(shù)。將要使用的免疫親和柱取出，去 掉上下堵頭，固定免疫親和柱于合適位置(若是多根組合使用，優(yōu)先組合免疫親和柱)。待活 性液全流出后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入合適體積的待分析樣品液(若分析樣品較混濁，可擰緊上 堵頭，擠壓伸縮區(qū))。確認(rèn)分析樣品液全流出后，加入適量淋洗液，并將其擠干棄去。最后加 入合適的目標(biāo)物洗脫液，收集分析免疫親和柱流出的洗脫液。
[0026] 實(shí)施例：水產(chǎn)品中河豚毒素的免疫親和凈化應(yīng)用。
[0027] 將河豚毒素抗體填入到柱腔內(nèi)，高度為1. 2-1. 3 cm，蓋好篩板，并注入活性液，擰 緊上下堵頭，保存于〇_5°C環(huán)境，待使用。
[0028] 準(zhǔn)確稱(chēng)取已充分均質(zhì)馬面魚(yú)樣品2. 00 g于50 mL具塞離心管中，加入10 mL含有 1%乙酸的甲醇溶液，渦旋振蕩2 min，60°C水浴超聲提取15 min，冷卻至室溫后，6000 r/min 離心5 min。移取5 mL上清液至另一 50 mL離心管中，加入20 ml PBS溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)? mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7~8,待凈化。
[0029] 取出免疫親和柱，去掉上下堵頭，放出柱內(nèi)保存活性液后，上樣品液。上樣結(jié)束后， 用8 mL水淋洗親和柱，擠干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用4 mL含有1%乙酸 的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液于60°C氮?dú)獯蹈桑肐 mL流動(dòng)相定容溶解，經(jīng)0.22 μπι濾 膜后供液相色譜-質(zhì)譜分析。按照上述步驟平行測(cè)定6次，結(jié)果如表1所示。在1.50 Pg/ kg添加水平下，六次測(cè)定的平均回收率為96. 7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3. 24%。整個(gè)免疫親和凈 化過(guò)程耗時(shí)為30 min。
[0030] 表1利用免疫親和凈化測(cè)定水產(chǎn)品中河豚毒素的殘留量結(jié)果（/7=6)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用本發(fā)明方法能有效吸附目標(biāo)物，從而達(dá)到凈化的效果。同時(shí)整個(gè)凈 化過(guò)程時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0031] 以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，當(dāng)然不能以此來(lái)限定本發(fā)明之權(quán)利 范圍，因此依本發(fā)明要求所作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種免疫親和方法，其特征在于該方法具體是： 首先根據(jù)分析對(duì)象的具體目標(biāo)物，在免疫親和柱中填充相對(duì)應(yīng)的抗體基質(zhì)，具體是：首 先在空柱腔中放入下篩板，接著填入抗體基質(zhì)，再放入上篩板，下壓上篩板使抗體基質(zhì)分布 均勻，并起到固定抗體填充區(qū)的作用； 其次灌入抗體活性液保持抗體活性，活性液的最高液面低于免疫親和柱的最高液面刻 度線，擰緊上下堵頭，置于合適的環(huán)境溫度待使用； 然后根據(jù)目標(biāo)物的濃度范圍，選擇單根免疫親和柱或者多根免疫親和柱組合使用，確 定免疫親和柱的根數(shù)；具體是：將要使用的免疫親和柱取出，去掉上下堵頭，固定免疫親和 柱于合適位置；待活性液全流出后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入待分析樣品液；確認(rèn)分析樣品液全 流出后，加入適量淋洗液，并將其擠干棄去； 最后加入目標(biāo)物洗脫液，收集分析免疫親和柱流出的洗脫液； 所述的免疫親和柱采用伸縮型螺旋組合式免疫親和柱，所述伸縮型螺旋組合式免疫親 和柱包括上堵頭、下堵頭和上樣管； 所述上堵頭周向帶有外螺紋，上堵頭與上樣管進(jìn)口螺紋配合； 所述下堵頭周向帶有內(nèi)螺紋，下堵頭與上樣管出口螺紋配合； 所述上樣管包括進(jìn)口、柱腔和出口，進(jìn)口周向帶有內(nèi)螺紋，用于結(jié)合固定上堵頭或者組 合固定另一免疫親和柱的出口；出口周向帶有外螺紋，用于結(jié)合固定下堵頭或者組合固定 另一免疫親和柱的進(jìn)口； 所述柱腔包括伸縮區(qū)和免疫親和區(qū)；伸縮區(qū)設(shè)置于進(jìn)口下方，免疫親和區(qū)位于出口上 方，免疫親和區(qū)內(nèi)從上至下設(shè)置有上篩板、抗體填充區(qū)和下篩板；在柱腔外壁標(biāo)識(shí)有最高液 面刻度線，該最高液面刻度線位于伸縮區(qū)下方。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免疫親和方法，其特征在于：若分析樣品較混池，則擰緊 上堵頭，擠壓伸縮區(qū)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種免疫親和方法。本發(fā)明首先根據(jù)分析對(duì)象的具體目標(biāo)物，在免疫親和柱中填充相對(duì)應(yīng)的抗體基質(zhì)。其次灌入抗體活性液保持抗體活性，活性液的最高液面低于免疫親和柱的最高液面刻度線，擰緊上下堵頭，置于合適的環(huán)境溫度待使用。然后根據(jù)目標(biāo)物的濃度范圍，選擇單根免疫親和柱或者多根免疫親和柱組合使用，確定免疫親和柱的根數(shù)。最后加入目標(biāo)物洗脫液，收集分析免疫親和柱流出的洗脫液。所述的免疫親和柱采用伸縮型螺旋組合式免疫親和柱。本發(fā)明提高了活性液體積，增強(qiáng)了免疫親和的整體密封性，在保證有充足的抗體活性液同時(shí)，又達(dá)到了防溢出、漏液等情況的出現(xiàn)。
【IPC分類(lèi)】G01N30/02, G01N33/53, G01N30/60
【公開(kāi)號(hào)】CN105136915
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510396382
【發(fā)明人】張小軍, 嚴(yán)忠雍, 喻亮, 李佩佩, 方益, 祝銀
【申請(qǐng)人】浙江省海洋水產(chǎn)研究所
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月8日