凝血因子Ⅸ質(zhì)控品制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及臨床凝血檢驗(yàn)制劑的制備方法，具體凝血因子IX質(zhì)控品制備方法，用抗人凝血因子IX單克隆抗體免疫親和層析柱將多人份混合血漿進(jìn)行親和層析，去除多人份混合血漿中的凝血因子IX即為缺乏凝血因子IX血漿；再將多人份混合血漿與缺乏凝血因子IX血漿按照一定比例混合，制備成凝血因子IX含量為不同濃度水平的凝血因子IX質(zhì)控品，加入凍干保護(hù)劑，分裝，冷凍干燥，獲得凝血因子IX質(zhì)控品。本發(fā)明制備的凝血因子IX質(zhì)控品，其產(chǎn)品均一性、穩(wěn)定性及凍干品復(fù)融后穩(wěn)定性好，可代替進(jìn)口產(chǎn)品用于凝血因子IX檢測的質(zhì)量控制，有利于降低檢測成本，提升我國對凝血因子IX檢測的能力。
【專利說明】凝血因子IX質(zhì)控品制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床凝血檢驗(yàn)制劑的制備方法，具體凝血因子IX質(zhì)控品制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]凝血因子IX測定具有重要的臨床意義。隨著凝血因子IX活性檢驗(yàn)項(xiàng)目不斷拓展到疾病診斷和治療中的各個(gè)領(lǐng)域，使用凝血因子IX質(zhì)控品對凝血因子IX活性檢測進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)就顯得尤其重要。目前針對凝血因子IX檢測的試劑、儀器較多，不同的試劑和檢測儀器、檢測原理各不相同，導(dǎo)致其結(jié)果差別很大。無論采用何種方法，進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控和參加室間質(zhì)評(píng)是保障檢測結(jié)果具有良好重復(fù)性和可比性的必要手段，而這些質(zhì)量保證措施的開展都離不開凝血因子IX質(zhì)控品。
[0003]目前臨床實(shí)驗(yàn)室使用的凝血質(zhì)控物通常為多參數(shù)凝血質(zhì)控品，其異常值凝血質(zhì)控品除凝血因子IX水平異常外其它參數(shù)也為異常，難以保證病理性樣本凝血因子IX測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)也難以保證凝血因子IX室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)的有效性。
[0004]國內(nèi)凝血質(zhì)控品幾乎被國外試劑廠商壟斷，產(chǎn)品價(jià)格昂貴且水平單一，無法滿足臨床檢驗(yàn)多活性水平的需求，因此，研發(fā)生產(chǎn)國內(nèi)自主品牌的多個(gè)濃度水平的凝血因子IX質(zhì)控品迫在眉睦。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種制備凝血因子IX質(zhì)控品的方法及獲得凝血因子IX質(zhì)控品。本發(fā)明方法制備的凝血因子IX質(zhì)控品為凝血因子IX多個(gè)濃度水平，且其它凝血因子含量在正常范圍；該產(chǎn)品均一性和穩(wěn)定性較好，滿足臨床對凝血因子IX質(zhì)控品檢驗(yàn)的質(zhì)量控制要求。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:凝血因子IX質(zhì)控品制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)將人靜脈采集的血液與抗凝劑以體積比為9:1加入混合，在2°C?8°C條件下離心15分鐘，相對離心力為2500g，分離吸取上層血漿，將多人份血漿混合，即得多人份混合血漿；抗凝劑為枸櫞酸三鈉溶液，其濃度為0.109mol/L?0.129mol/L。
[0008](2)免疫親和層析柱預(yù)先用緩沖液在10°C?18°C條件下平衡，緩沖液包括
0.02mol/L Tris,0.15mol/L NaCl、8mmol/L MgCl2, pH7.25。
[0009](3)原料血漿加入MgCl2后，原料血漿中MgCl2濃度為4.5?5.5mmol/L。上免疫親和層析柱，收集免疫親和層析柱下方流出的血漿，即為缺乏凝血因子IX血漿。
[0010](4)將缺乏凝血因子IX血漿與多人份混合血漿按照要求比例混合，即可制備成不同濃度水平的凝血因子IX質(zhì)控品。
[0011](5)將制備的凝血因子IX質(zhì)控品加入凍干保護(hù)劑，分裝，冷凍干燥。加入的凍干保護(hù)劑，包括質(zhì)量比例占凝血因子IX質(zhì)控品的0.5?1.5% HepesU?5%甘氨酸、0.5?
5%甘露醇。
[0012]本發(fā)明提供的凝血因子IX質(zhì)控品制備方法，用抗人凝血因子IX單克隆抗體免疫親和層析柱將多人份混合血漿進(jìn)行親和層析，去除多人份混合血漿中的凝血因子IX即為缺乏凝血因子IX血漿；再將多人份混合血漿與缺乏凝血因子IX血漿按照一定比例混合，制備成凝血因子IX含量為不同濃度水平的凝血因子IX質(zhì)控品，加入凍干保護(hù)劑，分裝，冷凍干燥，獲得凝血因子IX質(zhì)控品。
[0013]本發(fā)明提供的制備方法中，抗人凝血因子IX單克隆抗體免疫親和層析柱的制備方法為將一種能夠高度特異性的連接凝血因子IX的單克隆抗體偶聯(lián)至經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B瓊脂糖凝膠上,組成免疫親和層析柱。在Mg2+存在的條件下，當(dāng)血衆(zhòng)通過該免疫親和層析柱時(shí)，唯獨(dú)凝血因子IX被吸附，其他凝血因子的活性基本未變。
[0014]本發(fā)明制備的凝血因子IX質(zhì)控品，其產(chǎn)品均一性、穩(wěn)定性及凍干品復(fù)融后穩(wěn)定性好，可代替進(jìn)口產(chǎn)品用于凝血因子IX檢測的質(zhì)量控制，有利于降低檢測成本，提升我國對凝血因子IX檢測的能力。

【具體實(shí)施方式】
[0015]結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
[0016]實(shí)施例以制備活性為30%的凝血因子IX質(zhì)控品為例。
[0017](I)將人靜脈采集的血液與抗凝劑以體積比為9: I加入混合，在2°C~8°C條件下離心15分鐘，相對離心力為2500g，分離吸取上層血漿，將多人份血漿混合，即得多人份混合血漿；抗凝劑為枸櫞酸三鈉溶液，其濃度為0.109mol/L~0.129mol/L。
[0018](2)免疫親和層析柱預(yù)先用緩沖液在10°C~18°C條件下平衡，緩沖液包括
0.02mol/L Tris,0.15mol/L NaCl、8mmol/L MgCl2, pH7.25。
[0019](3)原料血漿加入MgCl2后，原料血漿中MgCl2濃度為4.5~5.5mmol/L。上免疫親和層析柱，收集免疫親和層析柱下方流出的血漿，即為缺乏凝血因子IX血漿。
[0020](4)將缺乏凝血因子IX血漿與多人份混合血漿按照要求比例混合，制備凝血因子IX活性為30%左右濃度水平的凝血因子IX質(zhì)控品。
[0021](5)將制備的凝血因子IX質(zhì)控品加入凍干保護(hù)劑。保護(hù)劑包括1% !fepes、2%甘氨酸、2%甘露醇。進(jìn)行分裝,冷凍干燥。
[0022]產(chǎn)品性能檢驗(yàn)測試:
[0023](I)產(chǎn)品活性檢測
[0024]用Sysmex CA-1500全自動(dòng)血凝儀及配套凝血因子IX檢測試劑對實(shí)施例凝血因子IX質(zhì)控品活性進(jìn)行檢測。
[0025] 表1凝血因子IX質(zhì)控品的凝血因子活性測定表
[0026]

【權(quán)利要求】
1.凝血因子IX質(zhì)控品制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將人靜脈采集的血液與抗凝劑以體積比為9: I加入混合，在2°C?8°C條件下離心，分離吸取上層血漿，將多人份分離后的上層血漿混合，即得多人份混合血漿； (2)免疫親和層析柱預(yù)先用緩沖液在10°C?18°C條件下平衡； (3)原料血漿加入MgCl2后，原料血漿中MgCl2濃度為4.5?5.5mmol/L,上免疫親和層析柱，收集免疫親和層析柱下方流出的血漿，即為缺乏凝血因子IX血漿； (4)將缺乏凝血因子IX血漿與多人份混合血漿按照要求比例混合，即制備成不同濃度水平的凝血因子IX質(zhì)控品； (5)將制備的凝血因子IX質(zhì)控品加入凍干保護(hù)劑，分裝，冷凍干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血因子IX質(zhì)控品制備方法，其特征在于:所述的抗凝劑為枸櫞酸三鈉溶液，濃度為0.109mol/L?0.129mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血因子IX質(zhì)控品制備方法，其特征在于:所述的緩沖液包括0.02mol/L Tris,0.15mol/L NaCl、8mmol/L MgCl2, pH7.25。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝血因子IX質(zhì)控品制備方法，其特征在于:所述的凍干保護(hù)劑包括質(zhì)量比例占凝血因子IX質(zhì)控品的0.5?1.5% HepesU?5%甘氨酸、0.5?5%甘露醇。
【文檔編號(hào)】G01N33/96GK104181313SQ201410449813
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】林方昭, 肖小璞, 高翠華, 肖玲, 肖薇, 王海齡 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所, 成都協(xié)和生物技術(shù)有限責(zé)任公司