流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本案涉及流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，包括：將采集到的雞靜脈血加入到等體積的分離劑中混合3?6min；200?500rpm離心，去上清，得到雞紅細(xì)胞；采用磷酸緩沖液洗滌所獲得的雞紅細(xì)胞；將雞紅細(xì)胞分散于保存液中。本案中的雞紅細(xì)胞制備方法僅需兩步即可完成，可作為很好的產(chǎn)品開發(fā)方案；將逐步改變國(guó)內(nèi)流式細(xì)胞儀用試劑對(duì)進(jìn)口試劑的依賴，大大降低流式細(xì)胞儀的應(yīng)用成本；與此同時(shí)，該試劑的大量生產(chǎn)可推動(dòng)臨床腫瘤倍體檢測(cè)的方便進(jìn)行，提高腫瘤治療質(zhì)量；所獲得的雞紅細(xì)胞產(chǎn)品可在常溫下可至少保存3個(gè)月，4℃下則可保存至少1年以上，且所有試劑均可在帶菌條件下進(jìn)行，從而避免了無(wú)菌操作的復(fù)雜步驟，降低細(xì)胞制備成本。
【專利說明】
流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測(cè)用試劑領(lǐng)域，具體涉及一種流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流式細(xì)胞儀是目前生命科學(xué)領(lǐng)域最先進(jìn)的儀器之一，可高通量的提供細(xì)胞多級(jí)信 息。為保證準(zhǔn)確性，流式細(xì)胞儀在使用前均需使用標(biāo)準(zhǔn)試劑進(jìn)行校準(zhǔn)，但在實(shí)際使用中，流 式細(xì)胞儀需要采用校準(zhǔn)試劑來進(jìn)行校準(zhǔn)與穩(wěn)定性分析，之后才能進(jìn)行樣品檢測(cè)。雞紅細(xì)胞 是早期流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)與穩(wěn)定性評(píng)估的主要試劑之一，即便在更穩(wěn)定的微球質(zhì)控品出現(xiàn) 后，其仍可被用于流式細(xì)胞儀的粗略校準(zhǔn)，從而節(jié)省微球的用量，降低儀器應(yīng)用成本。同時(shí)， 由于雞紅DNA含量穩(wěn)定為正常人體細(xì)胞的1/3，可在流式細(xì)胞儀上與人正常細(xì)胞或超二倍體 細(xì)胞峰完全分開，因而可被用于檢測(cè)腫瘤的診斷及判定預(yù)后。然而目前市售的流式細(xì)胞儀 用雞紅細(xì)胞主要來至于進(jìn)口，價(jià)格昂貴且供貨周期長(zhǎng)。給流式細(xì)胞儀的應(yīng)用來了很多不便。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)公開的雞紅細(xì)胞產(chǎn)品開發(fā)方案，有限的文獻(xiàn)報(bào)道中所提供的制備 方法往往傾向于僅采用磷酸緩沖鹽溶液洗滌及離心的方法進(jìn)行，但采用這種手段獲得的產(chǎn) 品在流式細(xì)胞儀上的分辨率較低，僅能用于粗略校準(zhǔn)，且受限于不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，各研究組 的檢測(cè)結(jié)果也有所差別，無(wú)法作為產(chǎn)品開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅 細(xì)胞的制備方法，其能夠作為一種標(biāo)準(zhǔn)方法，方便而穩(wěn)定地制備雞紅細(xì)胞，從而配合流式細(xì) 胞儀使用，并可作為產(chǎn)品開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其包括：
[0007] 將采集到的雞靜脈血加入到等體積的分離劑中混合3_6min;
[0008] 200-500rpm離心，去上清，得到雞紅細(xì)胞；
[0009] 采用磷酸緩沖液洗滌所獲得的雞紅細(xì)胞；
[0010] 將雞紅細(xì)胞分散于保存液中。
[0011] 優(yōu)選的是，所述的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其中，所述分離劑包括 有0.01-0.0511的他2冊(cè)04、0.01-0.0511的他112?04、0.5-2￥七％的葡萄糖、6-12￥七％的右旋糖 酐、0. l-0.3wt%的乙二胺四乙酸二鈉、0.1-lwt%的甘氨酸、l-3wt%的甘草酸和0.1-0.3wt%的月桂醇聚氧乙稀醚。
[0012] 優(yōu)選的是，所述的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其中，所述保存液包括 有l(wèi)-2wt%的甘油、0.1-0.3￥七％的疊氮鈉、3-5￥七％的多聚甲醛、0.1-0.3￥七％的曲拉通和 0.01_0.03wt%的聚氧乙稀醚。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其中，所述分離劑的pH 為7.3-7.5。
[0014]優(yōu)選的是，所述的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其中，所述保存液還包 括有0.01 -0.03wt %的脫氫乙酸鈉。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 1、本案中的雞紅細(xì)胞制備方法僅需兩步即可完成，同時(shí)所獲得的產(chǎn)品可長(zhǎng)期保 存，因此可很好的作為產(chǎn)品開發(fā)方案。
[0017] 2、逐步改變國(guó)內(nèi)流式細(xì)胞儀用試劑對(duì)進(jìn)口試劑的依賴，大大降低流式細(xì)胞儀的應(yīng) 用成本。與此同時(shí)，該試劑的大量生產(chǎn)可推動(dòng)臨床腫瘤倍體檢測(cè)的方便進(jìn)行，提高腫瘤治療 質(zhì)量。
[0018] 3、本方法中所獲得的雞紅細(xì)胞產(chǎn)品可在常溫下可至少保存3個(gè)月，4°C下則可保存 至少1年以上，且所有試劑均可在帶菌條件下進(jìn)行，從而避免了無(wú)菌操作的復(fù)雜步驟，降低 細(xì)胞制備成本。
【附圖說明】
[0019] 圖1是采用流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法所獲雞紅細(xì)胞的400倍顯微鏡 圖。
[0020] 圖2是采用流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法所獲雞紅細(xì)胞的200倍顯微鏡 圖。
[0021] 圖3是采用流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法所獲的雞紅細(xì)胞在常溫下保存 90天后的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；圖3表明雞紅細(xì)胞即便在保存了90天后，依然具備很好的 校準(zhǔn)性能。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0023] 本案列出一實(shí)施例的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其包括：
[0024]將采集到的雞靜脈血加入到等體積的分離劑中混合3-6min;
[0025] 200-500rpm離心，去上清，得到雞紅細(xì)胞；
[0026]采用磷酸緩沖液洗滌所獲得的雞紅細(xì)胞；
[0027]將雞紅細(xì)胞分散于保存液中。
[0028] 其中，分離劑包括有0.01-0.051的恥2冊(cè)04、0.01-0.051的恥112?04、0.5-2￥七％的葡 萄糖、6-12wt%的右旋糖酐、0.1-0.3￥七％的乙二胺四乙酸二鈉、0.1-1%的甘氨酸、1-3￥七％ 的甘草酸和〇.卜〇.3wt%的月桂醇聚氧乙烯醚，其余為水。Na 2HP〇4和NaH2P〇4起到緩沖液的 作用，使pH值維持在7.3-7.5之間；葡萄糖在這里的作用是能量試劑，用于給細(xì)胞供給能量； 右旋糖酐在這里的作用是為了讓紅細(xì)胞沉降，與白細(xì)胞分離；乙二胺四乙酸二鈉是一種細(xì) 胞分散試劑;甘氨酸是細(xì)胞膜表面蛋白的穩(wěn)定劑;甘草酸在這里是一種抗氧化劑，其主要用 于治療細(xì)胞在分離過程中易發(fā)生的過氧化損傷；月桂醇聚氧乙烯醚作為一種抗震保護(hù)劑， 主要作用在于降低分離過程中存在的切削力損傷。
[0029] 在上述實(shí)施例中，保存液包括有l(wèi)_2wt %的甘油、0 ? 1-0 ? 3wt %的疊氮鈉、3_5wt % 的多聚甲醛、o.l-o. 3wt%的曲拉通和0.01-0.03wt%聚氧乙烯醚，其余為水。甘油的作用有 兩點(diǎn)：1)細(xì)胞膜保護(hù)劑，甘油可以增加溶液粘度，從而降低對(duì)細(xì)胞的震蕩，同時(shí)，它降低體系 極性，保持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和膜上蛋白的穩(wěn)定性;2)防震劑，其主要用于在運(yùn)輸過程中減小 因震蕩造成的細(xì)胞損壞。疊氮鈉在這里是一種抗菌劑與防腐劑;多聚甲醛是一種固定劑，其 通過使細(xì)胞膜表面蛋白變性來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞的構(gòu)型不會(huì)再發(fā)生變化。曲拉通的作用是： 1)細(xì)胞膜通透劑，其可在細(xì)胞膜上制造小孔，方便染色劑進(jìn)入;2)防震劑，其主要用于在運(yùn) 輸過程中減小因震蕩造成的細(xì)胞損壞。聚氧乙烯醚作用則為穩(wěn)定細(xì)胞骨架及緩解固定劑對(duì) 細(xì)胞的損傷，同時(shí)具有穩(wěn)定染色效果，使流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果保持在穩(wěn)定范圍內(nèi)。
[0030]在上述實(shí)施例中，分離劑的pH優(yōu)選為7.3-7.5。
[0031]作為本案另一實(shí)施例，其中，保存液還優(yōu)選包括有0.01-0.03wt%的脫氫乙酸鈉。 脫氫乙酸鈉是一種防變質(zhì)劑，其用于在運(yùn)輸過程中，當(dāng)冷藏系統(tǒng)發(fā)生意外故障時(shí)，儲(chǔ)藏溫度 會(huì)升高，脫氫乙酸鈉可以用于短期內(nèi)保證細(xì)胞不發(fā)生變質(zhì)，但其所能承受的防變質(zhì)溫度上 限為40°C，若不添加脫氫乙酸鈉，正常的雞紅細(xì)胞在40°C下僅能保持5分鐘的有效性，而當(dāng) 添加脫氫乙酸鈉后，其維持時(shí)間可以達(dá)到半小時(shí)，以此來爭(zhēng)取到足夠的時(shí)間對(duì)冷藏系統(tǒng)進(jìn) 行修復(fù)或?qū)﹄u紅細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)急轉(zhuǎn)移處理。但脫氫乙酸鈉的用量應(yīng)被限制，若超出優(yōu)選的范 圍，將會(huì)抑制曲拉通對(duì)細(xì)胞膜的通透作用。
[0032]將得到的雞紅細(xì)胞進(jìn)行碘化丙啶染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CV值在6%以下的，可 用于后續(xù)試驗(yàn)。
[0033] 對(duì)比試驗(yàn)：
[0034] (1)在上述實(shí)施例（未添加脫氫乙酸鈉）中，將曲拉通替換為同比例的SDS(十二烷 基硫酸鈉)或吐溫：
[0036] (2)在上述實(shí)施例（未添加脫氫乙酸鈉）中，將多聚甲醛替換為同比例的戊二醛、甲 醛或70 %冰乙醇：
[0039]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列 運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括： 將采集到的雞靜脈血加入到等體積的分離劑中混合3-6min; 200-500rpm離心，去上清，得到雞紅細(xì)胞； 采用磷酸緩沖液洗滌所獲得的雞紅細(xì)胞； 將雞紅細(xì)胞分散于保存液中。2. 如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述分離 劑包括有0.01-0.051的恥2冊(cè)04、0.01-0.051的恥!12?04、0.5-2￥七％的葡萄糖、6-12￥七％的右 旋糖酐、〇 · I-O · 3wt %的乙二胺四乙酸二鈉 、O · I - Iwt %的甘氨酸、I -3wt %的甘草酸和O · 1 - 0.3wt%的月桂醇聚氧乙稀醚。3. 如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述保存 液包括有I_2wt %的甘油、0 · I-0 · 3wt %的疊氮鈉、3-5wt %的多聚甲醛、0 · I-0 · 3wt %的曲拉 通和0.01_0.03wt%的聚氧乙稀醚。4. 如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述分離 劑的 pH 為 7.3-7.5。5. 如權(quán)利要求3所述的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)用雞紅細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述保存 液還包括有0.01 -0.03wt %的脫氫乙酸鈉。
【文檔編號(hào)】G01N15/10GK105928753SQ201610242531
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月18日
【發(fā)明人】殷建, 陳名利, 田晶晶, 白鵬利, 尹煥才, 王鈞
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所