金黃色葡萄球菌腸毒素b的b細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及來(lái)自金黃色葡萄球菌腸毒素B的三個(gè)B細(xì) 胞免疫優(yōu)勢(shì)表位、鑒定此B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位的方法以及其在醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus)，作為革蘭氏陽(yáng)性菌的代 表，是一類(lèi)在自然界廣泛存在的致病性球菌，也是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的一種重要致 病菌。調(diào)查研宄表明，在美國(guó)，社區(qū)皮膚及軟組織感染最常見(jiàn)的病原菌為S. aureus(約占 75% );在日本，膿皰病中S. aureus引發(fā)的大皰性膿包病占的92% ;在非洲，熱帶膿性肌炎 病原體中S. aureus占55%~72%;在中國(guó)，感染性心內(nèi)膜炎的頭號(hào)致病菌為S. aureus (占 31%~34% )。此外，S. aureus感染以急性、化膿性為特征，局部可引起皮膚和軟組織等的 化膿性感染，經(jīng)久不愈；全身可導(dǎo)致骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、膿毒血癥等嚴(yán) 重感染及并發(fā)癥，死亡率高達(dá)20%。同時(shí)，金葡菌的外毒素還可引起食物中毒、燙傷樣皮膚 綜合征和中毒性休克綜合征等全身致死性感染。
[0003] 金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在含有血液和葡萄糖 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)更佳，需氧或兼性厭氧。28°c~38°C均能生長(zhǎng)，最適溫度為37°C，pH為 4. 8~9. 4,最適為7. 4。耐鹽性強(qiáng)，在含10%~15%氯化鈉培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)。在血脂平 板上形成的菌落較大，菌落周?chē)纬擅黠@的全透明溶血環(huán)（0 _溶血），溶血性菌株具有較 強(qiáng)致病性。按照噬菌體分型，金黃色葡萄球菌可分為5群26個(gè)型。噬菌體分型在流行病學(xué) 調(diào)查時(shí)追蹤傳染源及研宄菌型與疾病種類(lèi)間的關(guān)系上均有重要意義。腸毒素型食物中毒由 III和IV群金黃色葡萄球菌引起，II群菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的速度比I和IV群緩慢很多。 造成醫(yī)院感染嚴(yán)重流行的是I群中的52、52A、80和81型菌株。引起皰瘆性和剝脫性皮炎 的菌株經(jīng)常是II群71型。
[0004] 金黃色葡萄球菌耐熱性腸毒素（Staphylococcal enterotoxin，SE)，是引起人類(lèi) 食物中毒、全身炎癥反應(yīng)和膿毒癥休克的主要原因，也是金黃色葡萄球菌疫苗研宄最重要 的保護(hù)性抗原之一。SE因血清型差異SE分為SEA、SEB及SEC等多種型，每株臨床MRSA分 離株可分泌1 _2種腸毒素，其中SEB，SEC及TSST-1最豐富。每株金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生一 型或兩型以上的腸毒素。近年發(fā)現(xiàn)，造成醫(yī)院感染的耐甲氧西林金葡菌，80%以上產(chǎn)生腸毒 素 B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)。個(gè)別醫(yī)院分離株幾乎 100%產(chǎn) SEB。
[0005] 金葡菌SEB屬于超抗原，不需要抗原呈遞細(xì)胞的加工處理，以完整的蛋白質(zhì)分子 直接與在MHC II類(lèi)分子的a #吉構(gòu)域和TCR的0鏈V區(qū)結(jié)合，從而刺激T細(xì)胞活化增殖， 釋放大量細(xì)胞因子如IL-2、IFN-Y及TNF-a。由金葡菌SEB引起的中毒性休克綜合征的 病死率可達(dá)50 %，而與流感并發(fā)的金葡菌SEB感染其死亡率可達(dá)90 %以上，因此，氣溶膠中 的金葡菌SEB是一種潛在的生化武器。當(dāng)SEB進(jìn)入機(jī)體后，其超抗原的結(jié)合引起單個(gè)核細(xì) 胞活化，導(dǎo)致廣泛的細(xì)胞因子釋放，而早期的TCR- a 0 T細(xì)胞釋放的TNF- a對(duì)死亡的發(fā)生 起了重要的作用。
[0006] 經(jīng)Blast比對(duì)證實(shí)，SEB在MRSA各菌株中序列保守，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在小鼠模型中的研 宄證實(shí)，SEB具有比其他抗原更好的體液應(yīng)答優(yōu)勢(shì)，合成的人SEB單克隆抗體可預(yù)防MRSA感 染常見(jiàn)的毒性休克綜合癥。但SEB本身為毒素，用于人體存在安全隱患，因此，失去毒性的 突變體SEB是MRSA疫苗較好的保護(hù)性抗原。目前，SEB突變體疫苗用于SEB中毒及抗MRSA 感染已在動(dòng)物模型中獲得成功。
[0007] 蛋白抗原發(fā)揮其功能主要通過(guò)表位來(lái)體現(xiàn)特異性。用SEB表位中的優(yōu)勢(shì)表位來(lái)制 備疫苗，有利于去除不利成份，增強(qiáng)免疫效果。因此，SEB抗原中免疫優(yōu)勢(shì)應(yīng)答的保護(hù)性表 位的鑒定，是提升和優(yōu)化基于SEB抗原的S.aureus疫苗設(shè)計(jì)的重要前提。篩選SEB的多個(gè) 免疫優(yōu)勢(shì)表位，將各抗原的表位進(jìn)行串聯(lián)所得到多表位多肽疫苗可以激發(fā)更有效的免疫應(yīng) 答。目前的已知的SEB的B細(xì)胞表位有5個(gè)，所用的篩選方法主要是生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和單 克隆抗體篩選。用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)抗原的B細(xì)胞表位準(zhǔn)確率不高，預(yù)測(cè)出的表位僅局限于 特定長(zhǎng)度的肽段，無(wú)法預(yù)測(cè)免疫優(yōu)勢(shì)表位。研宄也證實(shí)，實(shí)驗(yàn)所得的B細(xì)胞表位與生物信息 學(xué)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果并不一致。用單克隆抗體篩選抗原的B細(xì)胞表位步驟繁瑣，試驗(yàn)周期長(zhǎng)， 所鑒定的抗原B細(xì)胞表位的不全，也無(wú)法鑒定免疫優(yōu)勢(shì)表位。因此，建立一種準(zhǔn)確有效的篩 選及鑒定B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位的方法顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌腸毒素B的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽，其氨基酸序 列如SEQID NO:35所示。其對(duì)應(yīng)的核心表位的氨基酸序列分別如SEQID NO:54所示。
[0009] 本發(fā)明提供一種鑒定所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽的 方法，其主要包含步驟：
[0010] 1)用金黃色葡萄球菌腸毒素B的突變體免疫小鼠獲得抗血清；
[0011] 2)步移合成覆蓋金黃色葡萄球菌腸毒素B全長(zhǎng)序列的重疊18肽；
[0012] 3)用步驟1)所得的抗血清結(jié)合步驟2)所得的重疊18肽篩選金黃色葡萄球菌腸 毒素B的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽；
[0013] 4)用步驟3)所篩得的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽與鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)，所得偶聯(lián)物用 于動(dòng)物免疫，獲得免疫優(yōu)勢(shì)肽抗血清；所述免疫優(yōu)勢(shì)表位抗血清進(jìn)行金黃色葡萄球菌腸毒 素B的中和能力檢測(cè)，鑒定所述B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽為目標(biāo)B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽。
[0014] 進(jìn)一步地，上述鑒定方法包含步驟：
[0015] 5)針對(duì)步驟3)所得的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽序列，從N-端及C-端分別依次截?cái)?2個(gè)氨基酸，合成各B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽所對(duì)應(yīng)的截?cái)嚯模?br>[0016] 6)用步驟4)獲得的所述免疫優(yōu)勢(shì)肽抗血清結(jié)合步驟5)所述的截?cái)嚯?，?lái)確定所 述B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽的最小表位；
[0017] 7)用步驟6)所篩得的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽的最小表位與鑰孔血藍(lán)蛋白蛋白偶 聯(lián)，所得偶聯(lián)物用于動(dòng)物免疫，獲得免疫優(yōu)勢(shì)表位抗血清；
[0018] 8)用步驟7)獲得的所述免疫優(yōu)勢(shì)表位抗血清進(jìn)行金黃色葡萄球菌腸毒素B的中 和能力檢測(cè)；
[0019] 9)用生物信息學(xué)方法確定步驟6)所確定的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽的最小表位在 金黃色葡萄球菌各個(gè)菌株中的保守性，并明確其在金黃色葡萄球菌腸毒素B蛋白三維結(jié)構(gòu) 中的位置。
[0020] 所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位肽具有高免疫原性，可引 發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)；用所述免疫優(yōu)勢(shì)表位免疫動(dòng)物所獲的抗血清均具有特異性中和SEB毒 素的作用。所述免疫優(yōu)勢(shì)表位不含有不必要甚至有害的部分，從而降低由其所制備的疫苗 的使用風(fēng)險(xiǎn)，具有較大的疫苗應(yīng)用價(jià)值，可用于制備金黃色葡萄球菌腸毒素B表位疫苗和/ 或預(yù)防疫苗。
[0021] 本發(fā)明通過(guò)用SEB突變體（rSEB)免疫BALB/c小鼠獲得預(yù)防S. aureus (金黃色葡 萄球菌）感染的抗血清，結(jié)合覆蓋SEB全長(zhǎng)的42條重疊肽逐步篩選出了 SEB的B細(xì)胞三個(gè) 免疫優(yōu)勢(shì)表位肽。用免疫優(yōu)勢(shì)表位肽一KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白）偶聯(lián)物免疫動(dòng)物，獲得的了可 強(qiáng)烈結(jié)合SEB毒素的表位肽特異性抗血清。接著用分別覆蓋三個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位肽的多個(gè)截 斷重疊肽與該表位肽抗血清進(jìn)行進(jìn)一步篩選，明確了該免疫優(yōu)勢(shì)表位肽的核心序列即優(yōu)勢(shì) 表位。在體外，鑒定的三個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位均可中和天然SEB毒素的超抗原能力。本發(fā)明所 提供的篩選和鑒定方法準(zhǔn)確率高，可以避免漏篩和誤篩現(xiàn)象，可以區(qū)別抗原表位的免疫顯 性和免疫亞顯性，并且所篩選出的抗原表位均能在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)高水平優(yōu)勢(shì)表位抗血清， 并且該抗血清具有中和SEB毒素超抗原能力的功能，由此使得制備高效、低毒、高安全性的 基于SEB的疫苗成為可能。
[0022] 本發(fā)明用覆蓋抗原蛋白全長(zhǎng)的多組重疊肽結(jié)合ELISA法篩選金黃色葡萄球菌腸 毒素B的免疫優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位肽，進(jìn)一步用覆蓋優(yōu)勢(shì)表位肽全長(zhǎng)的截?cái)嘀丿B肽結(jié)合ELISA 法來(lái)明確該優(yōu)勢(shì)表位肽的核心序列，方法簡(jiǎn)便快速，表位無(wú)遺漏，獲得了金黃色葡萄球菌腸 毒素B的B細(xì)胞的三個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位。該免疫優(yōu)勢(shì)表位均具有較強(qiáng)的免疫原性，用該優(yōu)勢(shì) 表位免疫動(dòng)物，免疫制劑無(wú)無(wú)關(guān)成分或有害成分，可獲得高水平的優(yōu)勢(shì)表位抗血清，并且， 該抗血清可強(qiáng)烈中和SEB毒素的超抗原能力。以該優(yōu)勢(shì)表位為活性成分的疫苗比SEB全 蛋白突變體疫苗具有更好的預(yù)防和中和誘發(fā)的SEB毒素的作用，由于優(yōu)勢(shì)表位SEB97_112及 SEB2(I7_222在多種S.aureus菌株中序列保守，提示其對(duì)其他S.aureus感染也具有良好的應(yīng) 用前景。
[0023] 為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫優(yōu)勢(shì)表位肽的篩選。
[0025]圖2為金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫優(yōu)勢(shì)表位肽抗血清與天然SEB的結(jié)合檢 測(cè)。
[0026]圖3Ai至圖3Cii為金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫優(yōu)勢(shì)表位的最小表位確定；其 中
[0027] 圖3Ai為SEB97_112的最小表位確定；
[0028] 圖3Bi為SEB2Q7_222的最小表位確定；
[0029] 圖3Ci為SEB247_257的最小表位確定；
[0030] 圖3Aii，圖3Bii及圖3Cii分別是亞優(yōu)勢(shì)表位肽 SEB31-48, SEB133-15。及 SEB 193_210的 核心序列。
[0031]圖4A至圖4D為金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫優(yōu)勢(shì)最小表位抗血清對(duì)該毒素的 中和能力的檢測(cè)；其中
[0032]圖4A為免疫優(yōu)勢(shì)最小表位抗血清中和了金黃色葡萄球菌腸毒素B誘導(dǎo)的T細(xì)胞 增殖；
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