一組特異識別金黃色葡萄球菌黃金亞種的寡核苷酸適配子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品安全生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到利用分子生物學(xué)技術(shù)中的SELEX 技術(shù)（指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)）篩選一種與金黃色葡萄球菌黃金亞種高特異性和高 親和力結(jié)合的核苷酸適配子，為該核酸適配子在檢金黃色葡萄球菌黃金亞種中的應(yīng)用提供 科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄球菌（Staphylococcus)是革蘭氏陽性球菌中的一種，廣泛分布于空氣、水、 土壤、飼料和人、動物的體表、鼻咽部及腸道，屬于人畜共患病菌。其中金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)的致病力最強，常引起皮膚、組織及器官的化膿性炎癥，由金黃 色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒是個世界性衛(wèi)生問題。近年來，由金黃色葡萄球菌引起 的食物中毒越來越多，據(jù)美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒居第 二位，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則高達45%，中國每年發(fā)生此類中毒事件也 非常多，金黃色葡萄球菌作為一種重要的食源性致病菌，它對食品加工業(yè)及人們健康存在 著潛在的危害，因此急需建立一種快速、靈敏、準確的檢測方法。
[0003] 金黃色葡萄球菌的檢測包括生物學(xué)檢測、分子生物檢測、免疫學(xué)檢測方法。傳統(tǒng)的 細菌培養(yǎng)和生化鑒定耗時，靈敏度低而且操作繁瑣；分子生物學(xué)檢測比如PCR方法雖然快 速、準確，但干擾因素多、易受操作條件影響、重復(fù)性差是該方法普遍存在的問題；免疫學(xué)檢 測具有特異性強、準確、靈敏的特點，但該技術(shù)受特異性抗體制備難度的制約，制備過程耗 時復(fù)雜，且抗體本身易受溫度等環(huán)境因素的影響，因此發(fā)展快速、靈敏、準確的病原菌檢測 技術(shù)十分必要。
[0004] 近年來，對寡核苷酸適配子的研究較為引人注目。寡核苷酸適配子是通過 SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,指數(shù)富集的配體 系統(tǒng)進化技術(shù)）技術(shù)從體外合成的隨機單鏈寡核苷酸文庫中篩選得到的一簇小分子DNA或 RNA片段，能夠以特定的結(jié)構(gòu)與靶標高親和力、高特異性的結(jié)合。作為抗體分子的前景性替 代分子，寡核苷酸適配子相比抗體分子表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢：特異性高，親和力強，體外合成 方便且成本低，易標記一些功能基團和報告分子，穩(wěn)定性好，適配子變性與復(fù)性可逆且速度 快，可反復(fù)使用、長期保存。SELEX技術(shù)是20世紀90年代初研制的一種新的組合化學(xué)技術(shù)， 是一種研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的有效方法，該技術(shù)問世之初Tuerk等人就采用SELEX技術(shù)篩 選出噬菌體T4DNA聚合酶的適配子。如今，適配子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于靶標檢測、酶抑制，受 體調(diào)節(jié)和藥物傳遞等各種領(lǐng)域。隨著SELEX技術(shù)的不斷完善，適配子的靶標已經(jīng)擴展到小 分子物質(zhì)（有機染料，金屬，藥物，碳水化合物，氨基酸，核苷酸和肽等）、蛋白質(zhì)（包括酶、抗 體、基因調(diào)控因子，以及外源凝集素）、腫瘤細胞、病毒和致病菌等。Cell-SELEX篩選以完整 細菌細胞為靶物質(zhì)的篩選方法，近年來，采用Cell-SELEX技術(shù)已成功篩選出大腸桿菌、沙 門氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌等細菌的適配子，基于Cell-SELEX技術(shù)篩選病原致 病菌、腫瘤細胞等細胞的適配子已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點。
[0005] 本發(fā)明以可引起皮膚軟組織感染、敗血癥及導(dǎo)管相關(guān)性感染等多種疾病的金黃色 葡萄球菌黃金亞種為靶標，采用競爭Cell-SELEX技術(shù)篩選出金黃色葡萄球菌黃金亞種的 高特異性、高親和力的適配子，該適配子穩(wěn)定性高、可體外合成、易標記功能基團和報告分 子，將廣泛應(yīng)用于食品、臨床中金黃色葡萄球菌黃金亞種的快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種微生物的分子生物學(xué)檢測方法，特別涉及一種利用適配 子技術(shù)快速、準確檢測金黃色葡萄球菌的方法。
[0007] 本發(fā)明方法利用指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX技術(shù)），以金黃色葡萄球 菌黃金亞種完整的活性菌細胞為靶標，篩選獲得2條與靶細胞高親和性、高特異結(jié)合的適 配子Spl5、Sp25,可以通過熒光基團標記方法將獲得的適配子轉(zhuǎn)為報告適配子，用于臨床血 液樣品、食品中金黃色葡萄球菌的檢測，達到快速、準確診斷的目的。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0009] (1)與抗體相比，單鏈寡核苷酸更加穩(wěn)定，適配子可在體外篩選，篩選周期短，合成 方便，易標記各種功能基團和報告分子，可長期保存使用。
[0010] (2)該組序列是從結(jié)構(gòu)顯著、與金黃色葡萄球菌黃金亞種結(jié)合具有不同親和力的 8條適配子序列中選取出的親和力和特異性均較強的一組適配子序列，能夠特異識別金黃 色葡萄球菌黃金亞種。
【附圖說明】
[0011] 圖1是金黃色葡萄球菌黃金亞種8個適配子家族代表性序列的二級結(jié)構(gòu)圖譜。
[0012] 圖2是金黃色葡萄球菌黃金亞種適配子Spll、Spl5、Sp25、Sp27親和力飽和結(jié)合 曲線。
[0013] 圖3是金黃色葡萄球菌黃金亞種適配子Spll、Spl5、Sp25、Sp27的特異性圖。
[0014] 表1是金黃色葡萄球菌黃金亞種適配子解離常數(shù)Kd值。
【具體實施方式】：
[0015] 下面是通過cell-selex技術(shù)篩選高特異親和的金黃色葡萄球菌黃金亞種核酸適 配子及其快速檢出金黃色葡萄球菌黃金亞種方面的應(yīng)用。
[0016] 1、體外合成隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫和引物（IDT公司合成）
[0017] 隨機單鏈DNA文庫：5，-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTAC CGTGAA-3'，構(gòu)建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40個堿 基的隨機序列，庫容量達到1〇14以上；上游引物：5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3' ;5'端磷 酸化下游引物：5 ^ - (phosphate) -ITCACGGTAGCACGCATAGG-3 ^，將隨機ssDNA文庫和兩種 引物均用TE緩沖液配制成100ymol/L貯存液-20°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0018] 2、篩選所用金黃色葡萄球菌黃金亞種的獲取與處理
[0019]LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌黃金亞種，37 °C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期 (1.OX108cfu/mL)。取對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌黃金亞種菌液lmL，在4°C，5000rpm