專利名稱：吲哚類半菁染料的合成與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類吲哚類半菁染料的合成與應(yīng)用，屬于精細(xì)化 工領(lǐng)域中一類功能染 料的合成及其作為熒光染料的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子在許多細(xì)胞過程中都扮演一個(gè)重要的角色，如細(xì)胞的成長、鈣的調(diào) 節(jié)、細(xì)胞內(nèi)吞作用、細(xì)胞粘連等。研究細(xì)胞內(nèi)PH的動(dòng)力學(xué)對(duì)理解許多細(xì)胞內(nèi)生理機(jī)能的調(diào) 節(jié)機(jī)制是至關(guān)重要的。檢測細(xì)胞內(nèi)PH的方法很多，如微電極、核磁共振等，而熒光顯微鏡 比這些方法更靈敏、更方便，因此近幾年熒光PH探針被廣泛用于監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)pH的變化。一 般來說，細(xì)胞內(nèi)存在兩個(gè)較寬的PH范圍一個(gè)是大約6. 8-7. 4，如細(xì)胞質(zhì)；另一個(gè)是大約 4. 5-6. 0，即所謂的酸性細(xì)胞器，如溶酶體。以各種熒光團(tuán)為母體的pH探針已經(jīng)被報(bào)道，有 些已被用于組織或活細(xì)胞成像，有些也已經(jīng)商品化。但是具有雙發(fā)射的PH探針已見報(bào)道的 很少。特別是酸性PH探針，幾乎都是基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)機(jī)理，因此沒有波長的變 化。雖然商品化探針DND160是具有雙發(fā)射的酸性pH探針(Dirni Z,Chen CS,Zhang C Chem. Biol. 1999,6(7) :411_418)，但其缺點(diǎn)明顯探針的吸收和發(fā)射波長都很短，容易對(duì)細(xì)胞造 成損傷，而且還會(huì)產(chǎn)生生物質(zhì)自熒光的干擾。因此合成較長波長的雙發(fā)射、低PKa的探針， 將會(huì)有更好的應(yīng)用前景。苯乙烯類吲哚菁染料具有良好的光穩(wěn)定性，合適的水溶性，很好的細(xì)胞膜通透性 以及在細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的熒光，而且這類染料的合成非常簡單，收率也很高，但是通常對(duì)PH 不敏感。羥基是一個(gè)重要的PH探針官能團(tuán)，許多含有羥基的pH探針已經(jīng)被報(bào)道(Tang B， Liu X，Xu KH, Huang H, YangGff, An LG. Chem. Comm. 2007，3726-3728)。而應(yīng)用于細(xì)胞酸泡 成像的PH探針需要具有較低的pKa，在染料分子中引入吸電基團(tuán)可以降低分子的pKa。近幾年，具有固體熒光的有機(jī)化合物已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，因?yàn)樗鼈儾粌H可以用來 進(jìn)行基礎(chǔ)研究，而且還可能應(yīng)用于光電領(lǐng)域，如有機(jī)發(fā)光二極管，光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)。理解它們 的發(fā)光行為和固態(tài)的性能是非常重要的，因?yàn)樵趯?shí)際應(yīng)用中，這些材料一般是以薄膜的形 式應(yīng)用的。然而，具有固態(tài)發(fā)射的有機(jī)化合物很少。這主要是因?yàn)樵诰w形態(tài)或者無定形的 固相(例如薄膜)，熒光團(tuán)之間堆積得非常緊密，即使具有最亮發(fā)射的熒光團(tuán)，也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán) 重的淬滅。另外，固態(tài)的激發(fā)光和發(fā)射光具有很強(qiáng)的消光系數(shù)，這對(duì)固體熒光是非常有害的 (Ozdemir T，Atilgan S，Kutuk I，Yildirim, LT, Tulek A，Bayindir M，Akkaya E U. Org. Lett. 2009,11(10) :2105_2107)，特別當(dāng)熒光團(tuán)的斯托克斯位移很小的時(shí)候。因此，高效的 固態(tài)熒光分子的開發(fā)是一個(gè)具有挑戰(zhàn)的課題。最近幾年，有很多文獻(xiàn)(Ooyama Y,Mamura T， Yoshida K. E. J. Org. Chem. 2007, 5010-5019 ；Shimizu M,Takeda Y,Higashi M. Angew. Chem. Int. Ed. 2009,48(20) 3653-3656 ；ShimizuM,Takeda Y,Higashi Μ,Hiyama Τ. Angew. Chem. Int. Ed. 2009,48(20) :1_5)報(bào)道固體發(fā)射的熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)，闡述其發(fā)光機(jī)理，它們都是帶有 較大側(cè)鏈的共軛體系，這樣可以抑制分子間的聚集；而且多數(shù)分子是供-受體形式，有較強(qiáng) 的分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)，可以增大熒光團(tuán)的斯托克斯位移，減少熒光自淬滅。
上述許多研究在X-射線單晶衍射的基礎(chǔ)上，闡述了固體熒光性質(zhì)和分子堆積結(jié) 構(gòu)的關(guān)系。研究表明分子間的強(qiáng)n-n作用和鄰近的熒光團(tuán)之間連續(xù)的分子內(nèi)氫鍵是導(dǎo) 致固態(tài)熒光淬滅的主要因素。因此，設(shè)計(jì)新型的強(qiáng)固態(tài)發(fā)射的熒光團(tuán)首先要減少引起熒光 淬滅的分子間作用。當(dāng)前消除分子間聚集的方法主要是引入大體積取代基或者引入具有位 阻的取代基構(gòu)建非平面結(jié)構(gòu)，以此來解決聚集淬滅熒光的問題。苯乙烯類染料具有較強(qiáng)的 ICT效應(yīng)，通過引入較大的取代基也可以使其具有較強(qiáng)的固態(tài)熒光，這類染料的光穩(wěn)定性 好，易于合成與純化，適于光電領(lǐng)域的研究。熒光染料作為功能性色素在科學(xué)技術(shù)的各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在生命科 學(xué)、臨床醫(yī)療診斷、免疫分析檢測等方面的研究在全世界備受矚目。目前，菲啶類(EB、PI)、 吖啶類(AO)、咪唑類(Hoechst、DAPI)和花菁家族類(Cy、T0T0、SYT0)等商品化熒光染料 在基因組學(xué)技術(shù)、核酸定量檢測、血細(xì)胞分析等領(lǐng)域中都起到了重要的作用。然而，這些染 料都各自存在著應(yīng)用的局限性。其一主要表現(xiàn)在大多熒光染料受限于固定細(xì)胞樣品。例 如T0PR0、T0T0家族染料、溴乙錠(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通過增大細(xì)胞膜的通透性或 類似使膜崩解的方法才能對(duì)生物樣品進(jìn)行有效的熒光標(biāo)記。然而，這種固定方法往往對(duì)細(xì) 胞和生物組織真實(shí)形態(tài)的觀察有負(fù)面影響[Kozubek S，Lukasova E，Amrichova J，Kozubek M, Liskova A, SlotovaJ. Anal Biochem 2000;282:29-38]。同時(shí)，溴乙錠等吖啶，菲啶類 染料有很大的毒性和致癌性。其二，有相當(dāng)一部分熒光染料的激發(fā)光處在紫外光區(qū)，如能 夠?qū)Ｒ蛔R(shí)別脫氧核糖核酸(DNA)的熒光染料4’，6-二氨基-2-苯基吲哚啉化合物(DAPI)、 Hoechst33258, Hoechst34580等，與DNA結(jié)合后，在紫外光激發(fā)放下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。由于 紫外光對(duì)細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白等組分會(huì)造成嚴(yán)重的損傷，因此這類熒光在熒光顯微技術(shù)中 的使用受到光激發(fā)時(shí)間的限制[Davis SK, Bardeen CJ. Photochem Photobiol 2003 ；77 675-679]。因此，研究開發(fā)出具有良好熒光光譜性能，毒性小，活細(xì)胞通透性的新型熒光染 料仍然是推動(dòng)熒光分析技術(shù)和生命科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵和核心。在眾多種類的熒光染料中，菁類熒光染料以其波長范圍寬，摩爾消光系數(shù)大，熒光 量子產(chǎn)率適中等優(yōu)點(diǎn)，作為生物分子熒光探針、CD和VCD記錄材料、感光材料光敏劑、光電 轉(zhuǎn)換材料等已被廣泛的應(yīng)用。不對(duì)稱菁類化合物中最典型的為T0T0及其類似物(Y0Y0)和 衍生物類(T0PRP0)。T0T0(噻唑橙二聚體)、Y0Y0(惡唑黃二聚體)是由Glazer研究組開 發(fā)的一類對(duì)核酸具有高度親和力的多正電荷不對(duì)稱菁類熒光染料，通過改變多亞甲基鏈的 長度和兩端的芳香母核(噻唑、惡唑、喹啉、吡啶和吲哚啉)的結(jié)構(gòu)可以得到不同的異二聚 體類似物和衍生物。這類染料在溶液中幾乎無熒光，降低了檢測過程中的熒光背景干擾， 與核酸結(jié)合后熒光增強(qiáng)。此類染料中的有些品種已經(jīng)商品化，如SYT0X Blue,T0T0,P0P0, B0B0, Y0-PR0等。但這些商品化的染料大部分分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，屬活細(xì)胞非通透性，只 能應(yīng)用于活體外核酸的識(shí)別與檢測。近幾年，一些苯乙烯類半菁染料已經(jīng)逐漸被用于DNA的測試，其中包括吡啶類、 苯并噻唑類、喹啉類以及吲哚類等。雖然前三類半菁染料中出現(xiàn)了由柔性鏈(帶電荷或 不帶電荷)連接的雙染料，但是用于生物分子檢測的吲哚類的雙半菁染料非常少，而用于 蛋白檢測的吲哚類雙半菁染料未見報(bào)道。值得注意的是，上述所有的雙菁染料中具有活 細(xì)胞通透性的結(jié)構(gòu)鮮見報(bào)道，可能因?yàn)閳?bào)道的雙菁染料多以含有正電荷的碳鏈作為連接 基團(tuán)，增加了染料的水溶性，降低了細(xì)胞膜通透能力，阻礙了這些具有優(yōu)越性能的染料在活細(xì)胞細(xì)胞器可視化方面的應(yīng)用。適當(dāng)?shù)挠H脂性可以使探針穿過細(xì)胞膜而不會(huì)在膜表面 堆積(J Colston, Rff Horobin, F Rashid-Doubel 1, J Pediani, KK Johal. Biotechnic & Histochemistry 2003,78(6) :323_332)；同時(shí)，不含水溶性基團(tuán)的吲哚類菁染料具有良好 的活細(xì)胞膜通透性。另一方面，長波長的染料不但可以避開生物體自身的吸收和熒光，而且 在應(yīng)用時(shí)還能降低激光對(duì)細(xì)胞的損傷。因此，以吲哚類半菁染料為熒光團(tuán)，通過不同連接臂的連接，降低其背景熒光，使 其在生物分子識(shí)別方面具有更好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類結(jié)構(gòu)簡單、光穩(wěn)定性好、易于合成的新的化合物。根據(jù)取 代基的不同，此類化合物可以用于不同領(lǐng)域的功能熒光染料。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一類吲哚類半菁染料分子具有結(jié)構(gòu)通式I
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中=R1 = H、鹵素、硝基、磺酸基，R2 = H ；或R1R2組成萘吲哚環(huán)/"Λ .R3和R4各自獨(dú)立選自H、羥基、鹵素、硝基、Ch烷基；R5 為 H、羥基、N((CH2)mR7)2，其中:R7 = H、OH、OAc、C00H、C00CH3、苯基;R6 為(CH2)pR8，其中R8 = H、0H、C = C、炔基、OAc、C00H、C00CH3、C00C2H5、ρ-(C6H4) R9,其中:R9 = H、CH3,鹵素、NO2, CN、C00H、L-A ；Y—=鹵素離子、ClOp PF6-或 TsO-；L = -CV18 燒基 _、ρ- (CH2) q (C6H4) (CH2) q-；m = 1 18，η = 1 或 2，ρ = O 18，q = 1-6。當(dāng)η = 1、&為羥基時(shí)，具有結(jié)構(gòu)式II
<formula>formula see original document page 6</formula>其中R1 = H、鹵素、硝基、磺酸基，R2 = H ；或R1R2組成萘吲哚環(huán).<formula>formula see original document page 6</formula>R3和R4各自獨(dú)立選自H、羥基、鹵素、硝基、C1-4烷基；R6 為(CH2)pR8，其中R8 = H、0H、C = C、炔基、OAc、C00H、C00CH3、C00C2H5、 p-(C6H4)R9，其中R9 = H、CH3、商素、N02、CN、C00H ；Y-=鹵素離子、C104-、PF6_ 或 TsO-，其中P = 1 18。
當(dāng)R2 = H、n = 1時(shí)，組成結(jié)構(gòu)式III
<formula>formula see original document page 7</formula>其中Rl = H、鹵素、硝基、磺酸基。R3和R4各自獨(dú)立選自H、羥基、鹵素、硝基、C1-4烷基；R5 為 H、羥基、N((CH2)mR7)2，其中R7 = H、OH、OAc、C00H、C00CH3、苯基；R6 為(CH2)pR8，其中R8 = H、0H、0Ac、C00H、C00CH3、C00C2H5、p-(C6H4)R9，其中 R9 = H、CH3、鹵素、N02、CN、COOH ；Y-=鹵素離子、C104-、PF6_ 或 TsO-；m = 1 18 ;P = 0 18。當(dāng)R6 = L-A時(shí)，具有結(jié)構(gòu)通式IV
<formula>formula see original document page 7</formula>其中R1 = H、鹵素、硝基、磺酸基，R2 = H ；或R1R2組成萘吲哚環(huán)<formula>formula see original document page 7</formula>R3和R4各自獨(dú)立選自H、羥基、鹵素、硝基、Cl_4烷基；R5 為 H、N((CH2)mR7)2，其中:R7 = H、OH、OAc、C00H、C00CH3、苯基；Y-=鹵素離子、C104-、PF6_ 或 TsO-；L = -C1-18 烷基 _、或 p- (CH2) q (C6H4) (CH2) q-；m = 1 18，η = 1、2，ρ = 1 18，q = 1-6。所述具有結(jié)構(gòu)式II的化合物用作pH熒光探針。所述具有結(jié)構(gòu)式III的化合物用作固體熒光化合物。所述具有結(jié)構(gòu)式IV的化合物用作生物熒光探針。由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明中的新化合物用作生物分子探針時(shí)具備的有 益效果在于(1)本發(fā)明的新雙染料分子形成分子內(nèi)聚集，降低染料自身熒光，并且使染料與生 物分子的結(jié)合能力增強(qiáng)，提高了檢測靈敏度。并且在一定范圍內(nèi)可對(duì)生物分子定量檢測。(2)本發(fā)明的部分新染料化合物增加了一個(gè)共軛甲川鏈，使最大吸收波長可增加 約lOOnm，發(fā)射波長范圍寬，可達(dá)650nm 900nm的近紅外區(qū)，可避免生物自身的熒光背景 干擾。染料的摩爾消光系數(shù)大，靈敏度高，光穩(wěn)定性好，可應(yīng)用于生物分子識(shí)別、臨床醫(yī)療診斷、免疫分析檢測等領(lǐng)域。(3)本發(fā)明的部分雙染料分子具有活細(xì)胞細(xì)胞膜通透性，可用于活細(xì)胞熒光成像。(4)本發(fā)明的新染料產(chǎn)品毒副性小，原料易得，結(jié)構(gòu)簡單，一般通過2到4步反應(yīng)即 可合成目標(biāo)分子，易于產(chǎn)業(yè)化。


圖1是實(shí)施例2的化合物A隨pH變化時(shí)，吸收光譜的變化趨勢圖。橫坐標(biāo)為波長 (nm)，縱坐標(biāo)為相對(duì)吸收強(qiáng)度。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)Hp8453 ；pH計(jì)，型 號(hào)LEICI?；衔顰的濃度為2 μ Μ。圖2是實(shí)施例2的化合物A隨pH變化時(shí)，熒光光譜的變化趨勢圖。橫坐標(biāo)為波長 (nm)，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度。所用儀器為熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500 ；pH計(jì)，型號(hào) LEICI?；衔顰的濃度為2 μ M。圖3是化合物A的酸堿平衡機(jī)理及存在的共振結(jié)構(gòu)。圖4是實(shí)施例3的化合物B隨pH變化時(shí)，吸收光譜的變化趨勢圖。橫坐標(biāo)為波長 (nm)，縱坐標(biāo)為相對(duì)吸收強(qiáng)度。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)Hp8453 ；pH計(jì)，型 號(hào)LEICI?；衔顱的濃度為2 μ M。圖5是實(shí)施例3的化合物B隨pH變化時(shí)，熒光光譜的變化趨勢圖。橫坐標(biāo)為波長 (nm)，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度。所用儀器為熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500 ；pH計(jì)，型號(hào) LEICI?；衔顱的濃度為2 μ M。圖6是實(shí)施例3中化合物B在570nm處熒光強(qiáng)度與pH的擬合曲線，可以估算化合 物B的pKa。圖7為實(shí)施例2的化合物A對(duì)活細(xì)胞MCF-7 (人乳癌細(xì)胞)染色的共聚焦顯微成 像照片，從左到右依次為綠色通道成像圖片、紅色通道成像圖片、雙通道疊加圖片和亮場圖 片?；衔顰的濃度為1.5μΜ。所用儀器為共聚焦激光掃描顯微鏡，型號(hào)TCS-SP2。激發(fā) 光通道綠光458nm，紅光543nm。圖8是實(shí)施例4、5、6中化合物C、D、E和已知化合物S 1的固態(tài)發(fā)射光譜。所用儀 器為熒光分光光度計(jì)，型號(hào)LS 55。圖9是實(shí)施例4中化合物C與已知化合物Sl的粉末顏色和固體熒光照片。圖10是實(shí)施例8的化合物G和已知化合物Sl在pH 7. 4、濃度IOmM的三(羥甲基) 氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中，與小牛胸腺DNA結(jié)合前后吸收、發(fā)射光譜變化對(duì)比圖。橫坐標(biāo)為 波長(nm)，縱坐標(biāo)為相對(duì)吸收、熒光強(qiáng)度。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)Hp8453 ； 熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500?；衔颎和Sl的濃度均為2 μ Μ,小牛胸腺DNA的濃度為 100 μ M0圖11是實(shí)施例8的化合物G在pH 7. 4、濃度IOmM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸 鹽緩沖液中，與不同濃度的小牛胸腺DNA結(jié)合后發(fā)射光譜變化趨勢圖。橫坐標(biāo)為波長(nm)， 縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度。所用儀器為熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500?；衔颎的濃度為 2 μ M，小牛胸腺DNA的濃度為0-50 μ Μ。圖12是實(shí)施例8中的化合物G的熒光強(qiáng)度與DNA濃度的變化趨勢(插圖)和線 性關(guān)系。
圖13是實(shí)施例9中化合物H和已知化合物S2分別在pH 7. 0、濃度10mM的三(羥 甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中，與牛血清白蛋白BSA結(jié)合前后的吸收、熒光變化對(duì)比圖。 橫坐標(biāo)為波長(nm)，縱坐標(biāo)為相對(duì)吸收、熒光強(qiáng)度。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào) Hp8453 ；熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500?；衔颒和S2的濃度均為2 y M，牛血清白蛋白 BSA的濃度為50 u M。圖14是實(shí)施例9中化合物H在pH 7. 0、濃度10mM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸 鹽緩沖液中，隨牛血清白蛋白BSA濃度升高熒光變化趨勢圖。橫坐標(biāo)為波長(nm)，縱坐標(biāo)為 相對(duì)熒光強(qiáng)度。所用儀器為熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500。化合物H的濃度為2yM，牛 血清白蛋白BSA的濃度為0-10 u M。圖15是化合物H的熒光強(qiáng)度與BSA濃度的變化趨勢(插圖)和線性關(guān)系。圖16為實(shí)施例7的化合物F和實(shí)施例10中的化合物I對(duì)活細(xì)胞PC12的成像照 片。從左到右依次為化合物F對(duì)活細(xì)胞PC12的亮場成像照片、化合物F對(duì)活細(xì)胞PC12的 熒光成像照片；化合物I對(duì)活細(xì)胞PC12的亮場成像照片、化合物I對(duì)活細(xì)胞PC12的熒光成 像照片。染料濃度3iiM，孵育時(shí)間30min。激發(fā)光是WB510_570nm，儀器為Nikon eclipase TE 2000-5。
具體實(shí)施例方式除另有說明外，本文中使用的術(shù)語具有以下含義。本文中使用的術(shù)語“烷基”包括直鏈烷基和支鏈烷基。如提及單個(gè)烷基如“丙基”， 則只特指直鏈烷基，如提及單個(gè)支鏈烷基如“異丙基”，則只特指支鏈烷基。例如，“C1-6烷 基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)則也適用于 本說明書中使用的其它基團(tuán)。本文中使用的術(shù)語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。本文中使用的術(shù)語“芐基”是指-CH2_Ph基團(tuán)。當(dāng)用“任選取代”修飾芐基時(shí)，指 該芐基可以未取代的形式存在，或者可被合適的取代基在任何合適的位置取代。合適的取 代基包括但不限于H、C1-18烷基、CN、C00H、NH2、N02、OH、SH、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、 C1-6酰氨基、鹵素、或C1-6鹵代烷基等，只要最終形成的化合物具有本發(fā)明期望的性質(zhì)。優(yōu) 選芐基由C00H、NH2、OH、C1-6烷氧基、鹵素任選取代。本文中使用Y-表示負(fù)離子，其可為任何合適的負(fù)離子，包括但不限于無機(jī)負(fù)離子 或有機(jī)負(fù)離子，例如鹵素離子、C104-、PF6-、BF4-、CH3C00-或OTs-。在本發(fā)明的通式I化合物中，優(yōu)選R1和R2各自獨(dú)立選自R1，R2為H、鹵素、硝基、
磺酸基；或R1R2 二 r\ (組成萘卩引噪環(huán));最優(yōu)選ri和R2均為H。優(yōu)選R3和R4各自獨(dú)立選自H或羥基、甲氧基、鹵素、硝基、Cl_4烷基；更優(yōu)選R3 和R4各自獨(dú)立選自H或C1-2烷基；最優(yōu)選R3和R4均為H。優(yōu)選R5 為 H、羥基、N ((CH2) mR7) 2 ；最優(yōu)選 R5 為羥基、N (CH3) 2。優(yōu)選R6 為(CH2) pR8, R8 = H、OH、OAc、C00H、C00CH3、C00C2H5、p- (C6H4) R9、A，R9 =H、CH3、鹵素、N02、CN、C00H ；最優(yōu)選R6為CH3、C = C、炔基、羧基取代苯環(huán)、A ；。優(yōu)選L 為 C1-18 烷基或 p- (CH2) q (C6H4) (CH2) q，q = C1-6 烷基；更優(yōu)選 L 為 C1-14 烷基或 p- (CH2) q (C6H4) (CH2) q，q = Cl_4 烷基；再更優(yōu)選 L 為 Cl_12 烷基或 p- (CH2)
9q(C6H4) (CH2) q, q = Cl-2 烷基；最優(yōu)選 L 為 Cl-IO 烷基或 p-(CH2) (C6H4) (CH2)。優(yōu)選Y-為鹵素離子、C104-、PF6-、BF4-、CH3C00-或 OTs-，最優(yōu)選 Y-為 Cl-、Br-。本發(fā)明提供上述通式II化合物的pH探針性質(zhì)及其生物應(yīng)用。本發(fā)明還提供上述通式III化合物固態(tài)熒光性質(zhì)。本發(fā)明還提供一種利用上述通式IV化合物、其綴合物或其組合物在生物染色方 面的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物用作熒光染料時(shí)具備的有益效果在于
-部分化合物具有雙發(fā)射性質(zhì)，可以用于雙色細(xì)胞成像。-新化合物分子中形成分子內(nèi)聚集，使染料與核酸的結(jié)合前熒光顯著降低，結(jié)合后 熒光強(qiáng)度和熒光量子產(chǎn)率增大，提高了檢測靈敏度。-新化合物分子具有良好的細(xì)胞膜通透性，應(yīng)用范圍增大。-部分新染料化合物通過增長甲川鏈，使熒光發(fā)射波長可達(dá)650nm以上，避免生物 自身的熒光背景干擾。_新化合物可應(yīng)用廉價(jià)、體積小、性能穩(wěn)定的紅色半導(dǎo)體激光器作為光源，大大降 低使用成本。-新化合物產(chǎn)品毒副性小，原料易得，結(jié)構(gòu)簡單，一般通過4到5步反應(yīng)即可合成目 標(biāo)分子，易產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明的這些特征和優(yōu)點(diǎn)以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)在參考以下附圖和本發(fā)明的具體 實(shí)施方式之后將變得顯而易見。本發(fā)明化合物可以以本文中所述的鹽形式直接用于生物樣品的染色。另外，本發(fā) 明化合物的衍生物也可以用于生物樣品的染色，所述衍生物包括但不限于綴合物。典型地，綴合物在熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)中使用。本文中使用的“綴合物” 是指本發(fā)明熒光染料通過共價(jià)鍵與其它分子連接而形成的化合物?？膳c本發(fā)明熒光染料綴 合的分子可為與細(xì)胞或細(xì)胞成分特異性結(jié)合的分子，包括但不限于抗體、抗原、受體、配體、 酶、底物、輔酶等。通常，測試樣品與熒光綴合物溫育一段時(shí)間，使得該熒光綴合物與測試樣 品中的某些細(xì)胞或細(xì)胞成分特異性結(jié)合，該熒光綴合物與細(xì)胞或細(xì)胞成分的結(jié)合也可被稱 為染色。該染色步驟可依次進(jìn)行多次，或用多種綴合物同時(shí)進(jìn)行多種染色。染色完成后，樣 品在熒光激活細(xì)胞分選儀中進(jìn)行分析，其中激發(fā)光源激發(fā)綴合物中的本發(fā)明熒光染料，而 測定裝置測定由激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的發(fā)射光。本發(fā)明還提供包含式II化合物或其綴合物的組合物，所述組合物用于生物樣品 的染色。本發(fā)明的組合物除包含式II化合物或其綴合物外，還可包含生物樣品染色所需 要的其它組分，例如溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、PH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑等。這些組分都是本行業(yè) 內(nèi)已知的。本發(fā)明的組合物可以以水溶液形式存在，或者可以以臨用前用水配制為溶液的其 它合適形式存在。在再一個(gè)方面，本發(fā)明還提供使用上述式II化合物、或其綴合物、或包含式II化 合物的組合物以染色生物樣品的方法，該方法包括使上述式II化合物或其綴合物或包含 式II化合物的組合物與生物樣品接觸的步驟。本文中使用的術(shù)語“接觸”可包括在溶液或固相中接觸。為了說明本發(fā)明的化合物在應(yīng)用性能上的優(yōu)化改進(jìn)，實(shí)施例14、15、17中已知化 合物Si、S2作為參照物，進(jìn)行對(duì)比說明。其中化合物Sl和S2結(jié)構(gòu)如下
<formula>formula see original document page 11</formula>實(shí)施例1染料中間體1-甲基-5-硝基-2，3，3-三甲基-3H吲哚季銨鹽的合成將20mmol 5-硝基_2，3，3_三甲基-3H吲哚和40mmol碘甲烷加入到IOOml含20ml 甲苯的圓底燒瓶中，氬氣保護(hù)。反應(yīng)加熱回流持續(xù)反應(yīng)20h后停止?；旌衔锢鋮s后過濾沉 淀并用乙醚洗滌濾餅。干燥后得到淡黃色的固體粉末，粗收率85%。實(shí)施例2化合物A的制備
<formula>formula see original document page 11</formula>將5mmol 1_甲基_5_硝基_2，3，3_三甲基-3H吲哚季銨鹽與6mmol對(duì)羥基苯甲 醛加入到25ml含IOml乙醇的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，常溫?cái)嚢?4h后，將反應(yīng)液置于-20°C 下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到橙黃色固體粉 末，收率85%。IH NMR(400MHz, DMS0_d6，ppm) :1.87(s，6H，C(CH3)2) ,4. 12(s，3H，CH3—N+)，
7.00 (d, 2H, J = 8. 4，Ar-H)，7. 52 (d, 1H, J = 16, CH = CH), 8. 06 (d, 1H，J = 8· 8，Ar-H)，
8.23 (d, 2H, J = 8· 4，Ar-H)，8. 50 (d, 1H，J = 8· 8，Ar-H)，8. 56 (d, 1Η, J = 16, CH = CH), 8.83 (s，1Η, Ar-H)，11. 09(s,1Η, OH). 13C NMR(1OOMHz, DMS0_d6，ppm) 25.45,34. 44， 52. 02，109. 29,115. 36,116. 67，118. 63，125. 14，126. 09，134. 65，144. 20，146. 59，147. 00， 156. 89，154. 39，184. 64. HRMS(TOF MS ES+)calcd. for C19H19N203[M_I_]+323. 1390,found 323. 1394.實(shí)施例3化合物B的制備
Br
^^N+Br ；
將5mmol 1_炔丙基_2，3，3_三甲基_3H吲哚季銨鹽與5mmol 3_Br_4-羥基苯甲 醛加入到25ml含IOml甲醇的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流4h后，將反應(yīng)液置于-20°C 下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到橙色固體粉末， 收率88%。IH NMR (400MHz, CDC13, ppm) :1.73(s，6H，C (CH3) 2)，3· 31 (t，1H，J = 2. 38, Alkyne-H)5. 41(s,2H, CH2-N+)，6. 82 (d，2H，J = 8. 8, Ar-H) ,7. 19 (d, 1H, J = 15. 6, CH =CH)，7. 46 (t, 1H, J = 7. 2，Ar-H)，7. 54 (t, 1H, J = 7· 6，Ar-H)，7. 67 (d, 1H，J = 8· 0， Ar-H)，7. 75 (d, 1Η，J = 7. 2，Ar-H)，7. 99 (d, 1H，J = 8. 8，Ar-H)，8. 19 (d, 1H, J = 15. 6，CH =CH),8. 45(s,1H, Ar-H). 13C NMR(1OOMHz，DMS0_d6，ppm) 26.09,33. 92,51. 16,72. 24, 81. 35,113. 8,114. 68,119. 45，123. 05，125. 24，127. 79，129. 14，133. 73，137. 06，142. 66， 142. 92，151. 49，165. 83，179. 00. HRMS(TOF MS EI+)calcd. for C19H18BrN0[M-Br-+H+] (100% )380. 0645，found 380. 0650 ； [M_Br_+H++2] (100% ) :382. 0630，found :382. 0636實(shí)施例4
化合物C的制備
N+Cf
HOOC將5mmol 1_ (4_羧芐基)_2，3，3_三甲基_5_溴_3H苯并吲哚季銨鹽與5. 5mmol 4-N，N-二甲胺基苯甲醛加入到25ml含IOml乙醇的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流2h后， 將反應(yīng)液置于-20°C下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥， 得到黃綠色固體粉末，收率92%。IH NMR(400MHz, DMS0_d6，ppm) :1.83(s，6H，C(CH3)2)，3. 18(s，6H，N(CH3)2), 5. 91 (s，2H，CH2-N+)，6. 89 (d, 2H, J = 8. 8，Ar-H)，7. 35 (d, 1H, J = 15. 2，CH = CH)， 7. 43-7. 45 (m, 3H, Ar-H)，7. 56 (d, 2H，J = 6. 8，Ar-H)，7. 81 (d, 1H, J = 6. 4，Ar-H)，7. 95 (d, 2H, J = 8. 0，Ar-H)，8. 06 (d, 2H, J = 8. 0，Ar-H)，8. 43 (d, 1H，J = 15. 2，CH = CH) · HRMS (T0FMS EI+)calcd. for C28H27BrN202 [M-Cl—H+] 502. 2151, found 502.2162.實(shí)施例5化合物D的制備
<formula>formula see original document page 12</formula> 將5mmol 乙基-2，3，3_三甲基-3H吲哚季銨鹽與6mmol 4_N，N_ 二羥乙基胺基苯甲醛加入到25ml含10ml乙醇的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流2h后，將反應(yīng)液置 于-20°C下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到綠色固 體粉末，收率95%。1H NMR (400MHz，DMS0-d6，ppm) :1.40(t，3H，J = 7. 2，CH3CH2)，1. 77 (s，6H， C(CH3)2)，3. 39(s,4H, NCH2CH20H)，3. 67(s,4H, NCH2CH20H)，4. 56(q,2H，J = 7. 2，CH2-N+)， 4. 91 (s，2H, NCH2CH20H)，6. 96 (d, 2H, J = 8. 8，Ar-H)，7. 26 (d, 1H, J = 15. 6，CH = CH)， 7. 48 (s, 1H, Ar-H)，7. 56 (d, 1H，J = 7. 2，Ar-H)，7. 80 (d, 1H，J = 6. 8，Ar-H)，8. 10 (d, 2H, J =8. 8，Ar-H), 8. 34 (d, 1H, J = 15. 6，CH = CH). MS :[M_I-]+ = 379. 2 ；HRMS (TOF MS EI+) cal cd. for C24H30N202 [M-I—H+] 378. 2307，found 378.2299.實(shí)施例6化合物E的制備<formula>formula see original document page 13</formula>將5mmol 1_羧戊基_2，3，3_三甲基-5-甲氧基_3H吲哚季銨鹽與5. 5mmol4-N， N-二丁基胺基苯甲醛加入到25ml含10ml乙二醇單甲醚的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流 1.5h后，將反應(yīng)液置于-20°C下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后 真空干燥，得到墨綠色固體粉末，收率92%。1H NMR(400MHz, DMS0_d6，ppm) :0.9(t，6H，J = 7. 2，CH3)，1. 32-1. 54 (m，13H， CH2)，1. 57 (m, 2H, CH2)，1. 76 (s,6H, C (CH3) 2)，1. 80 (m, 2H, CH2)，2. 20 (t,2H, J = 7. 2， CH2C00H)，3. 28(s,4H, NCH2)，4. 52(t，2H，J = 7.2，CH2-N+)，6. 90(d,2H，J = 9.2，Ar-H)，
7.26 (d, 1H, J = 15. 6，CH = CH)，7. 48 (d, 1H, J = 1.2，Ar-H)，7. 55 (d, 1H, J = 1.2， Ar-H)，7. 72 (d, 1H, J = 8. 0，Ar-H)，7. 79 (d, 1H, J = 7. 2，Ar-H)，8. 10 (s, 1H, Ar-H)，
8.35 (d, 1H, J = 15. 6, CH = CH)，12. 00 (s，1H，C00H). HRMS (TOF MS EI+)calcd. for C33H47N203[M-Br-]+519. 3581，found519. 3590.實(shí)施例7化合物F的制備<formula>formula see original document page 13</formula>
將5mmol 1，1，_(1，4_ 丁二基)-雙 2，3，3_ 三甲基 _3H 吲哚季銨鹽與 llmmol 4_N， N-二甲胺基苯甲醛加入到25ml含IOml乙醇的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流2h后，將反 應(yīng)液置于-20°C下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到 紫色固體粉末，收率90%。IH NMR (400MHz, DMS0_d6，ppm) :1.68(s，12H，C (CH3) 2)，2· 01 (s，4H，CH2CH2N+)， 3. 17 (s，12H, N(CH3)2)，4. 65(s，4H，CH2CH2—N+)，6. 79(d，4H，J = 9. 2，Ar-H), 7. 30(d，2H，J =15. 6，CH = CH)，7. 46(t，2H，J = 7. 6, Ar-H) ,7. 52(t，2H，J = 7. 6, Ar-H) ,7. 77(d，2H，J = 7. 2, Ar-H)，7. 81 (d, 2H, J = 7. 2, Ar-H)，8. 12 (d, 4H, J = 8. 8, Ar-H)，8. 32 (d, 2H, J = 15. 6， CH = CH). 13C NMR(1OOMHz，DMS0-d6，ppm) :24.91，26.45，44.40，50.81，104. 63，112. 11， 113. 58，122. 34，122. 81，127. 46，128. 72，134. 45，141. 05，142. 56，154. 56，154. 72，179. 38. HRMS(TOFMS ES+)calcd. for C44H52N42+[M-2Br-]2+636. 4181, found 636.4168.實(shí)施例8化合物G的制備
<formula>formula see original document page 14</formula>將5mmol 1，1，-(1，6_己二基)-雙2，3，3_三甲基_5_溴_3H吲哚季銨鹽與12匪ol 4-N，N-二甲胺基苯甲醛加入到25ml含IOml乙醇的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流2h后， 將反應(yīng)液置于-20°C下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥， 得到粉紅色固體粉末，收率83%。IH NMR (400MHz，DMS0-d6，ppm) 1. 51 (m,4H, CH2CH2CH2N+) , 1. 75 (s, 12H, C(CH3)2)，1. 77(m，4H，CH2CH2CH2N+) , 3. 17 (s，12H, N(CH3)2) ,4. 54(t，4H，J = 6. 6， CH2CH2CH2-N+) , 6. 87 (d, 4H, J = 8. 8, Ar-H) ,7. 27(d,2H, J = 15. 6, CH = CH)， 7. 49(m，4H，Ar_H)，7. 70 (t，2H，J = 6. 8，Ar_H)，7. 78 (d，2H，J = 6. 8，Ar_H)，8. 12 (s， 2H, Ar-H),8. 34(d,2H, J = 15. 2, CH = CH). 13C NMR(1OOMHz, DMS0_d6，ppm) :25.68， 26. 58，27. 68，45. 04，50. 91，104. 57，111. 08，112. 24，113. 57，122. 28，122. 86，127. 52， 128. 79, 131. 58, 141. 07, 142. 72, 154. 59, 179. 34. HRMS (TOF MS ES+) cal cd. for C46H54Br2N42+[M-2Br_]2+820. 2704，found820. 2706.實(shí)施例9化合物H的制備<formula>formula see original document page 15</formula>將5mmol 1，1，- (1，4_苯乙二基)-雙2，3，3_三甲基_3H吲哚季銨鹽與12讓ol 4-N，N-二甲胺基苯乙烯醛加入到25ml含IOml乙醇的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱回流4h 后，將反應(yīng)液置于-20°C下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干 燥，得到藍(lán)色固體粉末，收率75%。IH NMR(400MHz, DMS0_d6，ppm) 1. 77 (s, 12H, C (CH3) 2)，2. 84 (t，4H，J = 7. 2， CH2CH2N+) ,3. 09 (s, 12H, N(CH3)2)，5. 10(t，4H，J = 7. 2，CH2-N+)，6. 81 (d，4H，J = 8. 0， Ar-H)，7. 06 (d, 2H, J = 14. 4，CH = CH)，7. 25 (t, 2H, J= 12. 8，CH = CH)，7. 35-7. 84 (m, 18H, Ar-H+CH = CH)，8. 48(t，2H，J = 12.8，CH = CH). 13C NMR(1OOMHz, DMS0_d6，ppm) 26. 47,30. 85,47. 68,48. 56,50. 96,110. 16,112. 44,113. 68，122. 943，123. 77，127. 31， 127. 66，128. 86，132. 14，133. 82，141. 12，142. 53，153. 27，153. 9，157. 83，179. 66. HRMS (T0F MS ES+)calcd. for C54H60N42+[M-2I-] 2+764. 4807, found 764.4801.實(shí)施例10化合物I的制備
<formula>formula see original document page 15</formula>將5mmol 1，1，-(1，10-癸二基)-雙2，3，3_三甲基_3H苯并吲哚季銨鹽與13mmcl 4-N, N- 二甲胺基苯乙烯甲醛加入到25ml含IOml乙二醇單甲醚的圓底燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加 熱回流3h后，將反應(yīng)液置于-20°C下過夜。通過過濾收集析出的固體，并用乙酸乙酯淋洗，然后真空干燥，得到深藍(lán)色固體粉末，收率72%。IH NMR (400MHz, DMS0_d6，ppm) :1· 39(m，8H，CH2)，1. 54(m，4H，CH2CH2CH2N+)， 1. 71 (s，12H, C(CH3)2)，1. 80(m，4H，CH2CH2CH2N+)，3· 08 (s，12Η, N(CH3)2)，4· 42(t，4H， J = 7.2, CH2CH2CH2-N+)，6. 82 (d, 4H，J = 8· 0，Ar-H)，7. 15 (d, 2Η, J = 14. 8，CH = CH)， 7. 41(d，2H，J = 12. 8，CH = CH), 7. 60(d，4H，J = 8· 4，Ar-H), 7. 71(t，2H，J = 8· 0，Ar-H)， 7. 78 (d, 2Η, J = 12. 8，CH = CH)，7. 82 (t，2Η，J = 8· 0，Ar-H)，7. 93 (d, 2H，J = 8· 8，Ar-H)， 7. 97 (d, 4H, J = 8· 4，Ar-H)，8. 22 (d, 2H, J = 8· 4，Ar-H)，8. 35 (t, 2H, J= 12. 8, CH = CH). 13C NMR(1 OOMHz, DMS0_d6，ppm) :25. 26，26. 01，26. 74，27. 91，29. 74，45. 69，51. 31， 53. 34，110. 95,112. 69，114. 07，123. 28，123. 34，124. 21,126. 65，128. 34，129. 40，132. 31， 133. 50，137. 43，141. 33，143. 14，145. 72，153. 00，153. 41,157. 19，179.46.HRMS (TOF MS ES+)calcd. forC62H72N42+[M-2C1-]2+872. 5746，found 872.5754.實(shí)施例11不同pH下，化合物A的吸收和發(fā)射光譜的測定分別配置濃度為ImM的化合物A、B的DMSO (二甲基亞砜)溶液，分別取40 μ L，稀 釋至20mL，置于雙口燒瓶中，用濃的鹽酸溶液將溶液調(diào)至酸性，然后用稀的氫氧化鈉溶液調(diào) 節(jié)溶液的PH，同時(shí)記錄溶液在此pH下的吸收和發(fā)射光譜。隨著pH的降低，化合物在465nm 處的吸收峰升高，366nm和560nm處的吸收峰下降，存在兩個(gè)等吸收點(diǎn)，表明有兩種酸堿平 衡存在。而以465nm和560nm為激發(fā)波長的發(fā)射峰同時(shí)升高。所用儀器為紫外可見分光光 度計(jì)，型號(hào)Hp8453 ；熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500 ；pH計(jì)，型號(hào)LEICI。實(shí)施例12不同pH下，化合物B的吸收和發(fā)射光譜的測定以及pKa的估算分別配置濃度為ImM的化合物B的DMSO ( 二甲基亞砜)溶液，分別取40 μ L，稀釋 至20mL，置于雙口燒瓶中，用濃的鹽酸溶液將溶液調(diào)至酸性，然后用稀的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) 溶液的PH，同時(shí)記錄溶液在此pH下的吸收和發(fā)射光譜。隨著pH的降低，化合物在430nm處 的吸收峰升高，550nm處的吸收峰下降，475nm處存在一個(gè)等吸收點(diǎn)，表明存在一種酸堿平 衡。而以430nm和550nm為激發(fā)波長的發(fā)射峰隨著其對(duì)應(yīng)發(fā)射波長強(qiáng)度的升高而升高。對(duì) 化合物的熒光強(qiáng)度與PH做sigmoidal擬合，曲線上最大強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的pH即為化合物的 PKa0得到化合物B的pKa為5. 2，表明化合物適用于活細(xì)胞酸性細(xì)胞器成像。所用儀器為 紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)Hp8453 ；熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500 ；pH計(jì)，型號(hào)LEICI。實(shí)施例13 共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察化合物A對(duì)活細(xì)胞MCF-7的染色加配有化合物A、濃度為2 μ M的PBS緩沖液12 μ L于培養(yǎng)好MCF-7細(xì)胞的六孔板 中，在37°C、5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30min。然后，PBS震蕩漂洗5minX 3，再加入細(xì)胞 培養(yǎng)基，共聚焦激光掃描顯微鏡(TCS-SP2，Germany)觀察細(xì)胞形態(tài)。選取代表性區(qū)域，綠色 (458nm)、紅色(543)雙通道激發(fā)，用油鏡(1000X)觀察，重復(fù)三次。圖7從左到右依次為 綠色通道成像圖片、紅色通道成像圖片、雙通道疊加圖片和亮場圖片。如圖可觀察到化合物 A對(duì)MCF-7細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的酸性區(qū)域特異性染色，并可以雙色成像。所用儀器為共聚焦激光掃描顯微鏡，型號(hào)TCS-SP2。實(shí)施例14
化合物C、D、E的固態(tài)光譜的測定測定化合物固態(tài)發(fā)射光譜是通過發(fā)射的原理進(jìn)行的。測試時(shí)直接將粉末裝入到測 試槽中，調(diào)節(jié)樣品角度，使反射的光線恰好進(jìn)入接收器上，記錄發(fā)射光譜。所用儀器為熒光 分光光度計(jì)，型號(hào)LS 55。為了更直觀的比較，拍攝了化合物C與已知化合物Sl的日光下粉末顏色和紫外燈 下固體熒光照片。實(shí)施例15
化合物G和已知化合物Sl與小牛胸腺DNA結(jié)合前后吸收、發(fā)射光譜及熒光增強(qiáng)倍 數(shù)的測定配置濃度為ImM的化合物G、Sl的DMSO (二甲基亞砜)溶液，分別取6 μ L，加pH 7.4、10mM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液稀釋至3mL，置于比色皿中，測定其熒光 強(qiáng)度。配置一定濃度的小牛胸腺DNA的水溶液，通過紫外吸收分光光度計(jì)測定其260nm處 的吸光度值，標(biāo)定其濃度為1. 5mM。另分別取濃度為ImM的化合物G、S1的DMSO (二甲基亞 砜)溶液6 μ L于比色皿中，再分別向其中加入濃度為1. 5mM的小牛胸腺DNA溶液200 μ L， 最后加pH 7.4、10mM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液稀釋至3mL，測定其熒光強(qiáng)度。 作用后，Sl的吸收強(qiáng)度變大，波長沒有變化；而G的吸收光譜形狀改變。相同條件下(相同 底物濃度和DNA濃度)，已知染料Si，與小牛胸腺DNA結(jié)合后，相對(duì)熒光強(qiáng)度增加5. 9 (1/10 =190/32 = 5. 9)倍；而化合物G與小牛胸腺DNA結(jié)合后，相對(duì)熒光強(qiáng)度可增加91(1/10 = 600/6.6 = 91)倍。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)Hp8453 ；熒光分光光度計(jì)，型號(hào) FP-6500。實(shí)施例16化合物G與不同濃度的小牛胸腺DNA結(jié)合后熒光發(fā)射光譜的測定配置濃度為ImM的化合物G的DMSO (二甲基亞砜)溶液，取6 μ L，加pH7. 4、IOmM 的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液稀釋至3mL，置于比色皿中，測定其熒光強(qiáng)度。配置 一定濃度的小牛胸腺DNA的水溶液，通過紫外吸收分光光度計(jì)測定其260nm處的吸光度值， 標(biāo)定其濃度為1. 5mM。另分別取濃度為ImM的化合物G的DMSO (二甲基亞砜)溶液6 μ L 于比色皿中，再分別向其中加入不同體積的、濃度為1. 5mM的小牛胸腺DNA溶液，最后加pH 7.4、10mM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液稀釋至3mL，測定其熒光強(qiáng)度。隨著DNA 濃度的增加，化合物G的熒光強(qiáng)度不斷升高。當(dāng)DNA濃度超過30 μ M時(shí)，熒光增強(qiáng)趨勢變 緩。在這一濃度范圍內(nèi)對(duì)化合物G熒光強(qiáng)度和DNA濃度進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)兩者這件存在 很好的線性關(guān)系。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)Ηρ8453 ；熒光分光光度計(jì)，型號(hào) FP-6500。實(shí)施例17化合物H和已知化合物S2與牛血清白蛋白BSA結(jié)合前后吸收、發(fā)射光譜及熒光增 強(qiáng)倍數(shù)的測定配置濃度為ImM的化合物H、S2的DMSO (二甲基亞砜)溶液，分別取6 μ L，加pH 7.4、10mM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液稀釋至3mL，置于比色皿中，測定其熒光 強(qiáng)度。配置5mM的牛血清白蛋白BSA的水溶液。另分別取濃度為ImM的化合物H、S2的 DMSO (二甲基亞砜)溶液6μ L于比色皿中，再分別向其中加入濃度為5mM的小牛胸腺DNA溶液30yL，最后加pH 7. O、IOmM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液稀釋至3mL，測定 其熒光強(qiáng)度。作用后，S2的吸收強(qiáng)度變小，波長沒有變化；而G的吸收光譜形狀改變并且伴 有波長紅移。相同條件下(相同底物濃度和BSA濃度)，已知染料S2，與牛血清白蛋白BSA 結(jié)合后，相對(duì)熒光強(qiáng)度增加1. 5(1/10 = 40. 2/26. 8 = 1.5)倍；而化合物H與牛血清白蛋白 BSA結(jié)合后，相對(duì)熒光強(qiáng)度可增加19(1/10 = 159. 6/8. 3 = 19)倍。所用儀器為紫外可見分 光光度計(jì)，型號(hào)Hp8453 ；熒光分光光度計(jì)，型號(hào)FP-6500。實(shí)施例18化合物H與不同濃度的牛血清白蛋白BSA結(jié)合后熒光發(fā)射光譜的測定配置濃度為ImM的化合物H的DMSO (二甲基亞砜)溶液，取6 μ L，加pH7. 0、IOmM 的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液稀釋至3mL，置于比色皿中，測定其熒光強(qiáng)度。配置 5mM的牛血清白蛋白BSA的水溶液。另分別取濃度為ImM的化合物H的DMSO ( 二甲基亞砜) 溶液6μ L于比色皿中，再分別向其中加入不同體積的、濃度為5mM的牛血清白蛋白BSA溶 液，最后加PH 7. OUOmM的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液稀釋至3mL，測定其熒光強(qiáng) 度。隨著BSA濃度的增加，化合物H的熒光強(qiáng)度不斷升高。當(dāng)BSA濃度超過8. 5μ M時(shí)，熒 光增強(qiáng)趨勢變緩。在這一濃度范圍內(nèi)對(duì)化合物H熒光強(qiáng)度和BSA濃度進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn) 兩者這件存在很好的線性關(guān)系。所用儀器為紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)Ηρ8453 ；熒光分光 光度計(jì)，型號(hào)FP-6500。實(shí)施例19化合物F、I的活細(xì)胞通透性測試加配有化合物F、I，濃度為1.5μΜ的PBS緩沖液12 μ L干培養(yǎng)好PC12細(xì)胞的六 孔板中，在37°C、5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30min。然后，PBS震蕩漂洗5minX 3，再加入 細(xì)胞培養(yǎng)基，共聚焦激光掃描顯微鏡(Nikoneclipase TE 2000-5)觀察細(xì)胞形態(tài)。選取代 表性區(qū)域，510-570nm激發(fā)，成像三次。圖16從左到右依次為化合物F對(duì)活細(xì)胞PC12的亮 場成像照片、化合物F對(duì)活細(xì)胞PC12的熒光成像照片；化合物I對(duì)活細(xì)胞PC12的亮場成像 照片、化合物I對(duì)活細(xì)胞PC12的熒光成像照片。如圖可觀察到化合物F、I具有良好的細(xì)胞 膜通透性。所用儀器為Nikon eclipase TE 2000-5。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。作為熒光染料是本發(fā)明新化合物的一種用途，不能認(rèn)定本發(fā)明的化合物僅用于 熒光染料，對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在基于本發(fā)明化合物用作熒光 染料的相同作用機(jī)理的考慮下，還可以做出若干簡單推理，得出本發(fā)明的化合物的其他應(yīng) 用用途，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一類吲哚類半菁染料，其特征在于所述染料分子具有結(jié)構(gòu)通式I其中R1＝H、鹵素、硝基、磺酸基，R2＝H；或R1R2組成萘吲哚環(huán)R3和R4各自獨(dú)立選自H、羥基、鹵素、硝基、C1-4烷基；R5為H、羥基、N((CH2)mR7)2，其中R7＝H、OH、OAc、COOH、COOCH3、苯基；R6為(CH2)pR8，其中R8＝H、OH、C＝C、炔基、OAc、COOH、COOCH3、COOC2H5、p-(C6H4)R9，其中R9＝H、CH3、鹵素、NO2、CN、COOH、L-A；Y-＝鹵素離子、ClO4-、PF6-或TsO-；L＝-C1-18烷基-、p-(CH2)q(C6H4)(CH2)q-；m＝1～18，n＝1或2，p＝0～18，q＝1-6。FSA00000058917700011.tif,FSA00000058917700012.tif
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一類吲哚類半菁染料，其特征在于當(dāng)n = 1、R5為羥基時(shí)，具 有結(jié)構(gòu)式II 其中R1 = H、鹵素、硝基、磺酸基，R2 = H ；或R1R2組成萘吲哚環(huán).9R3和R4各自獨(dú)立選自H、羥基、鹵素、硝基、C1-4烷基；R6 為(CH2)pR8，其中:R8 = H、0H、C = C、炔基、OAc、C00H、C00CH3、C00C2H5、p-(C6H4) R9，其中R9 = H、CH3、鹵素、N02、CN、C00H ； Y-=鹵素離子、C104-、PF6-或 TsO-； p = 1 18。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的一類吲哚類半菁染料，其特征在于當(dāng)R2 = H、n = 1時(shí)，組成 結(jié)構(gòu)式III 其中R1 =H、鹵素、硝基、磺酸基。R3和R4各自獨(dú)立選自H、羥基、鹵素、硝基、C1-4烷基；R5 為 H、羥基、N((CH2)mR7)2，其中R7 = H、OH、OAc、C00H、C00CH3、苯基；R6 為(CH2)pR8，其中:R8 = H、OH、OAc、C00H、C00CH3、C00C2H5、p-(C6H4) R9，其中:R9=H、CH3、鹵素、N02、CN、COOH ；Y-=鹵素離子、C104-、PF6-或 TsO-； m = 1 18 ;p = 0 18。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的一類吲哚類半菁染料，其特征在于當(dāng)R6= L-A時(shí)，具有結(jié)構(gòu) 通式IV <formula>formula see original document page 3</formula>其中R1 = H、鹵素、硝基、磺酸基，R2 = H ；或R1R2組成萘吲哚環(huán)<formula>formula see original document page 3</formula>.R3和R4各自獨(dú)立選自H、羥基、鹵素、硝基、C1-4烷基；R5 為 H、N((CH2)mR7)2，其中:R7 = H、OH、OAc、C00H、C00CH3、苯基；Y-=鹵素離子、C104-、PF6-或 TsO-；L = -C1-18 烷基 _、或 p- (CH2) q (C6H4) (CH2) q-；m = 1 18，η = 1、2，ρ = 1 18，q = 1-6。
5.據(jù)權(quán)利要求2所述的一類吲哚類半菁染料，其特征在于所述具有結(jié)構(gòu)式II的化合 物用作PH熒光探針。
6.據(jù)權(quán)利要求3所述的一類吲哚類半菁染料，其特征在于所述具有結(jié)構(gòu)式III的化 合物用作固體熒光化合物。
7.據(jù)權(quán)利要求4所述的一類吲哚類半菁染料，其特征在于所述具有結(jié)構(gòu)式IV的化合 物用作生物熒光探針。
全文摘要
一類吲哚類半菁染料的合成與應(yīng)用，屬于精細(xì)化工領(lǐng)域中一類功能染料的合成及其作為熒光染料的應(yīng)用。這類化合物由吲哚季銨鹽與相應(yīng)的醛縮合而成，具有摩爾消光系數(shù)大，光穩(wěn)定性好，易于合成等優(yōu)點(diǎn)。該類分子根據(jù)其取代基、陰離子的不同，可以具有pH探針性質(zhì)、固態(tài)熒光性質(zhì)和與生物大分子結(jié)合的性能。作為pH探針時(shí)，可根據(jù)取代基的不同調(diào)節(jié)探針的pKa，并且可用于雙色活細(xì)胞成像；作為固態(tài)發(fā)射染料時(shí)，根據(jù)取代基與陰離子的不同，可以調(diào)節(jié)其固態(tài)發(fā)射波長；作為生物分子探針時(shí)，對(duì)生物分子有很好的反應(yīng)，且具有活細(xì)胞細(xì)胞膜通透能力，可用于細(xì)胞染色，而且由于其吸收和發(fā)射波長較長，可以避免生物質(zhì)自熒光的干擾，還能降低激發(fā)光對(duì)細(xì)胞或生物組織的損傷。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101805526SQ201010144000
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2010年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月10日
發(fā)明者吳彤, 彭孝軍, 樊江莉, 王炳帥, 王靜云 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)