一類兩親性吲哚方酸菁染料及其長(zhǎng)效標(biāo)記溶酶體的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)合成及生物標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一類兩親性吲哚方酸菁染料 的合成及其在特異性溶酶體標(biāo)記方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們對(duì)生命科學(xué)探索的不斷深入，細(xì)胞甚至亞細(xì)胞層次上的生命活動(dòng)更加引 人關(guān)注。溶酶體是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的重要亞細(xì)胞器，是細(xì)胞的"消化器官"。溶 酶體與生物體健康息息相關(guān)，人類的許多疾病如矽肺、肺結(jié)核等都與溶酶體有關(guān)。因此利用 生物熒光成像技術(shù)，對(duì)細(xì)胞溶酶體進(jìn)行觀察與監(jiān)測(cè)有著重要意義。
[0003] 目前的能夠?qū)崿F(xiàn)溶酶體靶向物質(zhì)主要分為抗體及熒光染料。其中，抗體的價(jià)格昂 貴且在生物體內(nèi)容易失活；熒光染料的染色穩(wěn)定性差，僅可在較短時(shí)間內(nèi)標(biāo)記溶酶體，不能 用于對(duì)溶酶體的長(zhǎng)時(shí)間觀察。
[0004] 吲哚菁染料是生物熒光標(biāo)記中一類重要的成像劑。與常用的羅丹明、熒光素等有 機(jī)染料相比，吲哚菁的紫外吸收和熒光發(fā)射位于近紅外區(qū)，這可以有效避免成像時(shí)生物體 自身的背景干擾，從而提高檢測(cè)的靈敏度。目前商業(yè)化的吲哚菁染料的應(yīng)用范圍僅限于靜 態(tài)的細(xì)胞膜標(biāo)記且標(biāo)記時(shí)間很短，并不能標(biāo)記其他亞細(xì)胞器或用于長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞。 而且商業(yè)化染料多為油溶性，在生物體內(nèi)易聚集而導(dǎo)致熒光猝滅。同時(shí)，對(duì)有機(jī)助溶劑的依 賴也進(jìn)一步增加了其生物毒性。因此為了更好的研究細(xì)胞的生命活動(dòng)，開(kāi)發(fā)一種能水溶、標(biāo) 記時(shí)間更長(zhǎng)并且能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞動(dòng)態(tài)的成像試劑具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一類兩親性吲哚方酸菁染料及其合成方法，該類染料可用于活細(xì)胞 溶酶體標(biāo)記，并能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
[0006] 本發(fā)明使用4號(hào)位由溴、氫或甲基取代的苯肼鹽酸鹽為原料，制備得到帶有上述 三種取代基且?guī)в恤然δ芑倪胚岱剿彷既玖?，然后通過(guò)羧基與伯胺的縮合反應(yīng)進(jìn)一步 將氨基引入染料分子。由于方酸基團(tuán)的引入，染料具有較好的光穩(wěn)定性，染料結(jié)構(gòu)包含疏水 部分及帶有伯胺的親水部分，具有兩親性，無(wú)需有機(jī)助溶劑即可直接用于細(xì)胞標(biāo)記，因此具 有較低的細(xì)胞毒性。染料的疏水部分可通過(guò)疏水作用嵌插到溶酶體膜中；親水端的氨基質(zhì) 子化后帶正電荷，可與細(xì)胞膜表面的負(fù)電基團(tuán)靜電相吸。在活細(xì)胞中，由于溶酶體內(nèi)為弱酸 性，氨基在此會(huì)完全質(zhì)子化，靜電作用更加強(qiáng)烈，因此染料與溶酶體膜的結(jié)合力更強(qiáng)。
[0007] 本發(fā)明所述的兩親性吲哚方酸菁染料結(jié)構(gòu)式為：
[0008]
[0009] 其中，R為H，Br，或CH3。
[0010] 上述的兩親性吲哚方酸菁染料的合成方法為：
[0011] 1).將10-20mmol4-R基苯肼鹽酸鹽及10-24mmol3-甲基-2-丁酮加入到5-20mL 的冰醋酸中，回流反應(yīng)8-20小時(shí)，懸蒸除去溶劑后，用二氯甲烷溶解，并用飽和NaHC03水溶 液洗滌至水相無(wú)色、pH中性，取有機(jī)相旋蒸除去溶劑，得到5-R基-2, 3, 3-三甲-3H-基吲 噪；
[0012] 2).將3-10臟〇1的5-1?基-2,3,3-三甲-3!1-基吲哚與3-12111111〇1的對(duì)卞溴基苯甲 酸加入10_20mL乙腈中，回流反應(yīng)10-20小時(shí)，旋蒸除去溶劑后用乙醚沉淀并洗滌，干燥后 得到中間產(chǎn)物吲哚啉衍生物；
[0013] 3).將1-5111111〇1步驟2)合成的吲哚啉衍生物與0.5-2.5111111〇1的3,4-二羥基-3-環(huán) 丁烯-1，2-二酮加入10-20mL甲苯和正丁醇的混合溶液中，甲苯和正丁醇的體積比為 1:0. 8-1. 5,并加入5-10mL吡啶；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，緩慢升溫至100-120°C，15-30小時(shí)后用乙 醚沉淀得到中間產(chǎn)物吲哚方酸菁衍生物；
[0014] 4).將0.5-lmmol步驟3)合成的吲哚方酸菁衍生物、2-4mmol的2-(7-偶氮苯并三 氮挫）-N,N,Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯和2_4mmol二異丙基乙胺加入5-10mmolN,N-二 甲基甲酰胺中，室溫下反應(yīng)15-30分鐘后加入N-叔丁氧羰基-1，2-乙二胺4-5mmol，繼續(xù)室 溫下反應(yīng)2-8小時(shí)后用乙醚沉淀得到叔丁氧羰基保護(hù)的吲哚方酸菁衍生物；
[0015] 5).將0.1-lmmol叔丁氧羰基保護(hù)的吲哚方酸菁衍生物與5-10mL三氟乙酸加入至 5-10mL二氯甲烷中，室溫下反應(yīng)2-10小時(shí)后旋蒸除去溶劑并用乙醚沉淀，得到兩親性吲哚 方酸菁染料；
[0016] 步驟1)和2)中的R為H，Br，或CH3。
[0017] 上述的兩親性吲哚方酸菁染料在活細(xì)胞中標(biāo)記溶酶體的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0019] 1.本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的兩親性吲哚方酸菁染料紫外吸收和熒光發(fā)射均位于近紅外 區(qū)，在生物成像過(guò)程中可大大降低背景熒光的干擾；
[0020] 2.本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的兩親性B引噪方酸菁染料具有水溶性，不依賴有機(jī)助溶劑可直 接用于生物成像，有較低的生物毒性；
[0021] 3.本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的兩親性吲哚方酸菁染料中的氨基在溶酶體酸性環(huán)境下充分 質(zhì)子化，與溶酶體膜的靜電作用更加強(qiáng)烈，因而可以標(biāo)記活細(xì)胞的溶酶體，標(biāo)記持續(xù)時(shí)間可 達(dá)48小時(shí)以上。吲哚菁類染料在溶酶體標(biāo)記方面的應(yīng)用還屬首次。
[0022] 4.本發(fā)明提供的兩親性吲哚方酸菁染料合成工藝成熟，產(chǎn)品穩(wěn)定性好，毒性低，該 兩親性吲哚方酸菁染料可長(zhǎng)時(shí)間特異性標(biāo)記活細(xì)胞的溶酶體，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞溶酶體長(zhǎng)時(shí)間 動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1合成兩親性吲哚方酸菁染料的反應(yīng)流程圖。
[0024] 圖2實(shí)施例1中產(chǎn)物的核磁氫譜表征。
[0025] 圖3實(shí)施例1中產(chǎn)物的核磁碳譜表征。
[0026] 圖4實(shí)施例1中產(chǎn)物的質(zhì)譜表征。
[0027] 圖5為實(shí)施例1中兩親性吲哚方酸菁染料D1的表觀顏色及光譜性能。
[0028] 圖6為實(shí)施例1中D1標(biāo)記活Cos7細(xì)胞溶酶體的熒光顯微鏡照片。
[0029] 圖7為實(shí)施例1中D1與商業(yè)化細(xì)胞膜染料Dil及溶酶體染料LysoTracker的毒 性對(duì)比，可以看出在高濃度下D1仍保持較低的細(xì)胞毒性。
[0030] 圖8為實(shí)施例1中D1與商業(yè)化溶酶體染料LysoTracker用于活細(xì)胞溶酶體動(dòng)態(tài)監(jiān) 測(cè)，圖中可看出D1的標(biāo)記時(shí)間長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)（A)，而Lysotracker僅在兩小時(shí)內(nèi)有效果（B)。
[0031] 圖9為實(shí)施例1中D1與LysoTracker標(biāo)記焚光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，D1可用于長(zhǎng) 效溶酶體標(biāo)記。
[0032]圖10為兩親性吲哚方酸菁染料與溶酶體膜結(jié)合的示意圖，染料嵌插入膜結(jié)構(gòu)的 磷脂分子后可用于長(zhǎng)效標(biāo)記溶酶體。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。本發(fā)明不限于這些具體的實(shí)施 例。
[0034] 實(shí)施例1 :
[0035] 1.將2. 23g(10mmol)4_溴苯肼鹽酸鹽及0· 86g(10mmol)3_甲基-2-丁酮加入到 10mL的冰醋酸中，回流反應(yīng)12小時(shí)，懸蒸除去溶劑后，用二氯甲烷溶解，并用飽和NaHC03 水溶液反復(fù)洗滌至水相無(wú)色、pH中性，取有機(jī)相旋蒸除去溶劑，得到5-溴-2,3,3-三 甲-3H-基吲哚L88g(7.9mmol)，產(chǎn)率 79%;
[0036] 4NMR(400MHz，CDC13)δ7. 40 (s，3H)，2. 27 (s，3H)，1. 30 (s，6H) ·
[0037] 2.將1.198(5臟〇1)5-溴-2,3,3-三甲-3!1-基吲哚與1.088(5臟〇1)的對(duì)卞溴基 苯甲酸加入15mL乙腈，回流反應(yīng)20小時(shí)，旋蒸除去溶劑后用乙醚沉淀并多次洗滌，干燥后 得到中間產(chǎn)物吲哚啉衍生物1. 72g(3. 8mmol)，產(chǎn)率76% ;
[0038]NMR(400MHz,MeOD)δ8. 10 (s, 3H), 7. 76 (s, 1H), 7. 67 (s, 1H), 7. 49 (s, 2H), 5. 93 ( s, 2H), 1. 72 (s, 6H).
[0039] 3.將 1. 35g(3mmol)吲噪啉衍生物與 171mg(1. 59mmol)的 3, 4-二羥基-3_ 環(huán)丁 烯-1，2-二酮（方酸）加入10mL甲苯正丁醇（體積比為1 :1)混合液中，并加入5mL吡啶， 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，緩慢升溫至115°C，24小時(shí)后用乙醚沉淀得到中間產(chǎn)物吲哚方酸菁衍生物 80511^(0.98臟〇1)，產(chǎn)率65% ;
[0040]HRMS(ESI-TOF):Calcdfor[M+H]+,821. 08,Found,821. 07.
[0041] 4.將411mg(0. 5mmol)吲噪方酸菁衍生物、1. 9g(5mmol)2-(7-偶氮苯并三氮 唑）-N,N,Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)和1. 65mL(10mmol)二異丙基乙胺（DIPEA)加 入5mmolN，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，室溫下反應(yīng)15分鐘后加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙 二胺644mg(10mm〇l)，繼續(xù)室溫下反應(yīng)2小時(shí)后用乙醚沉淀得到叔丁氧羰基（Boc)保護(hù)的吲 哚方酸菁衍生物404mg(0. 37mmol)，產(chǎn)率73% ;
[0042] HRMS(ESI-TOF) :m/zcalcdfor[M+H]+, 1105. 30 ；found, 1105. 3 12 1 ； [M+Na]+, 1127. 30 ;found, 1127. 294L
[0043] 5.將331mg(0. 3mmol)Boc保護(hù)的吲噪方酸菁衍生物與5mL三氟乙酸加入至5mL二 氯甲烷中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后旋蒸除去溶劑并用乙醚沉淀，得到兩親性吲哚方酸菁染料 Dl(250mg，產(chǎn)率92% )，結(jié)構(gòu)式為：
[0044]
[0045] NMR(400MHz,MeOD)δ7. 89 (s, 2Η), 7. 70 (s, 1Η), 7. 48 (s, 1H), 7. 38 (s, 2H), 7. 15 ( s, 1H), 5. 98 (s, 1H), 5. 45 (s, 2H), 3. 66 (s, 3H), 3. 16 (s, 2H), 3. 04 (s, 3H), 1. 80 (s, 6H) ·13CNM R(100MHz,MeOD,δ) 178. 85, 172. 37, 170. 63, 145. 27, 143. 00, 140. 12, 134. 68, 132. 34, 129. 29, 127. 85, 127. 02, 118. 60, 113. 16, 105. 20, 88. 50, 64. 92, 50. 88, 43. 36, 41. 06, 40. 36, 38. 79, 27. 33, 18. 57, 15. 62.HRMS(ESI-TOF) :m/zcalcdfor[M+H]+, 905. 2026 ；found, 905. 2025 ；[M+Na]+, 927. 1845 ；found, 929. 1827.
[0046] 兩親性吲哚方酸菁染料對(duì)活細(xì)胞溶酶體的特異性標(biāo)記：
[0047] 將兩親性吲哚方酸菁染料