專(zhuān)利名稱(chēng)：用于生物化學(xué)反應(yīng)的冷凍干燥的組合物的制作方法
用于生物化學(xué)反應(yīng)的冷凍干燥的組合物本發(fā)明涉及用于化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的包括試驗(yàn)試劑的組 合物和涉及制備這些組合物的方法。冷凍干燥是材料，尤其生物材料如細(xì)胞和蛋白質(zhì)，的長(zhǎng)期儲(chǔ)存的常用方法。然而， 包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的許多材料在這一方法中是不穩(wěn)定的。該問(wèn)題一定程度上通過(guò)糖如二糖如 蔗糖、麥芽糖、海藻糖和乳糖在用于冷凍干燥中的配制劑中的添加來(lái)解決的。這些糖用作玻 璃形成用的試劑，而且和看來(lái)似乎在冷凍干燥過(guò)程中保護(hù)蛋白質(zhì)。已經(jīng)表明這歸因于蛋白 質(zhì)與二糖之間的經(jīng)由氫鍵所進(jìn)行的直接相互作用，該氫鍵作用對(duì)于穩(wěn)定效果是必要的，因 為這會(huì)防止在冷凍干燥過(guò)程中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。這意味著冷凍干燥現(xiàn)在可以用來(lái)穩(wěn)定包括蛋白質(zhì)如酶和細(xì)胞在內(nèi)的復(fù)雜反應(yīng)體 系，尤其為了儲(chǔ)存目的。然而，一般來(lái)說(shuō)，另外的穩(wěn)定劑如聚合物(包括聚合化合物，如聚乙 二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和/或多糖(如Ficoll或Dextran))用來(lái)維持酶活 性。這些聚合物通常是有助于形成均勻的餅塊結(jié)構(gòu)的餅塊穩(wěn)定化賦形劑。這通過(guò)允許形成 均勻的基質(zhì)使得在升華過(guò)程中實(shí)現(xiàn)水的有效離開(kāi)而有助于該干燥過(guò)程。它們因此影響最終 餅塊結(jié)構(gòu)。此外，在例如化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)中常常一起使用的一些試劑的冷凍干燥的混合 物的制備中引起復(fù)雜化。例如，廣泛使用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(包括逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR))采用一定范圍的標(biāo)準(zhǔn)試劑，包括鹽如氯化鎂(MgCl2)和氯化鉀，聚合 酶酶如Taq聚合酶，緩沖劑如Tris-HCl，和為核酸的擴(kuò)增所需要的核苷酸。此類(lèi)制劑例如 作為“即可使用的 PCR 珠粒(ready-to-go PCR beads)，，從 Amersham Biosciences (UK) / Pharmacia 1 !!^一般而言，這些是通過(guò)冷凍干燥方法制備的，它是在玻璃形成用試劑和針對(duì)所形 成的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定劑以及任選的填料的存在下進(jìn)行的(參見(jiàn)例如US專(zhuān)利No. 5，250，429，US 專(zhuān)利No. 5，763，157和ΕΡ-0726310)。海藻糖尤其已經(jīng)用于PCR混合物中以協(xié)助穩(wěn)定化和作 為PCR增強(qiáng)劑用于非冷凍干燥的配制劑中。然而，在這些反應(yīng)混合物中用作玻璃形成用試 劑和穩(wěn)定劑的試劑的選擇中應(yīng)當(dāng)注意確保它們不會(huì)干涉或過(guò)度地抑制其中所述組合物需 要參與的化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)。盡管如此，當(dāng)需要時(shí)，此類(lèi)珠粒為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行它們的選擇的PCR反應(yīng)提供方便的 和容易可行的手段。一般，使PCR適用于特殊靶向物(target)的特定試劑，如為了例如與 實(shí)時(shí)PCR相關(guān)聯(lián)使用所需要的引物(primer)和任何探針，連同芯珠粒(core bead) 一道在 反應(yīng)準(zhǔn)備好的“現(xiàn)場(chǎng)”被添加進(jìn)去。然而，在很多情況下，尤其在診斷領(lǐng)域中，這些靶向物(target)在許多情況下是 相同的，并且探針和引物在珠粒中的包含(這樣該珠粒變成測(cè)定特異性的)是便于使用所 希望的。通過(guò)以這種方法添加另外的反應(yīng)組分，穩(wěn)定性問(wèn)題增大，因?yàn)闉榱司S持穩(wěn)定形式 將需要更多的組分。由于測(cè)定的性質(zhì)變得更復(fù)雜，在反應(yīng)中的其它組分如玻璃形成用試劑 和穩(wěn)定劑將干涉或抑制反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增大。
此外，所述其它反應(yīng)組分可以包括可以包含相對(duì)敏感的化學(xué)部分，如標(biāo)記和尤其 光學(xué)標(biāo)記(如熒光標(biāo)記或染料)，的試劑。這些尤其用于“實(shí)時(shí)”進(jìn)行測(cè)定。敏感性部分常 常結(jié)合于低聚核苷酸，后者可以被設(shè)計(jì)用作探針或標(biāo)記的引物。這些將在PCR的過(guò)程中雜 交(hybridise)以擴(kuò)增核酸。在PCR的過(guò)程中探針的歷程和在來(lái)自于該標(biāo)記的相關(guān)信號(hào)上 的變化以各種方式用于監(jiān)測(cè)PCR的進(jìn)展。然而，這樣的部分的存在能夠加劇與組合物的形成相關(guān)的問(wèn)題，這是因?yàn)樵诮M合 物中的穩(wěn)定化用添加劑可能導(dǎo)致信號(hào)發(fā)出功能(尤其來(lái)自熒光標(biāo)記)的減少或抑制。蜜三糖以前已經(jīng)在細(xì)胞或蛋白質(zhì)以及藥物制劑的冷凍干燥中用作玻璃形成用試 劑(Kajuwara et al. Pharmaceutical Research Vol 16，9 1999)，但是迄今還沒(méi)有用于復(fù) 雜化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)混合物的冷凍干燥中。在此類(lèi)混合物中，如以上所述，包括玻璃形成 用試劑的全部組分必須小心地選擇，這樣它們產(chǎn)生穩(wěn)定的和持久的干燥的組合物，并且不 會(huì)以任何有害方式抑制或參與后續(xù)的化學(xué)反應(yīng)。W02006/119280描述了用于反應(yīng)如PCR中 的凍干團(tuán)粒，它包括防凍劑。各種各樣的防凍劑已列于該參考文獻(xiàn)中，其中包括蜜三糖與一 種或多種“多元醇類(lèi)”的混合物，該多元醇類(lèi)似乎在這一背景下在它指糖醇而不是任何多元 醇的意義上使用(因?yàn)樗袝r(shí)候就是)，因?yàn)樘峁┑睦邮歉事短谴蓟蛏嚼嫣谴肌Ｈ欢鴥H僅 海藻糖被表明是可使用的。申請(qǐng)人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了手段來(lái)提供用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的改進(jìn)型冷凍干燥 組合物，其中包括采用熒光標(biāo)記的那些組合物。根據(jù)本發(fā)明，提供了蜜三糖作為冷凍干燥組合物的玻璃形成用試劑的用途，該組 合物預(yù)期用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或逆轉(zhuǎn)錄酶(RT) PCR。申 請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，蜜三糖可用作這些組合物的有效的玻璃形成用試劑和穩(wěn)定劑并且與化學(xué)或 生物化學(xué)反應(yīng)如PCR相容。該蜜三糖不適宜與單體多元醇類(lèi)或糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇 混合，而且這些附加化合物在本發(fā)明的組合物中也不需要。當(dāng)以這種方式使用時(shí)，蜜三糖不 會(huì)抑制反應(yīng)，甚至對(duì)于復(fù)雜的‘實(shí)時(shí)’ PCR反應(yīng)而言。因此，附加的穩(wěn)定劑的使用可以避免， 因此例如熒光信號(hào)發(fā)出系統(tǒng)的抑制被降低。因此本發(fā)明提供用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的組合物，該組合物呈現(xiàn)冷凍干燥 的形式并包括(i)包括至少一些為進(jìn)行實(shí)時(shí)化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)所需要的化學(xué)或生物化 學(xué)試劑的一組試劑，和(ii)蜜三糖。蜜三糖(它可以呈現(xiàn)蜜三糖五水合物形式)用作與化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)相容的有 效的玻璃形成用試劑。合適的冷凍干燥的組合物將包括用于化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)中的那 些，它們采用熒光標(biāo)記或部分作為信號(hào)發(fā)出或指示手段。此外，蜜三糖已經(jīng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生比普通的糖如海藻糖更穩(wěn)定的餅塊。這可以歸因于以 下事實(shí)它也能夠用作干燥劑。與含有海藻糖的組合物相比，通過(guò)冷凍干燥蜜三糖組合物所 獲得的餅塊可具有更好的結(jié)構(gòu)和處置(handling)性能。在一些情況下，用蜜三糖可獲得的 結(jié)果優(yōu)于用含有海藻糖的組合物所獲得的那些結(jié)果，如下面所說(shuō)明。蜜三糖必須以玻璃形成用量存在于組合物中。然而，它不應(yīng)該以如下大的量存在 通過(guò)水的添加實(shí)現(xiàn)組合物的重新組成而生產(chǎn)出用于化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)中的“最終組合 物”時(shí)，它以抑制或以另外方式限制反應(yīng)的量存在。它適宜以一種用量存在于組合物中，該 用量使得它占最終反應(yīng)組合物的約l_10%m/v或l-10%w/w，例如2. 5_10%m/v或2. 5_10%w/w和適宜約5%m/v或5%w/w，當(dāng)配制好準(zhǔn)備用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)時(shí)。下面將更詳細(xì) 地討論，為干燥所制備的組合物(即"餅塊組合物“)可以適宜是更稀的，因此在最初制備 的組合物中蜜三糖的重量百分?jǐn)?shù)(按體積)可以相應(yīng)地降低。下面提供的實(shí)施例中，配制 劑是以各試劑的體積的列表所給出的(在給定的濃度或比活性下)。當(dāng)該體積是指“餅塊 體積”時(shí)，這表示用于該冷凍干燥過(guò)程中的試劑的體積。當(dāng)該體積稱(chēng)為反應(yīng)或最終體積時(shí)， 這是在PCR/RT-PCR反應(yīng)中該試劑的體積或濃度。然而，本申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，甚至當(dāng)以10%m/v或10%w/w存在時(shí)，蜜三糖不會(huì)抑制實(shí) 時(shí)的PCR測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明制備的組合物具有良好的穩(wěn)定性和餅塊形成性能。復(fù)雜反應(yīng)如PCR和 尤其實(shí)時(shí)的PCR沒(méi)有顯著受抑制，甚至當(dāng)熒光信號(hào)發(fā)出功能發(fā)生時(shí)。組合物適宜進(jìn)一步包括抗氧化劑和/或抗-梅拉德(maillard)試劑。本申請(qǐng)人 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸用作特別有效的抗氧化劑和/或抗梅拉德試劑，并且增強(qiáng)該冷凍干燥的 組合物的穩(wěn)定性。尤其，使用L-蘇氨酸。不希望受理論束縛，蘇氨酸似乎與所產(chǎn)生的任何 氧進(jìn)行反應(yīng)并且因此有助于混合物的穩(wěn)定化。此外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸的存在可以導(dǎo)致從包括在組合物中的熒光標(biāo)記可獲得的信 號(hào)發(fā)出功能穩(wěn)定化，尤其當(dāng)在升高的溫度下貯存時(shí)。在組合物中蘇氨酸的量將根據(jù)組合物的準(zhǔn)確性質(zhì)來(lái)變化。該用量適宜地進(jìn)行選 擇，以使得它不影響組合物的PH，該pH值在一些化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)中是重要的。然而，典 型地，它可以以2-10mM，例如約2. 5mM的量存在于組合物中。當(dāng)組合物在玻璃形成用試劑的存在下被冷凍干燥時(shí)，它一般形成“餅塊”型3維結(jié) 構(gòu)。該結(jié)構(gòu)任選地通過(guò)包含餅塊結(jié)構(gòu)用的合適穩(wěn)定劑來(lái)支撐，因此這是混合物的附加組分?？砂诮M合物中的合適穩(wěn)定劑的例子包括聚合化合物，如聚乙二醇(PEG)，聚乙 烯基吡咯烷酮(PVP)和/或多糖如Ficoll或Dextran。然而在特殊的實(shí)施方案中，從組合 物中省去該穩(wěn)定劑，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)化合物如PEG可以促使熒光信號(hào)的抑制。當(dāng)蜜三糖用作 玻璃形成試劑時(shí)，本申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)此類(lèi)化合物的需要減少。同樣在一些情況下，明膠可用來(lái)為餅塊增加穩(wěn)定性。明膠可以從各種的來(lái)源獲得， 其中包括牛(如奶牛)，豬(如豬)，海藻(角叉菜膠)或魚(yú)明膠。(所使用的任何牛(肉) 材料適宜來(lái)自于鑒定的不含BSE的來(lái)源。)魚(yú)明膠尤其可以是優(yōu)選的明膠組分。上述的一組的試劑(i)將根據(jù)所進(jìn)行的化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的特殊性質(zhì)來(lái)選擇。 它們可以包括在多個(gè)或重復(fù)的場(chǎng)合上進(jìn)行的反應(yīng)，如診斷性試驗(yàn)，篩選試驗(yàn)，核酸擴(kuò)增反 應(yīng)，核酸排序列反應(yīng)等等。組合物可以適合用于任何測(cè)定或反應(yīng)中，包括其中采用熒光發(fā)生團(tuán)或熒光部分 或生物發(fā)光試劑如瑩光素酶和瑩光素的那些反應(yīng)，尤其依賴(lài)于使用酶進(jìn)行該程序的那些 反應(yīng)。特定組的此類(lèi)測(cè)定是核酸排序列反應(yīng)和核酸擴(kuò)增反應(yīng)(其中包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)，轉(zhuǎn)錄媒介的擴(kuò)增(TMA)，環(huán)媒介的等溫?cái)U(kuò) 增(LAMP)，滾圓DNA擴(kuò)增，多路轉(zhuǎn)換的連接依賴(lài)性探針擴(kuò)增(MLPA)和多重置換擴(kuò)增。)
合適的熒光試劑包括熒光染料類(lèi)或嵌入劑類(lèi)如STOR Green I, SYBR Gold，溴化乙 錠，YOPRO-UP SYTO染料類(lèi)，其中包括綠色染料如SYTO 9和紅色SYTO染料如SYT0 17， SYT0 59, SYT0 60, SYT0 61, SYT0 62, SYT0 63 和 SYT0 64。
它們也可包括低聚核苷酸，后者用作探針或引物并且用熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。合 適的標(biāo)記(物)包括熒光素或熒光素衍生物，如羧基熒光素化合物，如5-羧基熒光素，6-羧 基熒光素，或它們的琥珀酰亞氨基(succinimidyl)酯，菁染料或若丹明染料。此類(lèi)染料的 特殊例子包括熒光素，JOE, FAM, HEX, ΤΕΤ, TAMRA, ROX Cy5，Cy3，Cy5. 5，BoDIPY FL，若丹明， 若丹明綠，若丹明紅，Oregon Green 488，500 或 514，德克薩斯紅，LightCycler Red 610， 640,670 或 705。其它此類(lèi)染料包括 IDT 染料 MAX550，TEX615, TYE563, TYE665 和 TYE705。深色的淬滅劑也可存在。這些一般用于測(cè)定系統(tǒng)中來(lái)改進(jìn)熒光信號(hào)但是本身不發(fā) 射可檢測(cè)信號(hào)。這些實(shí)質(zhì)上是非熒光染料，其中尤其包括偶氮染料(如DABCYL或DABSl染 料和它們的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物)，三芳基甲烷染料如孔雀綠或酚紅，4’，5-二醚取代的熒光素(例 如描述在美國(guó)專(zhuān)利No. 4，318，846中)，不對(duì)稱(chēng)菁染料淬滅劑(例如描述在WO 99/37717 中)(這些專(zhuān)利中的每一篇通過(guò)引用結(jié)合進(jìn)來(lái))和甲基紅。尤其，淬滅部分是DABCYL(4-( 二甲基氨基偶氮)苯_4_羧酸)或它的衍生物，如 鹵化物或酰胺衍生物，它促進(jìn)該部分連接到低聚核苷酸的氨基酸上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該淬滅部分是在一個(gè)或多個(gè)氨基氮原子上被芳族或雜芳族 環(huán)體系取代的3-和/或6-氨基夾氧雜蒽的實(shí)質(zhì)上非熒光衍生物(例如描述在US專(zhuān)利No. 6，399，392中，該專(zhuān)利的內(nèi)容物通過(guò)引用結(jié)合進(jìn)來(lái))。這些淬滅染料典型地在高于530 nm 處具有最高吸收率，幾乎沒(méi)有或沒(méi)有可觀察到的熒光和有效地淬滅寬譜帶的發(fā)射光，如由 化學(xué)發(fā)色團(tuán)(chemilumiphores)、磷光體或熒光發(fā)生團(tuán)所發(fā)射的光。在一個(gè)實(shí)施方案中，該 淬滅染料是取代的若丹明。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該淬滅化合物是取代的硫酸合對(duì)甲氨基 酚。在特殊的實(shí)施方案中，試劑組是特別適合于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一組試 劑。在這種情況下，(i)項(xiàng)將一般包括當(dāng)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的過(guò)程中粘附于模板核酸序列上 時(shí)能夠延伸(extending)引物的聚合酶。模板核酸可以是DNA或，對(duì)于RT-PCR的情況下， RNA序列。有幾種類(lèi)型的能夠進(jìn)行引物延伸的聚合酶；
1. DNA依賴(lài)性DNA聚合酶將DNA作為模板產(chǎn)生互補(bǔ)DNA。Taq (從棲熱菌屬水生生物 (Thermus aquaticus)獲得)是一個(gè)例子并且這是熱穩(wěn)定的pol酶。它的正常功能是修復(fù) 在細(xì)胞(細(xì)菌)DNA中的斷裂和不匹配。2. RNA依賴(lài)性DNA聚合酶將RNA作為模板并且在稱(chēng)作逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的過(guò)程中產(chǎn) 生互補(bǔ)DNA。MMULV和AMV是這些酶的例子。一般，通常已知的RNA依賴(lài)性DNA聚合酶是非 熱穩(wěn)定的。一些DNA依賴(lài)性DNA聚合酶如Taq具有非常少量的RNA依賴(lài)性DNA聚合酶，但 是該量是太低的并且因此對(duì)于任何目前已知的應(yīng)用幾乎沒(méi)有用處。3. RNA/DNA依賴(lài)性DNA聚合酶是這樣的酶，該酶在某些條件下可將DNA和/ 或RNA在引物延伸反應(yīng)中用作模板以產(chǎn)生DNA。Tth(從棲熱菌屬嗜熱生物(Thermus thermophilus)獲得)是這一類(lèi)型的酶的普通例子，該酶也是熱穩(wěn)定的，但是還有其它酶如 可從Genesys UK Limited獲得的Tsec酶。大部分的這些RNA聚合酶的活性的關(guān)鍵要求是 作為二價(jià)金屬離子的錳的存在，而不是鎂(為大部分其它酶所使用)的存在。上述聚合酶類(lèi)型中的任何一種或這些的組合可以用于本發(fā)明的組合物中，并且該 選擇是以組合物的預(yù)期目的為基礎(chǔ)所進(jìn)行的。
逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)是RNA在PCR周期中按指數(shù)規(guī)律擴(kuò)增之前通過(guò)其讓RNA 首先轉(zhuǎn)化成DNA的過(guò)程。這能夠在三個(gè)不同的反應(yīng)情況下進(jìn)行
1.兩步驟RT-PCR，其中RNA依賴(lài)性DNA聚合酶或RNA/DNA依賴(lài)性DNA聚合酶用于 第一個(gè)反應(yīng)中。這一反應(yīng)可以通過(guò)使用特定的引物，隨意的引物，或甚至poly dT來(lái)引發(fā) (primed)以擴(kuò)增聚腺苷酸化(polyadenylated)細(xì)胞信息。等分試樣然后被轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的 PCR反應(yīng)中以進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。2.兩步驟“結(jié)合的” RT-PCR是這樣的反應(yīng)，其中RNA依賴(lài)性DNA聚合酶與DNA依 賴(lài)性DNA聚合酶在同一的反應(yīng)容器中摻混。使用特定的引物，但是，該過(guò)程事實(shí)是兩個(gè)離散 的過(guò)程(有關(guān)RNA擴(kuò)增和DNA擴(kuò)增)。在其中RNA轉(zhuǎn)化成DNA的第一個(gè)反應(yīng)的完成之后，在 熱循環(huán)的PCR階段的第一個(gè)高溫步驟中非熱穩(wěn)定的RNA依賴(lài)性DNA聚合酶發(fā)生變性。3.單步驟RT-PCR使用DNA/RNA依賴(lài)性DNA聚合酶，這樣在同一個(gè)反應(yīng)容器中附 隨地進(jìn)行該過(guò)程的兩個(gè)階段。RNA和DNA可以在整個(gè)PCR中的引物延伸的全部階段中產(chǎn)生。 這具有增加的優(yōu)點(diǎn)，即在整個(gè)過(guò)程中采用單一的熱穩(wěn)定酶。因此，它常常是在整個(gè)擴(kuò)增步驟 的生產(chǎn)和自動(dòng)化所用的診斷簡(jiǎn)化配制劑中的優(yōu)選途徑。然而，單步驟RT-PCR比通常的PCR在技術(shù)上更有挑戰(zhàn)性，因?yàn)殒V被錳替代以刺激 足夠的RT活性。這具有下列一些效果，發(fā)現(xiàn)最佳的反應(yīng)更具挑戰(zhàn)性
1.鎂影響DNA結(jié)合動(dòng)力學(xué)。它通過(guò)減少在Watson-Crick B-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的電荷 排斥性來(lái)幫助DNA雙螺旋形成。與可能有利于DNA結(jié)合的情況相比，針對(duì)最佳PCR所需要 的錳的濃度范圍低得多。2.高濃度的錳會(huì)引起DNA pol活性以錯(cuò)參核苷酸，因此在有利于引物和模板結(jié)合 的濃度下PCR的保真度可能降低。3.錳要求Tris緩沖液(用于全部其它類(lèi)型的PCR緩沖劑中)被N- 二羥乙基甘 氨酸緩沖劑替代。對(duì)于給定的單步驟RT-PCR方法，以上因素的結(jié)合增大復(fù)雜性和優(yōu)化過(guò)程。在配制 劑和動(dòng)力學(xué)兩者上，該化學(xué)過(guò)程與通常的PCR和兩步驟RT-PCR過(guò)程不同。許多研究組已經(jīng) 嘗試解決這些差異來(lái)克服和固化該化學(xué)過(guò)程。例如US專(zhuān)利7179590描述了新型變異在Tth 聚合酶中的應(yīng)用，它讓聚合酶RT活性被鎂離子所刺激。在特殊的實(shí)施方案中，當(dāng)組合物預(yù)期用于RT-PCR時(shí)，所使用的聚合酶是 Tsec (GeneSys Ltd,UK) RNA/DNA依賴(lài)性DNA聚合酶。正如下面在實(shí)施例7中所述，它可以 通過(guò)使用蜜三糖，按照在本發(fā)明的組合物中的環(huán)境穩(wěn)定形式被凍干。適宜地，以上(i)項(xiàng)的試劑組進(jìn)一步包括緩沖劑，鹽(如鎂和/或錳鹽，這取決于 以上列出的聚合酶的要求)，一種或多種引物以及為了構(gòu)造引物的延伸部分所需要的核苷 酸，后者是進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增靶DNA序列所需要的。在典型的PCR中，所使用的緩 沖劑一般使得該pH在7和9之間，例如在8. 5和8. 8之間，例如在8. 0和8. 8之間。然而 有可能的是，一種或多種的這些成分可以省略，尤其當(dāng)這些成分能夠隨后容易添加到例如 在用于重新構(gòu)成隨時(shí)可使用的干燥組合物的再水合緩沖劑中。尤其，所需的鹽能夠以這樣 的方式添加并且因此(i)項(xiàng)的試劑組可以省略該鹽。當(dāng)這樣做時(shí)，該組合物能夠以含有所 需的鹽補(bǔ)充物的、具有再水合緩沖劑的試劑盒形式供應(yīng)?？商鎿Q地，鹽類(lèi)如鎂可以存在，但是可以以低于在該反應(yīng)中所用所需濃度的那些濃度(例如以低于500 μ M的濃度)包括在組合物中。正如在W02006/003439中所述，已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)如此少量的鎂鹽可以事實(shí)上有益于組合物的穩(wěn)定性。組合物可以進(jìn)一步包括標(biāo)記的低聚核苷酸，如可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的 進(jìn)程的熒光標(biāo)記的低聚核苷酸。在這里使用的表達(dá)短語(yǔ)“實(shí)時(shí)”是指，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 進(jìn)展能夠監(jiān)測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，無(wú)需停止或打開(kāi)反應(yīng)器。通過(guò)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增如何發(fā)生和特別在 哪些周期下擴(kuò)增子(amplicon)的指數(shù)增長(zhǎng)變得顯著，從而允許在進(jìn)行PCR的樣品中存在的 靶核酸的量可以被定量，這是現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的和得到理解的。包含在組合物中的各種組分的量將根據(jù)各種因素來(lái)變化，如具體組分的準(zhǔn)確性 質(zhì)、預(yù)期應(yīng)該進(jìn)行的PCR的性質(zhì)等等。然而，通過(guò)使用現(xiàn)有技術(shù)中會(huì)理解的已建立的規(guī)程和 程序，這在各情況下是可確定的。合適的已標(biāo)記的低聚核苷酸是可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中的標(biāo)記的探 針或標(biāo)記的引物當(dāng)中的任何。因此在特殊的實(shí)施方案中它們將包括探針，所述探針能夠雜 交到擴(kuò)增的核酸序列上并且攜帶標(biāo)記物，尤其光學(xué)標(biāo)記，如提供信號(hào)(根據(jù)PCR的進(jìn)展而發(fā) 生變化)的熒光標(biāo)記。因此例如對(duì)于預(yù)期用于Taqman 測(cè)定中的探針，它們一般包括攜帶兩個(gè)標(biāo)記的探 針，其中的一個(gè)標(biāo)記能夠用作能量和尤其熒光能量的給體，其中的另一個(gè)能夠用作該能量 的受體或“淬火劑”。盡管該探針是完整的，但是這些標(biāo)記物彼此保持緊密接近，以使得能量 的相互作用得以發(fā)生。對(duì)于熒光標(biāo)記，這已知為熒光能量轉(zhuǎn)移(FET)或熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)。該探針經(jīng)設(shè)計(jì)以結(jié)合于在模板核酸的一個(gè)鏈條上的特定區(qū)域。在PCR引物和該鏈 條“退火”(annealing)之后，Taq酶以5’ 一 3’聚合酶活性來(lái)延伸該DNA。Taq酶還顯示有 5’ 一 3’核酸外切酶活性。Taqman 探針在3’末端上通過(guò)磷酸化來(lái)加以保護(hù)，以防止它們 引發(fā)Taq延伸。如果Taqman 探針雜交到產(chǎn)品鏈條(strand)上，則延伸Taq分子將會(huì)水解 該探針，從受體中釋放出給體。這是指，在給體和受體之間的相互作用被中斷，這樣來(lái)自每 一的信號(hào)發(fā)生變化以及這一變化能夠用作檢測(cè)的基礎(chǔ)。在這種情況下的信號(hào)是累積的，游 離給體和受體分子的濃度隨著該擴(kuò)增反應(yīng)的各周期而提高。雜交探針能夠以許多形式獲得并且這些也可包括在組合物中。分子信標(biāo) (beacons)是低聚核苷酸，后者具有互補(bǔ)5’和3’序列，使得它們形成發(fā)夾環(huán)(hairpin loops)。當(dāng)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，末端熒光標(biāo)記緊密接近以便于FRET發(fā)生。在分子信標(biāo) (beacons)雜交到互補(bǔ)序列上之后該熒光標(biāo)記物被分離，因此FRET不會(huì)發(fā)生，這形成了在 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的檢測(cè)基礎(chǔ)。一對(duì)的已標(biāo)記的低聚核苷酸也可在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測(cè)中用作探針。這些在 PCR產(chǎn)品鏈條上緊密接近地雜交一將給體和受體分子置于一起，以便FRET能夠發(fā)生。增強(qiáng) 的FRET是檢測(cè)的基礎(chǔ)。這一類(lèi)型的方法例如已描述在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)No. 0912760中，它的 整個(gè)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合進(jìn)來(lái)。這一類(lèi)型的變型包括使用具有單個(gè)相鄰的探針的已標(biāo)記的擴(kuò) 增引物。W099/^8500(它的整個(gè)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合進(jìn)來(lái))描述了用于檢測(cè)靶核酸序列在樣 品中的存在的非常成功的測(cè)定方法。在這一方法中，DNA雙螺旋結(jié)合劑和該靶序列特異性 探針被添加到樣品中。該探針包括反應(yīng)性的分子，后者能夠吸收來(lái)自所述DNA雙螺旋結(jié)合劑中的熒光或?qū)晒饽芰拷o予所述DNA雙螺旋結(jié)合劑。該混合物然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中 靶核酸被擴(kuò)增，并且在其中探針雜交到靶序列上的擴(kuò)增過(guò)程中或之后誘導(dǎo)各種條件。監(jiān)測(cè) 來(lái)自所述樣品的熒光。因此，也可制備適合用于該測(cè)定(已知為“Resonsense” )中的組合物。在這種 情況下，組合物將適宜地進(jìn)一步包括DNA雙螺旋結(jié)合劑如插入性染料。采用能夠吸收從探針上的熒光標(biāo)記物發(fā)出的熒光能量但不發(fā)射可見(jiàn)光的DNA雙 螺旋結(jié)合劑的這一測(cè)定方法的可替換形式已描述在W02004/033726中，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)
合進(jìn)來(lái)。一般，用于這些類(lèi)型的測(cè)定中的全部探針例如通過(guò)磷酸化或通過(guò)標(biāo)記直接連接到 3’羥基上，被阻斷到不在3’末端處延伸。這防止探針用作二次引物并在PCR過(guò)程中延伸， 從而消除干擾性產(chǎn)品?？商鎿Q性地，一個(gè)標(biāo)記可以經(jīng)過(guò)定位使得該標(biāo)記在空間上抑制被該 酶引起的延伸而不是受到化學(xué)抑制，和/或3’堿基或探針可以含有不匹配以使得延伸的效 率顯著地降低，這是現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的。用于任何特殊組合物中的探針的量將根據(jù)各種因素來(lái)變化，如它在PCR過(guò)程中是 否被消耗或水解，以及信號(hào)發(fā)出系統(tǒng)的性質(zhì)。這些是本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員所能夠理解的。 然而，一般來(lái)說(shuō)，被添加到組合物中的該探針或每一探針的量將足以確保在最終組合物中 探針的濃度是在0. 05 μ M至1 μ M之間，例如約0. 2 μ Μ。其它的實(shí)時(shí)測(cè)定采用標(biāo)記的引物，以便提供監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。這些引物中的一些可以包 括自探測(cè)性“尾”并且已知為“蝎子(Scorpion)”引物。標(biāo)記的探針利用“封端基團(tuán)”連接 到用作反應(yīng)的引物的DNA序列上，所述封端基團(tuán)適宜地是化學(xué)連接劑或非擴(kuò)增性單體如六 乙二醇并且它防止延伸反應(yīng)(其擴(kuò)增該低聚核苷酸的探針區(qū)域)。該一般類(lèi)型的探針/引物 組合已知為“蝎子(Scorpions)”并且這些例如已描述在WO 99/66071中。該蝎子可以沿著 它的長(zhǎng)度包括給體/淬火劑對(duì)，以使FRET信號(hào)發(fā)出是可能的，如上所述。稱(chēng)作LUX (延伸時(shí)的光)熒光產(chǎn)生性引物的其它類(lèi)型的實(shí)時(shí)探針也可獲得。這些 是“發(fā)夾”狀探針，類(lèi)似于如上所述的分子信標(biāo)。然而，LUX引物在溶液中采取莖-環(huán)結(jié)構(gòu)， 并且與蝎子探針類(lèi)似，LUX引物預(yù)期用作PCR引物。它們不含有淬火劑部分，因?yàn)樗鼈兪前l(fā) 熒光的低聚核苷酸，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)可以基于序列范圍(sequence context)發(fā)生自淬滅。當(dāng)在溶 液中游離時(shí)LUX引物發(fā)生淬滅，當(dāng)變性時(shí)微弱地發(fā)熒光，當(dāng)引入到DNA中時(shí)強(qiáng)烈地發(fā)光。這 些也可包括在本發(fā)明的組合物中。包括在試劑組⑴中的聚合酶經(jīng)過(guò)選擇以使得它可用于進(jìn)行所需的“實(shí)時(shí)”測(cè)定。 因此對(duì)于一些測(cè)定如Taqman (其中探針的水解是主要的，以便引發(fā)可檢測(cè)信號(hào))，具有高 水平的5’ -3’核酸外切酶活性的聚合酶是適宜使用的，而對(duì)于一些測(cè)定如Resonsense 測(cè) 定(其中使用探針雜交)，該活性可以是低的或缺乏的。該聚合酶適宜是熱穩(wěn)定的聚合酶， 它將在為了進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需要的升高的溫度下進(jìn)行操作并承受該升高的溫度。添 加的聚合酶的量應(yīng)該足以進(jìn)行PCR反應(yīng)，這是現(xiàn)有技術(shù)中所能夠理解的。典型地，聚合酶的 添加量足以提供0. 02 — 1. 0 U/μ 1反應(yīng)組合物和典型地約0. 025 U/ μ 1反應(yīng)組合物的最 終濃度。適宜地，反應(yīng)組合物可進(jìn)一步包括用于確保聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不過(guò)早起始的試劑。 所謂的“熱起始(Hot-Start) ” PCR可以受到各種方法影響。
由“熱起始”P(pán)CR解決的問(wèn)題出現(xiàn)了，這是因?yàn)槌晒Φ腜CR依賴(lài)于按照非常精 確的順序并且在某步驟的操作所需要的精確溫度下發(fā)生的各個(gè)步驟的序列變性，退火 (annealing)和延伸。例如在反應(yīng)的起始之前，當(dāng)各種試劑在不同溫度下被混合在一起時(shí)， 甚至短時(shí)間，會(huì)引起問(wèn)題。引物可以與核酸模板相互作用，導(dǎo)致模板的引物延伸。這能夠?qū)?致所需產(chǎn)物的總收率的減少和非特異性產(chǎn)物的生產(chǎn)。為克服該問(wèn)題的最初嘗試是使用蠟阻隔層，以在試管中將各種PCR試劑彼此分離 開(kāi)(參見(jiàn)例如USP 5，565，339)。作為反應(yīng)混合物所熔化的蠟被加熱至初始變性溫度，從而 使這些試劑在最后可能的時(shí)刻被混合在一起，這樣副反應(yīng)的可能性減到最少，并且這樣產(chǎn) 生了短語(yǔ)“熱起始(Hot Start)，，。已經(jīng)嘗試了用于實(shí)現(xiàn)副反應(yīng)的抑制的其它化學(xué)方法。例如，US專(zhuān)利No. 5，677，152 描述如下方法其中DNA聚合酶經(jīng)過(guò)化學(xué)改性以確保它僅僅在升高的溫度下變得有活性。 為了實(shí)施該方法，需要在以上(i)項(xiàng)中僅僅包括適當(dāng)改性的DNA聚合酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，棲熱菌屬水生生物(Taq)DNA聚合酶的單克隆抗體如可從 Clontech, Sigma & hvitrogen獲得的抗Taq DNA聚合酶抗體，被包含在組合物中。該抗 體結(jié)合于酶活性部位，從而使它在環(huán)境溫度下失去活性。然而，在擴(kuò)增周期中所使用的升高 溫度下該抗體會(huì)變性并且從酶上離解，因此該酶變得有活性。包含在組合物中的任何抗-Taq抗體的相對(duì)量適宜足以確保它能夠?qū)崿F(xiàn)抑制Taq 酶的功能，直至根據(jù)要求為止。因此，一般來(lái)說(shuō)，將使用比Taq酶過(guò)量的抗-Taq抗體。因此 例如對(duì)于在組合物中每單位的Taq酶，將包括至少1. 5單位和優(yōu)選至少2單位的抗-Taq抗 體。Taq抗體通常是以μ g銷(xiāo)售并且該濃度非常依賴(lài)于抗體的來(lái)源和質(zhì)量以及測(cè)定的性質(zhì)。 太多的抗體可以是有害的并且能夠在一些測(cè)定中實(shí)際上引起更多的引物二聚體。然而，Taq 抗體的精確量將根據(jù)通常的實(shí)踐來(lái)確定并且典型地是在0. 001 - 0. 004 μ g/μ 1最終反應(yīng) 混合物的范圍內(nèi)。牽涉到防止引物延伸發(fā)生的抑制性用量的焦磷酸鹽與在升高的溫度下消化該焦 磷酸鹽的焦磷酸酶的聯(lián)合使用從而允許PCR進(jìn)行的又一種熱起始(Hot-Mart)方法已描述 在W002/088387中，它的整個(gè)內(nèi)容被結(jié)合進(jìn)來(lái)作為參考。在這種情況下，該焦磷酸鹽和焦磷酸酶可以作為本發(fā)明組合物的附加組分包含進(jìn)來(lái)。任選的穩(wěn)定劑的使用和精確選擇將在一定程度上取決于預(yù)期使用該最終組合物 所進(jìn)行的具體測(cè)定方法并且這能夠通過(guò)使用常規(guī)方法來(lái)測(cè)試。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組合物包 括DNA雙螺旋結(jié)合劑和有意使用的已標(biāo)記的探針時(shí)葡聚糖是不太優(yōu)選的并且試圖用于進(jìn) 行如上所述的ResonSense 測(cè)定。然而，PEG是大多數(shù)的這些組合物可容許的穩(wěn)定劑。當(dāng) 使用時(shí)穩(wěn)定劑適宜以如下量添加該量使得它占最終組合物的約l-3%m/v或l-3%w/w。如以上所討論，(i)項(xiàng)的試劑組可包含組分如緩沖劑、引物、核苷酸和任選的鹽，其 含量一般是對(duì)于PCR反應(yīng)混合物的制備所理解的用量。引物適宜過(guò)量存在并且這典型地通 過(guò)包括足夠的引物以確保在最終的反應(yīng)組合物中各引物的濃度是大約0. 1 μ M — 1 μ M而實(shí) 現(xiàn)。然而，正如下面更詳細(xì)討論，為干燥制備成餅塊組合物形式的組合物適宜是更稀的，因 此在這些組合物中引物(和實(shí)際上全部其它試劑)的摩爾濃度將會(huì)相應(yīng)地降低。在特殊的實(shí)施方案中，在PCR反應(yīng)混合物中常用的阻斷化合物可包括在組合物中。該阻斷化合物被認(rèn)為通過(guò)防止因?yàn)榕c反應(yīng)器壁之間的相互作用所引起的PCR的抑制， 例如通過(guò)防止金屬的浸析或通過(guò)螯合在反應(yīng)過(guò)程中可能從反應(yīng)器壁浸析出的任何金屬，來(lái) 起作用。還可減少酶和核苷酸析出(abstraction)到反應(yīng)器壁上。阻斷化合物的性質(zhì)將取 決于將在其中進(jìn)行反應(yīng)的容器的性質(zhì)。阻斷化合物的具體例子是玻璃涂覆化合物或玻璃阻斷化合物類(lèi)如牛血清清蛋白 (BSA)，單獨(dú)使用或與其它阻斷材料如明膠相結(jié)合使用。如上所述，明膠可以從各種的來(lái)源 獲得，其中包括牛，豬，海藻(角叉菜膠)或魚(yú)明膠。阻斷劑適宜以有效量包含在其中，該量取決于所選擇的具體化合物。然而，例 如對(duì)于BSA，該量適宜足以在最終的反應(yīng)組合物(即，為進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)所配 制的組合物)中提供0.1-1 mg/ml和優(yōu)選約0.25 mg/ml(的濃度)。明膠適宜是以約 0. 0025%-0. 01%m/v或約0. 0025%-0. 01%w/w范圍內(nèi)的量存在。應(yīng)該小心阻斷劑的量不是高 得足以顯著地抑制最終的反應(yīng)。其它組分可以包含在組合物中，這是PCR技術(shù)領(lǐng)域中所理解的。這些可以包括用 作內(nèi)部對(duì)照的序列以及用于擴(kuò)增這些序列的引物和發(fā)信號(hào)系統(tǒng)如以上對(duì)于檢測(cè)內(nèi)部對(duì)照 序列的擴(kuò)增所列出的那些。本發(fā)明的組合物適宜通過(guò)如下來(lái)制備將以上所述的所需組分混合在一起形成組 合物，然后將水(優(yōu)選，已經(jīng)用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過(guò)的無(wú)菌水)添加到組合物中進(jìn) 行混合，例如通過(guò)添加最終反應(yīng)組合物體積的至少等體積的水，優(yōu)選1-1. 5倍體積的水。尤 其，在這一階段中形成的該體積的餅塊混合物是比預(yù)期被形成后用于化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng) 本身中的混合物更稀。尤其添加足夠的水來(lái)確保組合物的體積或含有為進(jìn)行化學(xué)或生物化 學(xué)反應(yīng)如PCR所使用的足夠材料的各等分試樣的體積是預(yù)期進(jìn)行該P(yáng)CR的最終反應(yīng)組合物 的建議體積的1. 5-5倍，適宜約兩倍。所形成的混合物如果需要的話(huà)被分配成合適的等分 試樣(每一個(gè)等分試樣含有為在單個(gè)反應(yīng)罐中的PCR所使用的足夠材料)，然后進(jìn)行冷凍干 燥過(guò)程。如果冷凍干燥沒(méi)有立即進(jìn)行，則最終的混合物適宜在低溫下，例如在冰上或在電冰 箱中貯存(如果該延遲時(shí)間段被延長(zhǎng)超過(guò)了約0. 5小時(shí))，直到進(jìn)行冷凍干燥為止。所使用的冷凍干燥規(guī)程在一定程度上取決于被干燥的具體組合物并且在各情況 下通過(guò)使用常規(guī)程序來(lái)測(cè)定。典型地，組合物進(jìn)行冷凍步驟，其中該組合物被冷卻至低溫例 如約_20°C至_60°C和一般約_40°C，壓力為300-400托，然后在這一溫度下保持足夠的時(shí)間 以確保發(fā)生完全的冷凍。然后根據(jù)所使用的具體冷凍干燥器，該壓力然后被降低至合適的水平。一些可以 在低至6毫托(Mtorr)的壓力下操作，但是對(duì)于本發(fā)明的目的，10 — 100毫托(m Torr)的 壓力可以適合讓水升華。適宜地，然后組合物回到室內(nèi)溫度和壓力。這可以通過(guò)在釋放真 空以最大程度減少冷凝效果之前通過(guò)讓組合物在減壓下逐漸回到室溫來(lái)進(jìn)行。任選地，該真空是在惰性氣氛如氮?dú)獾拇嬖谙箩尫牛虼嗽摦a(chǎn)品保持在惰性環(huán)境 中。這支持壽命并且防止水分進(jìn)入。以這種方法獲得的冷凍干燥的產(chǎn)物，它適宜立即包裝在例如箔包裝材料中，以便 最大程度降低污染風(fēng)險(xiǎn)。如果組合物裝在容器如試劑罐內(nèi)，則這些適宜在釋放真空之前被 密封。箔包裝材料包括由鋁箔、含鋁聚合物層壓箔或擠出物制成的包裝材料。它還包括諸 如Mylar 之類(lèi)的材料，它有高強(qiáng)度以便制成理想的包裝材料供長(zhǎng)期貯存用。該包裝材料提供次級(jí)阻隔層以減少氣體交換和水分進(jìn)入。必須小心以確保在該組合物中所使用的全部試劑不含有能夠在可以發(fā)現(xiàn)的水平 上抑制或防止冷凍干燥的那些物質(zhì)或污染物。因此例如，可能需要除去物質(zhì)如甘油，這些物 質(zhì)有時(shí)包含在商購(gòu)的酶如聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶和RNA酶抑制劑中，和/或需要減少物質(zhì) 如二甲基亞砜(DMSO)的量，這類(lèi)物質(zhì)可以在可以用作DNA雙螺旋結(jié)合劑的插入性染料中發(fā) 現(xiàn)。這可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中公知的標(biāo)準(zhǔn)方法例如透析、超分離法和排阻色譜法來(lái)實(shí)現(xiàn)。以上所述的組合物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可穩(wěn)定更長(zhǎng)的時(shí)間，其中包括長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月和進(jìn)一步長(zhǎng) 達(dá)9個(gè)月，在這些時(shí)間的末尾，根本沒(méi)有見(jiàn)到活性損失。形成以上所述的組合物的方法構(gòu)成本發(fā)明的再一個(gè)方面。在具體的實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了制備冷凍干燥組合物的方法，該方法包括將至少以上(i) - ( )項(xiàng)混合在一 起，并冷凍干燥所形成的混合物。在使用中本發(fā)明的組合物通過(guò)使用常規(guī)方法，例如通過(guò)使用再水合緩沖劑進(jìn)行水 合，然后進(jìn)行合適的化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)。一般，在進(jìn)行反應(yīng)之前組合物與化學(xué)樣品或生物 化學(xué)樣品混合。例如，對(duì)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的情況，反應(yīng)混合物與含有或被懷疑含有靶核酸 且任選還含有再水合緩沖劑的樣品組合，然后最終的混合物經(jīng)歷PCR條件。當(dāng)包括發(fā)信號(hào) 試劑時(shí)，根據(jù)需要在該過(guò)程之前、過(guò)程中或之后監(jiān)測(cè)信號(hào)例如來(lái)自熒光試劑的熒光。尤其， 根據(jù)需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)該信號(hào)，從而允許監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)程和量化在樣品中靶的量，這是現(xiàn)有技 術(shù)中可理解的。此類(lèi)方法構(gòu)成了本發(fā)明的再一個(gè)方面。本發(fā)明現(xiàn)在參考附圖通過(guò)實(shí)施例來(lái)具體描述，其中


圖1是在室溫和30°C經(jīng)過(guò)21天的時(shí)間貯存的冷凍干燥試劑的平均Ct值(+/-sd)的圖 解對(duì)比；和
圖2是一系列的曲線(xiàn)，它們顯示了在30°C經(jīng)過(guò)9個(gè)月時(shí)間貯存的冷凍干燥的試劑的Ct 值(+/-sd)和熒光值。實(shí)施例1
用于在海藻糖和蜜三糖存在下檢測(cè)枯草芽孢桿菌var. globigii(BG) DNA和孢子的 PCR抑制測(cè)定的研究
通過(guò)將用于20μ L或25μ L反應(yīng)的多個(gè)下列試劑組合來(lái)制備PCR母體混合物 (mastermix)。表 權(quán)利要求
1.用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的組合物，所述組合物呈現(xiàn)冷凍干燥的形式并包括 (i)試劑組，所述試劑組包括至少一些進(jìn)行所述化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)所必需的化學(xué)或生物 化學(xué)試劑，和(ii)蜜三糖；其中所述組合物不含有單體型糖醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述蜜三糖是蜜三糖五水合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的組合物，其中所述蜜三糖的存在量使得在為了進(jìn)行 化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)而由所述組合物重構(gòu)的最終組合物中，它以2. 5-10% (m/v)的量存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求2- 4中任何一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步包括抗氧化劑或抗梅拉德劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗氧化劑或抗梅拉德劑是蘇氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1一 5中任何一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步包括針對(duì)玻璃形成用試劑的穩(wěn)定劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP)或多糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1一 7中任何一項(xiàng)的組合物，其中所述試劑組包括熒光試劑或生物發(fā) 光試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1一 8中任何一項(xiàng)的組合物，其中所述試劑組(i)是特別適合于進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的一組試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述試劑組包括當(dāng)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中粘附于模 板核酸序列上時(shí)能夠延伸引物的聚合酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中所述聚合酶是RNA/DNA依賴(lài)性聚合酶，如Tsec。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11的組合物，其中⑴的混合物包括緩沖劑、引物和 適合于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增DNA序列的核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中所述試劑組進(jìn)一步包括適合于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)以擴(kuò)增DNA序列并且與所述聚合酶相容的鎂和/或錳鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求9一 13中任何一項(xiàng)的組合物，它進(jìn)一步包括選自可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)程的熒光染料或DNA結(jié)合劑或熒光標(biāo)記的低聚核苷酸中的熒光試劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中所述熒光試劑是在測(cè)定中用作探針并且攜帶兩個(gè) 標(biāo)記物的已標(biāo)記的低聚核苷酸，其中的一個(gè)標(biāo)記物能夠用作能量給體，另一個(gè)標(biāo)記物能夠 用作該能量的受體。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的組合物，其中所述熒光試劑是分子信標(biāo)形式的已 標(biāo)記的低聚核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，它包括成對(duì)已標(biāo)記的探針，其中的一個(gè)已標(biāo)記的探針 攜帶屬于熒光能量給體的標(biāo)記物，其中的另一個(gè)已標(biāo)記的探針攜帶能夠接受來(lái)自所述能量 給體的熒光能量的標(biāo)記物，和其中該探針在PCR產(chǎn)物鏈條上緊密接近地雜交。
18.根據(jù)權(quán)利要求15- 17中任何一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包括DNA雙螺 旋結(jié)合劑，后者能夠與所述熒光標(biāo)記的低聚核苷酸交換能量。
19.根據(jù)權(quán)利要求9一 18中任何一項(xiàng)的組合物，它進(jìn)一步包括能夠控制PCR反應(yīng)的引 發(fā)的一種或多種試劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中所述試劑是抗-Taq抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1一 19中任何一項(xiàng)的組合物，它進(jìn)一步包括阻斷化合物。
22.制備根據(jù)權(quán)利要求1一 21中任何一項(xiàng)的組合物的方法，所述方法包括將所述組合 物的組分與水混合在一起，并冷凍干燥所形成的混合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述所形成的混合物的濃度低于從所述冷凍干燥的 組合物重構(gòu)的所建議的最終組合物的濃度。
24.試劑盒，它包括根據(jù)權(quán)利要求1一 21中任何一項(xiàng)的組合物和再水合緩沖劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的試劑盒，其中所述組合物不含有進(jìn)行PCR所必需的鹽，并且所述 再水合緩沖劑包括所述鹽。
26.用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1一 21中任何 一項(xiàng)的組合物進(jìn)行水合，并讓所述組合物經(jīng)歷如下條件在所述條件下將發(fā)生化學(xué)或生物 化學(xué)反應(yīng)。
27.蜜三糖在單體型糖醇(多元醇類(lèi))不存在下用作冷凍干燥的組合物所使用的玻璃 形成用試劑的用途，該組合物預(yù)期用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)。
全文摘要
蜜三糖用作冷凍干燥的組合物所使用的玻璃形成用試劑的用途，該組合物預(yù)期用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)如PCR。因此，例如，提供用于進(jìn)行化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的組合物，該組合物呈現(xiàn)冷凍干燥的形式并且包括(i)包括至少一些為進(jìn)行該化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)所必需的化學(xué)或生物化學(xué)試劑的試劑組，和(ii)蜜三糖。包括這些組合物的試劑盒以及使用它們的方法構(gòu)成了本發(fā)明的再一個(gè)方面。
文檔編號(hào)G01N33/548GK102084005SQ200980125365
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月2日
發(fā)明者薩頓 D., 弗蘭克斯 F., 李 M., 斯皮爾斯 S. 申請(qǐng)人:恩尼格馬診斷有限公司