專(zhuān)利名稱(chēng)：尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及快速診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種尖銳濕疣抗體唾液快速 檢測(cè)試紙條。
背景技術(shù)：
尖銳濕疣(CA)又稱(chēng)尖銳疣，或稱(chēng)性病疣，是由人類(lèi)乳頭瘤病毒(HPV) 感染人體所引起的表皮腫瘤樣增生，與性接觸傳染密切相關(guān)的疾病。據(jù)了 解，近年來(lái)在我國(guó)發(fā)病率劇增，僅次于淋病。尖銳濕疣又稱(chēng)尖圭濕疣、尖 銳疣等。是由人類(lèi)瘤病毒(HPV)感染引起的一種性傳播疾病。HPV有多 種類(lèi)型，引起本病的主要類(lèi)型為HPV1、 2、 6、 11、 16、 18、 31、 33及35 型等，其中HPV16和18型長(zhǎng)期感染可能與癌變的發(fā)生有關(guān)。尖銳濕疣屬于中醫(yī)所謂"千日裔"范疇。古時(shí)稱(chēng)為"臊瘊"。中醫(yī)書(shū)籍對(duì) 本病曾有記載，《靈樞.經(jīng)脈》篇有"疣目"、"千日瘡"、"枯筋箭"之稱(chēng)。 而祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)發(fā)生在肛門(mén)及生殖器部位者鮮于記載。生于兩陰皮膚粘膜交 接處的疣由于濕潤(rùn)、柔軟，形如菜花，污穢而色灰，故民間有"菜花瘉"之 稱(chēng)?，F(xiàn)代中醫(yī)則予以定名，趙炳南名之曰"瘙瘊"，俗稱(chēng)"臊瘊"。潛伏期5周到5個(gè)月，平均2個(gè)月，多見(jiàn)于性活躍的青、中年男女， 發(fā)病高峰年齡為20-25歲，病程平均在3-5個(gè)月的男女患者，在性接觸后 不久即發(fā)病，而病程平均12個(gè)月的男性患者，其性接觸者可不發(fā)病。多 數(shù)患者一般無(wú)癥狀。目前，纟企測(cè)尖銳濕疣最常用的方法是采用免疫檢測(cè)，該方法以抗原-抗體特意性結(jié)合為基礎(chǔ)，包括傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和近來(lái)興 起的膠體金法兩種。膠體金法又分為免疫層析和免疫滲濾兩種方式，其中 以免疫層析法最為方便、快捷。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，已得到較為廣泛的應(yīng)用，基 本原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試紙條的硝酸纖維素膜 上包被相應(yīng)的配對(duì)抗原或抗體，檢測(cè)時(shí)當(dāng)樣品中含有相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在硝酸纖維素膜上層析，再被包被的抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)線(xiàn)(T 線(xiàn))，通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)的有無(wú)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判定。但現(xiàn)在所使用的免疫層析檢 測(cè)均是以血液為樣本，血液成分相對(duì)復(fù)雜，在檢測(cè)前均需要進(jìn)行相應(yīng)的預(yù) 處理，導(dǎo)致檢測(cè)成本較高，不適合自檢。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，該試紙條以唾 液為樣品，解決了現(xiàn)有試紙條檢測(cè)成本較高，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和自檢的問(wèn)題。一種尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼 有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著 有膠體金標(biāo)記的可與尖銳濕疣抗體特異性結(jié)合的鼠抗人IgG抗體，所述的 硝酸纖維素膜上包被有由尖銳濕疣抗原構(gòu)成的檢測(cè)線(xiàn)以及由可與所述的 鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線(xiàn)。尖銳濕疢主要是由VI型、XI型HPV病毒感染所引起，所述的尖銳濕 疣抗體是由VI型、XI型HPV病毒感染所產(chǎn)生的抗體，是臨床診斷尖銳濕 疣的標(biāo)志物。該標(biāo)記物大量存在于人體血液中，唾液中也有少量存在。所 述的尖銳濕疣抗原是人重組VI型、XI型HPV病毒混合抗原，具有兩個(gè)抗 原決定簇，可與兩種尖銳濕疣抗體同時(shí)結(jié)合。所述的鼠抗人IgG抗體、尖 銳濕疣抗原以及羊抗鼠二抗抗體是均市售產(chǎn)品，也可通過(guò)現(xiàn)有方法制備獲 得。所述的膠體金墊上附著有0.21 -0.37pg/cr^可與尖銳濕疣抗體特異性 結(jié)合的鼠抗人IgG抗體，滿(mǎn)足試紙條檢測(cè)的靈敏度要求。 所述的膠體金墊制備方法如下取膠體直徑為15 ~ 35nm的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0 ~ 8.2，以 每100ml膠體金溶液計(jì)，加入0.85 ~ 1.5mg可與尖銳濕疣抗體特異性結(jié)合 的鼠抗人IgG抗體，攪拌后用牛血清蛋白封閉，離心去上清液，加入相同 體積的膠體金溶液復(fù)溶，將每毫升溶液均勻鋪在20 ~ 40cmb皮璃纖維膜上， 干燥后制得膠體金墊。所述的檢測(cè)線(xiàn)中尖銳濕疣抗原的含量為0.1 ~ 1.5pg/cm;所述的質(zhì)控5線(xiàn)中可與所述的鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體含量為 0.1~1.5pg/cm，滿(mǎn)足試紙條檢測(cè)的靈敏度要求。 所述的檢測(cè)線(xiàn)包被方法如下將所述的尖銳濕疣抗原溶解在磷酸緩沖溶液中制得濃度為0.1 ~ 1.0mg/ml溶液，用該溶液以1 ~ 1.5^U/cm的用量在硝酸纖維素膜的一端劃 線(xiàn)，干燥后即得檢測(cè)線(xiàn)；所述的質(zhì)控線(xiàn)包被方法如下將可與所述的鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體溶解在 磷酸緩沖溶液中制得濃度為0.1 ~ 1.0mg/ml溶液，用該溶液以1 ~ 1.5pl/cm 的用量在硝酸纖維素膜的另 一端劃線(xiàn)，干燥后即得質(zhì)控線(xiàn)。本發(fā)明還提供了上述尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)方法， 包括以下步驟取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀釋?zhuān)?0 10(Hil稀釋后的唾液滴在樣 品墊上，根據(jù)檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的顯色狀態(tài)，判斷^r測(cè)結(jié)果。如C、 T線(xiàn)均出現(xiàn)，判定樣品為陽(yáng)性；C線(xiàn)出現(xiàn)，T線(xiàn)不出現(xiàn)，判定 樣品為陰性；C、 T線(xiàn)都不出現(xiàn)或者C線(xiàn)不出現(xiàn)T線(xiàn)出現(xiàn)，均判定檢測(cè)無(wú)效。本發(fā)明試紙條采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)唾液中的尖銳濕疣抗體，從 而判斷是否感染HPV,具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、 適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和自檢、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 膠體金墊的制備以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑15nm的膠體金溶液，制備完成 后取100ml膠體金溶液于燒杯內(nèi)，用0.1MK2C03調(diào)至pH8.0，加入0.85mg公司)，室溫?cái)嚢鑜小時(shí)，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白(BSA) 封閉l小時(shí)，12000rpm、 4。C離心30分鐘，棄上清，用膠體金溶液復(fù)溶至 100ml,按lml溶液鋪40cn^的比例，將溶液均勻地鋪在玻璃纖維膜上， 37。C干燥30分鐘，制成膠體金墊。硝酸纖維素膜的包被
將可與尖銳濕疣抗體特異性結(jié)合的尖銳濕疣抗原(上海領(lǐng)潮生物科技
有限公司)溶解在0.01M、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成O.lmg/ml 的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜一端以lpl/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線(xiàn)。
將可與上述鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體(上海領(lǐng)潮 生物科技有限公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成 O.lmg/ml的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜另一端以l|il/cm的參數(shù)進(jìn)行 劃線(xiàn)。劃線(xiàn)后在室溫下干燥8小時(shí)，分別得到4企測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)。 檢測(cè)試紙的組裝
在干燥室內(nèi)，溫度20~25°C,濕度小于30%,將樣品墊(玻璃纖維 膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)粘貼在底板上， 其中硝酸纖維素膜位于底板中部，硝酸纖維素膜包^皮有T線(xiàn)的一端與膠體 金墊的1/3招:接，包被有C線(xiàn)的一端與吸樣墊的1/10招"接，樣品墊與膠體 金墊的1/5搭接。最后切成寬度為2.5mm的試紙條，也可將試紙條裝入一 個(gè)塑料卡中制成檢測(cè)卡。
實(shí)施例2 膠體金墊的制備
以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑35nm的膠體金溶液，制備完成 后取100ml膠體金溶液于燒杯內(nèi)，用0.1MK2CO3調(diào)至pH8.2,加入1.5mg 可與尖銳濕疣抗體特異性結(jié)合的鼠抗人IgG抗體(上海領(lǐng)潮生物科技有限 公司)，室溫?cái)嚢鑜小時(shí)，加入重量百分比為5%的牛血清白蛋白(BSA) 封閉l小時(shí)，12000rpm、 4'C離心30分鐘，棄上清，用膠體金溶液復(fù)溶至 100ml,按lml溶液鋪40cn^的比例，將溶液均勻地鋪在玻璃纖維膜上， 37'C干燥30分鐘，制成膠體金墊。 硝酸纖維素膜的包被
將可與尖銳濕疣抗體特異性結(jié)合的尖銳濕疣抗原(上海領(lǐng)潮生物科技 有限公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成1.0mg/ml 的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜一端以1^tl/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線(xiàn)。
將可與上述鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體(上海領(lǐng)潮 生物科技有限公司)溶解在O.OIM、 pH8.0磷酸緩沖液(PBS)配制成1.0mg/ml的溶液，用噴膜儀在硝酸纖維素膜另一端以1.5|xl/cm的參數(shù)進(jìn)行 劃線(xiàn)。劃線(xiàn)后在室溫下干燥8小時(shí)，分別得到檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)。 檢測(cè)試紙的組裝
在干燥室內(nèi)，溫度20~25°C，濕度小于30%,將樣品墊(玻璃纖維 膜)、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊(吸水試紙)粘貼在底板上， 其中硝酸纖維素膜位于底板中部，硝酸纖維素膜包^皮有T線(xiàn)的一端與膠體 金墊的1/3搭接，包被有C線(xiàn)的一端與吸樣墊的1/10招"接，樣品墊與膠體 金墊的l/5搭接。最后切成寬度為2.5mm的試紙條，也可將試紙條裝入一 個(gè)塑料卡中制成檢測(cè)卡。
臨床樣品試驗(yàn)
待檢人在采集唾液樣品前30分鐘禁食，取每位待檢人唾液0.5ml于 紙杯中，用吸管取兩滴滴加到濃度0.02M、 pH8.0的磷酸緩沖溶液中稀釋?zhuān)?取稀釋的唾液IOOjliI加到樣品墊中，肉眼觀測(cè)30分鐘，記錄T線(xiàn)和C線(xiàn) 的顯色狀態(tài)。同時(shí)將唾液樣品用尖銳濕疣抗體ELISA試劑盒檢測(cè)，若兩 者檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果不一致，再以另外兩種尖銳濕疣抗體ELISA試劑盒進(jìn)行 檢測(cè)，若兩種或以上的ELISA試劑為陽(yáng)性，判定結(jié)果為陽(yáng)性，兩種或以 上的ELISA試劑為陰性，判定結(jié)果為陰性。
收集唾液樣品169份，其中ELISA試劑盒檢測(cè)出陽(yáng)性樣品47份，本 發(fā)明試紙條(實(shí)施例1)檢測(cè)出陽(yáng)性樣品48份，具體結(jié)果如下表1所示
表1本發(fā)明試紙條對(duì)臨床樣品尖銳濕疣抗體的4企測(cè)結(jié)果
本試紙
ELISA+—總數(shù)
+47047
—1121122
總數(shù)48121169
靈敏度=47/47=100%;特異性=121/122=99.2%。
8
權(quán)利要求
1、一種尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，其特征在于所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的可與尖銳濕疣抗體特異性結(jié)合的鼠抗人IgG抗體，所述的硝酸纖維素膜上包被有由尖銳濕疣抗原構(gòu)成的檢測(cè)線(xiàn)以及由可與所述的鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線(xiàn)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，其特 征在于所述的膠體金墊上附著有0.21 ~ 0.37|xg/cm2可與尖銳濕疣抗體特 異性結(jié)合的鼠抗人IgG抗體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條， 其特征在于，所述的膠體金墊制備方法如下取膠體直徑為15 ~ 35nm的膠體金溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0 ~ 8.2,以 每100ml膠體金溶液計(jì)，加入0.85 ~ 1.5mg可與尖銳濕疣抗體特異性結(jié)合 的鼠抗人IgG抗體，攪拌后用牛血清蛋白封閉，離心去上清液，加入相同 體積的膠體金溶液復(fù)溶，將每毫升溶液均勻鋪在40cii^玻璃纖維膜上，干 燥后制得膠體金墊。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，其特 征在于所述的4企測(cè)線(xiàn)中尖銳濕疣抗原的含量為0.1 ~ 1.5pg/cm;所述的 質(zhì)控線(xiàn)中可與所述的鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體含量 為'0丄 1.5(xg/cm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條， 其特征在于，所述的檢測(cè)線(xiàn)包被方法如下將所述的尖銳濕疣抗原溶解在磷酸緩沖溶液中制得濃度為0.1 ~ 1.0mg/ml溶液，用該溶液以1 ~ 1.5nl/cm的用量在硝酸纖維素膜的一端劃 線(xiàn)，干燥后即得檢測(cè)線(xiàn)；所述的質(zhì)控線(xiàn)包被方法如下將可與所述的鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體溶解在磷酸緩沖溶液中制得濃度為0.1 ~ 1.0mg/ml溶液，用該溶液以1 ~ 1.5nl/cm 的用量在硝酸纖維素膜的另 一端劃線(xiàn)，干燥后即得質(zhì)控線(xiàn)。
6、 一種權(quán)利要求1所述的尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè) 方法，包括以下步驟取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀釋?zhuān)?0~ 100^1稀釋后的唾液滴在樣 品墊上，根據(jù)檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)的顯色狀態(tài)，判斷檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種尖銳濕疣抗體唾液快速檢測(cè)試紙條，包括底板，底板上依次粘貼有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸樣墊，所述的膠體金墊上附著有膠體金標(biāo)記的可與尖銳濕疣抗體特異性結(jié)合的鼠抗人IgG抗體，所述的硝酸纖維素膜上包被有由尖銳濕疣抗原構(gòu)成的檢測(cè)線(xiàn)以及由可與所述的鼠抗人IgG抗體特異性結(jié)合的羊抗鼠二抗抗體構(gòu)成的質(zhì)控線(xiàn)。本發(fā)明試紙條采用膠體金標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)唾液中的尖銳濕疣抗體，從而判斷是否感染HPV，具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和自檢、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/571GK101655497SQ200910152610
公開(kāi)日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者李洪江, 鄭隆泗 申請(qǐng)人:杭州艾力康醫(yī)藥科技有限公司