專利名稱：一種單增李斯特菌膠體金試紙條及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種單增李斯特菌的檢測試紙 及其制備方法和在單增李斯特菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單核纟田胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，單增李斯特菌)， 是李斯特菌屬(Listeria)中最重要的人類食源性病原菌，也是一種人畜 共患的致病菌，屬李斯特菌屬，它可引起人和動物患腦膜炎、腦炎、敗 血癥、心內(nèi)膜炎、流產(chǎn)、死胎及膿腫等，發(fā)病者死亡率可達30%—40%。近 年來已有不少國家報道了由于污染單增李斯特菌發(fā)生的食物中毒事件。 因此，世界各國政府部門對單增李斯特菌引起的食物中毒越來越重視， 紛紛制定了一些新的食品安全法規(guī)，并把單增李斯特菌納入法定強檢項 目。目前單增李斯特菌的檢測方法主要依靠傳統(tǒng)的分離養(yǎng)和生化鑒定， 該方法費時費力。膠體金快速診斷試紙條技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來 發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù)。近年來該方法發(fā)展迅速，在生物醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用，但用于食品衛(wèi)生領(lǐng)域檢測的 產(chǎn)品較少。本研究針對單增李斯特菌研制出了食品污染單增李斯特菌的 免疫膠體金檢測試紙條。本研究建立的膠體金檢測方法靈敏、準(zhǔn)確、特 異性強，可進一步應(yīng)用到檢驗檢疫部門對進出口食品中單增李斯特菌的 檢測實際工作中。此方法建立后，可與經(jīng)典常規(guī)方法互補，預(yù)計將在檢 驗檢疫、食品工業(yè)部門及衛(wèi)生監(jiān)控部門具有較廣的應(yīng)用前景，有一定的 經(jīng)濟和社會效益。同時，可為食品微生物檢驗國際方法的修訂或增補提 供科學(xué)依據(jù)。
熒光定量PCR和傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)，此兩種方法檢測時間均較長，最快仍 需8小時，并且需要指定的實驗環(huán)境和昂貴的儀器，PCR還易出現(xiàn)假陽性， 不適合現(xiàn)場快速檢測，并且不能進行定量^r測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方便、快捷地檢測單增李斯特菌的試紙， 同時可利用金標(biāo)免疫分析儀進行的半定量檢測方法。該試紙的工作原理 是利用特異性抗原-抗體的結(jié)合，用膠體金標(biāo)記抗體，與待檢抗原結(jié)合 后，使與試紙上結(jié)合的捕獲抗體顯色。本發(fā)明還涉及制備上述檢測試紙 的制備方法。
本發(fā)明能夠基于一份標(biāo)本和一個試紙，快速方^f更地;險測出標(biāo)本中的 單增李斯特菌，節(jié)省了大量人力物力，方便、快速、簡捷。
本發(fā)明涉及一種方便、快捷地檢測單增李斯特菌的檢測試紙，它包
含
(l)反應(yīng)支持物； (2 )吸水墊；
(3 )硝酸纖維膜，該膜包被有單增李斯特菌P60多克隆抗體(例如 可來自吉林省出入境檢驗檢疫局)檢測條帶和質(zhì)控羊抗兔IgG (例如購自 鼎國生物技術(shù)有限公司)的質(zhì)控條帶。(熊國華，于莉，曹際娟等，單增 李斯特菌免疫膠體金試紙條快速檢測J中國公共衛(wèi)生雜志2008年2 月第24巻第2期)
(4 )金標(biāo)抗體吸附膜，其中含有膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌P60多抗。
本發(fā)明涉及的上述單增李斯特菌的檢測試紙，它還包含樣品墊。
本發(fā)明涉及的上述單增李斯特菌的檢測試紙，其中反應(yīng)支持物選用 PVC板。
本發(fā)明涉及的上述單增李斯特菌型的^r測試紙，其中吸水墊選用濾紙。
本發(fā)明涉及的上述單增李斯特菌的檢測試紙，其中金標(biāo)抗體吸附膜 選用聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
另一方面，本發(fā)明涉及的上述單增李斯特菌的檢測試紙，其中吸水 墊、硝酸纖維膜、金標(biāo)抗體吸附膜、樣品墊和反應(yīng)支持物按照附圖1所 示方式構(gòu)成；反應(yīng)支持物5位于底層，硝酸纖維膜2位于反應(yīng)支持物5 上的中部，該膜的T處是單增李斯特菌P60多克隆抗體包被的檢測條帶，
5并且C處是羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶；金標(biāo)抗體吸附膜3位于硝酸纖 維膜上部的一側(cè)并與之部分重疊，該膜含有膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌 P60多克隆抗體；吸水墊1位于硝酸纖維膜2上部的相對于金標(biāo)抗體吸附 3而言的另一側(cè)并與2部分重疊；樣品墊4位于2上與1相反的一側(cè)并與 3部分重疊。
又一方面，本發(fā)明涉及的上述單增李斯特菌的檢測試紙，以吸水墊 一側(cè)為起始端，樣品墊一側(cè)為末端，單增李斯特菌P60多克隆抗體的檢 測條帶位于接近末端，羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶接近于起始端。
本發(fā)明再 一 個目的是提供制備所述檢測單增李斯特菌的試紙的方 法，該方法包括以下步驟膠體金探針的制備，金標(biāo)抗體吸附膜的制備， 硝酸纖維膜的噴涂包被。 1、膠體金探針的制備
(1)將HAuC14先配制為0. 01°/。水溶液?！菲澚嚢柘聹?zhǔn)確加入1 ml 1% 的HAuC14，同時加入1.5-3ml 1%的檸檬酸三鈉水溶液。顏色穩(wěn)定后繼續(xù) 加熱，冷卻至室溫后加純水補足至IOO ml， 4 。C避光保存。
(2 )用K2C03調(diào)PH值為約7-9，優(yōu)選為約7. 8 - 8. 9,更優(yōu)選約8. 2-8. 5。
(3) 將膠體金調(diào)至pH 8.2-8.5，，用5 mM PB (pH 7.2)稀釋抗體 至O. 2 mg/ml。
(4) 保持膠體金穩(wěn)定。
本發(fā)明還在于提供一種獲得維持膠體金穩(wěn)定的抗體最佳標(biāo)記劑量的 方法，該方法包4舌
a. 取10支潔凈的l. 5 ml離心管，分別加入膠體金溶液lml。
b. 在l-10號管內(nèi)分別加入IO ml、 20 ml、 30 ml、 40 ml、 50ml、 60 mi、 70 ml、 80 ml、 90 ml、 100ml的PBS，再依次加入稀釋好的O. 2 mg/ml 的待標(biāo)記抗體90 ml、 80 ml、 70 ml、 60 ml、 50 ml、 40 ml、 30 ml、 20 ml、 10 ml、 0 ml,混勻，靜置2分鐘。
c. 在10個管內(nèi)分別加入10。/。 NaCl溶液IOO ml，混勻后室溫靜置2小 時，觀察顏色變化。
未加抗體及加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管中的液體顏色呈現(xiàn)由紅 變藍的變化，而加入抗體量達到或超過最低穩(wěn)定劑量的試管則保持紅色不變。與對照管(1號管)相比，顏色最接近、含抗體劑量最低的試管
所含的抗體劑量，即為l ml膠體金所必須的抗體穩(wěn)定劑量，在此基礎(chǔ)上 再加20%抗體，即為抗體最佳標(biāo)記劑量。本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)試驗和分析，得 出的結(jié)果表明維持膠體金溶液適宜抗體量為2-10ug，優(yōu)選抗體量5-9ug，更優(yōu)選6. 2-8. 2ug,最優(yōu)選為7. 2ug。
2、 金標(biāo)抗體吸附膜的制備
取上述pH的膠體金以lml/管分裝于1. 5 ml的離心管中。每支管中 力口入3-8 ug標(biāo)記劑量，優(yōu)選抗體量4-6 ug，更優(yōu)選4. 5-5. 5 ug,最優(yōu) 選為5ug的抗體，輕搖混勻后放置。每管中加入10%的BSA100 1，混 勻放置。將上面初步制得的膠體金探針在12000 rpm、 4。C下離心30分鐘， 棄上清液。每支離心管中加入l ml重懸液懸浮沉淀后同上離心。棄上清 液，管底得到暗紅色的疏松狀沉淀，加入500 1重懸液重懸后于4 。C, 1000 rpm,離心10分鐘；取上清液，均勻滴加在lcm寬的^C璃纖維上， 37'C干燥。
3、 硝酸纖維膜的噴涂包被
(1 )利用隔流噴金劃線機以50mm/s的噴膜速度包被單增李斯特菌P60 多克隆抗體和質(zhì)控羊抗兔IgG兩個條帶的硝酸纖維膜；
在該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優(yōu)選是10-100mm/s,更優(yōu)選是 45 - 55mm/s,最優(yōu)選是50mm/s;所述單增李斯特菌P60多克隆抗體，其加 入量為l-5mg/ml，該多克隆抗體的稀釋液可以為PBS;質(zhì)控羊抗兔IgG可 以購自鼎國生物技術(shù)公司，其濃度為O. 1-5 mg/ml更優(yōu)選是0. 5-2. 5 mg/ml，最優(yōu)選為lmg/ml;
(2 )制備一種含有膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌P60多抗的玻璃纖維 膜，將膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌P60多抗均勻涂布在玻璃纖維膜上。抗 體用PBS稀釋,pH為7-9，優(yōu)選7. 5-9，最適PH值為8. 5。
本發(fā)明還公開了所述試紙在檢測單增李斯特菌型中的應(yīng)用，參見附圖2。
在本發(fā)明檢測單增李斯特菌的方法中，先將待測標(biāo)本放入裝有稀釋 液的小瓶內(nèi)，再用移液器將樣品混合液加入試紙"4"處(即末端)，樣 品中的液體依靠虹吸作用上行， 一般需10-15分鐘判讀結(jié)果
如標(biāo)本中含有單增李斯特菌，則它將與試紙上膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌P60多克隆抗體形成相應(yīng)的復(fù)合物，液體展開上行并與硝酸纖維膜 上的單增李斯特菌P60多克隆抗體結(jié)合，形成紅色線條，即在"T，，處形 成紅色條帶。
無論是否含有相對應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記多克隆抗體繼續(xù)隨液體繼 續(xù)上行并與該膜上的羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色 條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失效，此線就不會出現(xiàn)，說明試紙失效。
陽性結(jié)果會出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結(jié)果出現(xiàn)l條紅色沉淀線，如 不出現(xiàn)線條說明試紙失效。如若肉眼無法辨別T處紅色條帶，可利用金標(biāo) 免疫分析儀進行半定量檢測。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用純化的單增李斯特菌P60多克隆抗體、和 羊抗兔IgG分別固相于硝酸纖維膜上，結(jié)合膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌 P60多抗，應(yīng)用膜層析雙抗體夾心法的原理檢測標(biāo)本中的單增李斯特菌。


圖1A本發(fā)明試紙的正面示意圖。 圖1B本發(fā)明試紙的側(cè)面示意圖。
其中，圖U和1B: 1:吸水墊；2:硝酸纖維膜(T:包被單增李斯特 菌P60多克隆抗體檢測條帶；C:包被羊抗兔IgG的質(zhì)控條帶)；3:含有 膠體金標(biāo)記單增李斯特菌P60多克隆抗體的玻璃纖維膜；4:樣品墊；5: 反應(yīng)支持物。
圖2:;險測結(jié)果示意圖；T、 C兩條線陽性；C一條線陰性；無效。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例l、檢測單增李斯特菌的膠體金試紙的制備
1、膠體金探針的制備
(1 )將HAuC14先配制成0. 01%水溶液，取IOO ml純水加熱至沸騰。i茲 力攪拌下準(zhǔn)確加入l ml 1。/。的HAuC14，同時加入1.5 ml質(zhì)量分數(shù)為1°/。的 檸檬酸三鈉水溶液。顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱煮沸15分鐘，冷卻至室溫后加 純水補足至100ml， 4。C避光保存。(2 ) K2C03調(diào)PH值為8. 2-8. 5左右。
(3)將膠體金調(diào)至適宜的pH，優(yōu)選8.0-8.5，更優(yōu)選8.2，用5mMPB (pH 7. 2)稀釋抗體至O. 2 mg/ml。
2、 金標(biāo)抗體吸附膜的制備
取pH 8. 2的膠體金以lml/管分裝于l， 5 ml的離心管中。每支管中加 入最佳標(biāo)記劑量的抗體，輕搖混勻后放置5分鐘或稍長，此步為抗體與膠 體金顆粒結(jié)合。每管中加入10。/。的BSA100 ml，混勻放置15分鐘或稍長， 此步為封閉。將上面初步制得的膠體金探針以12000 rpm，離心30分鐘， 4 。C，棄上清液。每支離心管中加入l ml重懸液懸浮沉淀后同上離心。棄 上清液，留下管底暗紅色疏松狀沉淀，加入500 ml重懸液重懸后于4 。C， 1000 rpm，離心10分鐘；取上清液，均勻的滴加在lcm寬的玻璃纖維上， 37°干燥2. 5-3小時。
3、 硝酸纖維膜的噴涂包被
(1 )利用隔流噴金劃線機以50隨/s的噴膜速度包被單增李斯特菌 P60多克隆抗體(1. 5mg/ml+2。/。BSA)和質(zhì)控羊抗兔IgG (購自鼎國生物技術(shù) 公司，lmg/ml)兩個條帶的硝酸纖維膜；
(2)含有膠體金標(biāo)記單增李斯特菌P60 7.2ug的玻璃纖維膜，PB稀 釋；最適PH值為8. 5。
實施例2、單增李斯特菌檢測試紙
參見圖1,反應(yīng)支持物為6.2cm x 0. 4cmPCV板；吸水墊為2cm x 0. 4cm的濾油紙；1. 8cm x 0. 4cm的硝酸纖維膜依次包被羊抗兔IgG (購 自鼎國生物技術(shù)公司，lmg/ml)，單增李斯特菌P60多克隆抗體2mg/ml (含有l(wèi)"/。BSA封閉劑)，含有O. 4cm x 0. 4cm膠體金標(biāo)記的單增李斯特 菌P60多克隆抗體(標(biāo)金濃度7. 2ug PB稀釋；最適PH值為8. 5 )玻璃 纖維膜；樣品墊為2. 7cm x 0. 4cm的3皮璃纖維膜；即形成了單增李斯特 菌檢測試紙。
實施例3、檢測方法
參見附圖2,將待測標(biāo)本與樣品稀釋液混勻，再用移液器將樣品混合 液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結(jié)果
如含有單增李斯特菌，則與試紙上膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌P60 多抗形成相應(yīng)的復(fù)合物，上行與包被在硝酸纖維膜上的流單增李斯特菌 P60多抗結(jié)合，形成紅色線條，即在"T"處形成紅色條帶。
無論是否含有相對應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記多抗繼續(xù)向上爬行與包#皮 在膜上的羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，即在"C，，處形成紅色條帶。此線 是質(zhì)控線，如膠體金失效，此線就不會出現(xiàn)，說明試紙失效。
陽性結(jié)果會出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結(jié)果出現(xiàn)1條紅色沉淀線， 如不出現(xiàn)線條說明試紙失效。
實施例4、 DJM-3定量金標(biāo)免疫分析儀半定量檢測
1、 可先用檢測法檢測單增李斯特菌試紙條20個陰性值，利用金標(biāo)儀檢 測試其T/C的比值平均計算出金葡菌腸毒素B型試紙條的定闊值。
2、 其次利用定閾值來用金標(biāo)儀機器檢測單增李斯特菌試紙條能達到的最 低濃度。
3、 判讀結(jié)果時大于或等于定閾值為陽性，小于定閾值為陰性。
檢測不同濃度單增李斯特菌，經(jīng)過計算判定值(CUT-OFF)為0. 017, 濃度為101 cfu/ml、 102 cfu/ml的單增李斯特菌的平均T/C比值為的值 均為O. 00,低于0.017,為陰性；103cfu/ml 108cfu/ml的單增李斯特 菌的平均T/C比值分別為的值均高于0. 017結(jié)果為陽性；當(dāng)單增李斯特 菌濃度大于103cfu/ml時，T/C比值平均值大于0. 017,故定量檢測靈敏 度為103cfu/ml。
表1單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條各濃度檢測結(jié)果
序號檢測值T (V)質(zhì)控值C (V)T/C結(jié)果判讀
TT2Cic2T/dT/C2T/C平
陰性0.00300.5570.553000一
101 cfti/ml0.000.000.6020.589000—
102 cfii/ml0.000.000.6110.654000—
103 cfWml0.0150.0130.5890.6360.020.020.02+
104 cfWml0.0880.0850.7170.7960.120.110.115+105cfli/ml0.2160.03l週0.7530.250.040.145+
106cfu/ml2.7131.12914.4549細0.1880.1250.1565+
107cfii/ml2扁1.48710.22211.6620.2020.1280.165+
108cfWml2惡1.18815懇11.4640.1870. 1640.1755+
本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明所述的試紙可以配合小型儀器進行半定量檢測，不需專業(yè)培 訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨并能客觀保存數(shù)據(jù)，操作簡單，易于推廣，適合基層， 適合于突發(fā)事件的現(xiàn)場檢測，適合流行病學(xué)調(diào)查，并對單增李斯特菌的 感染診斷起到輔助作用。
ii
權(quán)利要求
1、一種檢測試紙，其特征在于，它包含(1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有單增李斯特菌抗體和質(zhì)控抗體的檢測條帶和質(zhì)控條帶；(4)金標(biāo)抗體吸附膜，其中含有膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌P60抗體；(5)樣品墊。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙，其中，吸水墊選用濾紙，反應(yīng)支持物選 用PVC板，金標(biāo)抗體吸附膜的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維， 樣品墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1 - 2任一項所述的試紙，其中，反應(yīng)支持物(5 )位于 底層，硝酸纖維膜(2)位于反應(yīng)支持物(5)上的中部，該膜的T處是 單增李斯特菌P60多克隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗兔IgG 包被的質(zhì)控條帶；金標(biāo)抗體吸附膜(3)位于硝酸纖維膜上部的一側(cè)并與 之部分重疊，該膜含有膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌P60多克隆抗體；p及 水墊(1)位于硝酸纖維膜(2 )上部的相對于金標(biāo)抗體吸附膜(3 )而言 的另一側(cè)并與硝酸纖維膜(2)部分重疊；樣品墊(4)位于硝酸纖維膜(2 )上與吸水墊(1)相反的一側(cè)并與金標(biāo)抗體吸附膜(3 )部分重疊。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項所迷的試紙，其中，吸水墊一側(cè)為起始端， 樣品墊一側(cè)為末端，檢測抗體的條帶位于接近末端，質(zhì)控條帶接近于起 始端。
5、 才艮據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的試紙，其中，所述抗單增李斯特菌 的抗體可以是多抗，也可是單抗；質(zhì)控抗體根據(jù)金標(biāo)抗體的免疫源可選 擇羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠等的IgG。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的試紙，其中，所述抗單增李斯特菌 P60多克隆抗體的濃度為0. 5-5mg/ml。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的試紙，其中，質(zhì)控抗體濃度為0.1-2 mg/ml。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的試紙，其中，所述抗單增李斯特菌 P60抗體標(biāo)記lml膠體金的量為5-20ug。
9、 一種制備權(quán)利要求1-8任一項所述的單增李斯特菌的檢測試紙的制 備方法，該方法包4舌(1) 用隔流噴金劃線機以一定噴膜速度噴涂抗單增李斯特菌抗體和皿 抗體兩個條帶的硝酸纖維膜；(2) 制備一種含有膠體金標(biāo)記的抗單增李斯特菌抗體的玻璃纖維膜，將 膠體金標(biāo)記的抗單增李斯特菌抗體均勻涂布在玻璃纖維膜上，并烘干或 冷凍干燥。
10、 權(quán)利要求1-8任一項所述的試紙在檢測單增李斯特菌中的應(yīng)用，其 中包括將待測標(biāo)本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙才羊品孔 處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結(jié)果。
11、 由權(quán)利要求10所述的方法制備的檢測單增李斯特菌的試紙。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測試紙，該試紙包含(1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有單增李斯特菌P60抗體和質(zhì)控抗體的檢測條帶和質(zhì)控條帶；(4)金標(biāo)抗體吸附膜，其中含有膠體金標(biāo)記的單增李斯特菌P60抗體；(5)樣品墊。本發(fā)明試紙可以配合小型儀器進行半定量檢測，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨并能客觀保存數(shù)據(jù)，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的現(xiàn)場檢測，適合流行病學(xué)調(diào)查，并對單增李斯特菌的感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/532GK101561436SQ200910084970
公開日2009年10月21日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者孫肖紅, 張曉龍, 宇 楊, 靜 王, 王振國, 胡孔新, 謝士嘉 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院