專利名稱：犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條及制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種犬體內(nèi)特異狂犬病毒有效保護(hù)性抗體的快速檢測(cè)試紙條，特別是提供了犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條及制備工藝，屬于動(dòng)物疫病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
狂犬病早在公元前四世紀(jì)即有記載，是由狂犬病毒引起的直接接觸性、病毒性傳染病，所有溫血?jiǎng)游锞赘校悄壳拔：θ祟惤】档囊环N重要人畜共患病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)全世界每年死于狂犬病的病人達(dá)35000-50000例，1950-2005年我國(guó)狂犬病死亡總?cè)藬?shù)約102280例，總的發(fā)病和死亡人數(shù)僅次于印度，居世界第2位?；加锌袢〉娜⒇埡湍承┮吧鷦?dòng)物是人畜感染的最主要傳染來源。因此要從根本上控制和消滅狂犬病，必須對(duì)犬、貓和野生動(dòng)物實(shí)行綜合的預(yù)防控制措施。目前對(duì)于犬狂犬病的預(yù)防，采用注射狂犬病疫苗的方法，但疫苗接種后犬體內(nèi)是否產(chǎn)生了有效的抗體，目前還沒有簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法和試劑。
膠體金免疫層析試紙條是新近發(fā)展起來的一種診斷方法，具有速度快、結(jié)果直觀、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種犬狂犬病病毒抗體的膠體金免疫層析試紙條及其制備工藝，能夠簡(jiǎn)易、快捷地檢測(cè)犬狂犬病病毒抗體。
本發(fā)明根據(jù)抗原抗體能特異結(jié)合的免疫學(xué)基本原理，將羊抗犬免疫球蛋白(IgG)用膠體金標(biāo)記，包被在玻璃纖維膜上作為結(jié)合墊，將純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的抗原(酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如小鼠瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原)和兔抗羊IgG分別包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，當(dāng)被檢樣品中含在狂犬病毒特異抗體時(shí)，可在檢測(cè)線上形成抗原抗體結(jié)合物并在NC膜上出現(xiàn)紫紅色條帶，通過肉眼進(jìn)行觀察判定。
本發(fā)明的解決方案是在NC膜上包被檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線側(cè)貼有金標(biāo)抗體玻璃纖維膜，質(zhì)控線側(cè)貼有吸水墊，其中檢測(cè)線包被的是純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的抗原(酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如小鼠瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原)，質(zhì)控線包被的是兔抗羊IgG。檢測(cè)時(shí)，抽取被檢測(cè)犬的少量血液，滴在該試紙條的樣品墊上，對(duì)比檢測(cè)線和質(zhì)控線的顏色，確定犬體內(nèi)是否產(chǎn)生了有效的保護(hù)性抗體。
此外，本發(fā)明也提供了一種狂犬病毒抗體膠體金免疫層析診斷試紙條的制備方法，特別是膠體金標(biāo)記羊抗犬IgG及狂犬病毒抗原的制備方法。
本發(fā)明犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條制備方法主要涉及以下幾個(gè)方面的內(nèi)容
1、羊抗犬IgG的制備利用純化的犬IgG作為抗原免疫羊而制成的羊抗犬IgG，該抗體只針對(duì)犬的免疫球蛋白反應(yīng)。用此抗體標(biāo)記膠體金制成金標(biāo)抗體，可與待檢樣品中的犬免疫球蛋白結(jié)合，所以用此抗體標(biāo)記膠體金后噴在結(jié)合墊上。
2、兔抗羊IgG的制備這種抗體是用羊的免疫球蛋白作為抗原免疫兔，提取免疫兔血清中的抗體球蛋白制成的。用在NC膜的質(zhì)控線上，可與金標(biāo)抗體結(jié)合，以此檢測(cè)試紙條的有效性。
3、狂犬病毒抗原的制備用狂犬病毒疫苗弱毒ERA株，感染單層非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)細(xì)胞，病變后收取上清液為一代毒，再以此毒感染單層Vero細(xì)胞，在35℃條件下培養(yǎng)24-48小時(shí)，以不含血清的培養(yǎng)液洗3次后換無血清培養(yǎng)液，在35℃條件下培養(yǎng)4-5天，收取培養(yǎng)毒液為二代毒，繼而經(jīng)過5000r/min離心15min處理，取上清液加入1/10000β丙內(nèi)酯滅活，經(jīng)醋酸鋅沉淀法和超濾濃縮法處理，采用Seprose4FF層析柱過濾，制得狂犬病毒抗原；或者利用酵母表達(dá)系統(tǒng)/哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)狂犬病毒糖蛋白或核蛋白抗原，并進(jìn)行純化，將該純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的抗原(酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如小鼠瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原)用在試紙條的檢測(cè)線上，可與金標(biāo)抗體-犬抗體復(fù)合物結(jié)合，形成夾心抗原抗體復(fù)合物。
4、該試紙條的生產(chǎn)工藝流程4.1羊抗犬IgG金標(biāo)抗體的制備(1)膠體金的制備取濃度為0.01％氯金酸(HAuCl4)溶液100mL加熱沸騰后迅速加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，再保持沸騰10-15min，可制得金顆粒大小為20納米的膠體金溶液；(2)膠體金標(biāo)記羊抗犬IgG在膠體金溶液中用0.1M碳酸鉀(K2CO3)溶液調(diào)pH調(diào)為8.2，按2-18ug/ml加入羊抗犬IgG，經(jīng)混合攪拌后再向溶液中按1g/100ml加入牛血清白蛋白(BSA)，4℃靜置2-4小時(shí)。將上述膠體金溶液經(jīng)2000r/min離心20分鐘，去除沉淀物得上清。再將上清液經(jīng)10000r/min離心40分鐘得沉淀物。將沉淀物按1/10的比例用10mM pH7.0 PBS+1％BSA+1％蔗糖緩沖液重懸浮得金標(biāo)抗體溶液，該緩沖液中含0.01-0.06％的疊氮鈉；(3)將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體溶液以最佳的結(jié)合量滴加于玻璃纖維膜而形成結(jié)合有金標(biāo)抗體結(jié)合墊。
4.2結(jié)合墊的處理將結(jié)合墊放入緩沖液中浸泡，干燥，結(jié)合墊噴標(biāo)記好的金標(biāo)羊抗犬IgG，然后干燥。
4.3試紙條板的制備撕去背襯上的不粘膠，分別貼上NC膜、結(jié)合墊(已噴有金標(biāo)抗體)、樣品墊和吸水墊。
4.4NC膜的噴樣 硝酸纖維素膜(NC膜)上設(shè)有兩條線檢測(cè)線和質(zhì)控線。檢測(cè)線為純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的抗原(酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如小鼠瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原)，按0.8-1.2mg/ml用噴膜機(jī)在NC膜中段噴檢測(cè)線，線寬0.8mm。質(zhì)控線為兔抗羊IgG，按1.0-1.5mg/ml用噴膜機(jī)在NC膜中段距檢測(cè)線0.5cm處噴質(zhì)控線，線寬也為0.8mm，37℃干燥2小時(shí)。再用10mMpH7.0含5％BSA的PBS，在37℃下封閉30分鐘，10mM pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
4.5試紙條板切條及測(cè)試盒的組裝將NC膜噴有抗體的試紙條板切成6×0.4cm的試紙條，放入測(cè)試盒內(nèi)，立即放入鋁箔袋內(nèi)封口。
用本發(fā)明的試紙條檢測(cè)狂犬病毒抗體的敏感性與酶聯(lián)法檢測(cè)抗體比較，偏低一個(gè)滴度，但特異性好、穩(wěn)定性高。用參比血清標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定，血清含中和抗體達(dá)0.5IU值時(shí)，檢測(cè)線出現(xiàn)紫紅色的陽性條帶，如檢測(cè)線無此條帶，即為陰性，表明血清中沒有狂犬病抗體或抗體量不足，質(zhì)控線不管血清中有沒有狂犬病抗體均應(yīng)出現(xiàn)紫紅色的陽性條帶，表明試紙條有效，如果質(zhì)控線無反應(yīng)，說明試紙條已失效。根據(jù)WHO規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，中和抗體達(dá)到0.5IU時(shí)，犬體才能達(dá)到保護(hù)力，否則應(yīng)及時(shí)加強(qiáng)免疫。
本發(fā)明與現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明檢測(cè)狂犬病毒抗體的方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、易操作，靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、易于判讀，不需要借助其它儀器設(shè)備，適合各級(jí)獸醫(yī)檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床檢驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)檢疫等。
2、本發(fā)明的診斷試劑盒的制備方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好。本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、快速、敏感和特異性好等特點(diǎn)。并且價(jià)格低廉，無需專門設(shè)備，適用于臨床檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)檢疫等多種場(chǎng)合。


圖1是犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的縱剖面結(jié)構(gòu)示意圖1-樣品墊(由普通濾紙制成)、2-結(jié)合墊(由玻璃纖維膜制成，上噴有膠體金標(biāo)記的羊抗犬IgG)、3-檢測(cè)線(為犬狂犬病毒抗原)、4-質(zhì)控線(為兔抗羊IgG)、5-NC膜、6-吸水墊、7-背襯板具體實(shí)施方式
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實(shí)施例11、羊抗犬IgG的制備利用純化的犬免疫球蛋白作為抗原免疫羊而制成的羊抗犬IgG，該抗體只針對(duì)犬的免疫球蛋白反應(yīng)。用此抗體標(biāo)記膠體金制成金標(biāo)抗體，可與待檢樣品中的犬免疫球蛋白結(jié)合，所以用此抗體標(biāo)記膠體金后噴在結(jié)合墊上。
2、兔抗羊IgG的制備這種抗體是用羊的免疫球蛋白作為抗原免疫兔，提取免疫兔血清中的抗體球蛋白制成的。用在NC膜的質(zhì)控線上，可與金標(biāo)抗體結(jié)合，以此檢測(cè)試紙條的有效性。
3、狂犬病毒抗原的制備用狂犬病毒疫苗弱毒ERA株，感染單層Vero細(xì)胞，病變后收取上清液為一代毒，再以此毒感染單層Vero細(xì)胞，在35℃條件下培養(yǎng)24-48小時(shí)，以不含血清的培養(yǎng)液洗3次后換無血清培養(yǎng)液，在35℃條件下培養(yǎng)4-5天，收取培養(yǎng)毒液為二代毒，繼而經(jīng)過5000r/min離心15min處理，取上清液加入1/10000β丙內(nèi)酯滅活，經(jīng)醋酸鋅沉淀法和超濾濃縮法處理，采用seprose4FF層析柱過濾，制得狂犬病毒抗原；或者利用酵母表達(dá)系統(tǒng)/哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)狂犬病毒糖蛋白或核蛋白抗原，并進(jìn)行純化，將該純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的抗原(酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如小鼠瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原)用在試紙條的檢測(cè)線上，可與金標(biāo)抗體-犬抗體復(fù)合物結(jié)合，形成夾心抗原抗體復(fù)合物。
實(shí)施例2試紙條的生產(chǎn)工藝流程1、羊抗犬IgG金標(biāo)抗體的制備(1)膠體金的制備取濃度為0.01％氯金酸(HAuCl4)溶液100mL加熱沸騰后迅速加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，再保持沸騰10-15min，可制得金顆粒大小為20納米的膠體金溶液；(2)膠體金標(biāo)記羊抗犬IgG在膠體金溶液中用0.1M碳酸鉀(K2CO3)溶液調(diào)pH調(diào)為8.2，按2-18ug/ml加入羊抗犬IgG，經(jīng)混合攪拌后再向溶液中按1g/100ml加入牛血清白蛋白(BSA)，4℃靜置2-4小時(shí)。將上述膠體金溶液經(jīng)2000r/min離心20分鐘，去除沉淀物得上清。再將上清液經(jīng)10000r/min離心40分鐘得沉淀物。將沉淀物按1/10的比例用10mM pH7.0 PBS+1％BSA+1％蔗糖緩沖液重懸浮得金標(biāo)抗體溶液，該緩沖液中含0.01-0.06％的疊氮鈉；(3)將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體溶液以最佳的結(jié)合量滴加于玻璃纖維膜而形成結(jié)合有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊。
2、結(jié)合墊的處理 將結(jié)合墊放入緩沖液中浸泡，干燥，結(jié)合墊噴標(biāo)記好的金標(biāo)抗體，然后干燥。
3、試紙條板的制 備撕去背襯上的不粘膠，分別貼上NC膜、結(jié)合墊(已噴有金標(biāo)抗體)、樣品墊、吸水墊。
4、NC膜的噴樣 硝酸纖維素膜(NC膜)上設(shè)有兩條線檢測(cè)線和質(zhì)控線。檢測(cè)線為純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的抗原(酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如小鼠瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原)，按0.8-1.2mg/ml用噴膜機(jī)在NC膜中段噴檢測(cè)線，線寬0.8mm。質(zhì)控線為兔抗羊免IgG，按1.0-1.5mg/ml用噴膜機(jī)在NC膜中段距檢測(cè)線0.5cm處噴質(zhì)控線，線寬也為0.8mm，37℃干燥2小時(shí)。再用10mM pH7.0含5％BSA的PBS，在37℃下封閉30分鐘，10mM pH7.0的PBS漂洗，37℃干燥。
5、試紙條板切條及測(cè)試盒的組裝將NC膜噴有抗體的試紙條板切成6×0.4cm的試紙條，放入測(cè)試盒內(nèi)，立即放入鋁箔袋內(nèi)封口。
實(shí)施例3(1)結(jié)合墊為玻璃纖維膜，由美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)，用10mMpH8.2 PBS+3％BSA+0.1％Triton X-100+1％PVP-40000預(yù)處理液對(duì)結(jié)合墊進(jìn)行處理，浸泡30分鐘后37℃真空干燥，噴上膠體金標(biāo)記的羊抗犬IgG后干燥，結(jié)合墊上與樣品墊銜接，下與NC膜銜接；(2)NC膜是一種專門用于制備膠體金試紙條的材料，由美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)，NC膜上噴兩條線，一條為檢測(cè)線(純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的抗原)，另一條線為質(zhì)控線(兔抗羊IgG)，NC膜貼在背襯的中間，兩端分別與結(jié)合墊和吸水墊連接；(3)樣品墊為一種具有較好吸水能力的厚濾紙，由美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)，在試紙條中起過濾血細(xì)胞等樣品的作用，位于結(jié)合墊上，貼在背襯上；
(4)吸水墊為厚濾紙，由美國(guó)Millipore公司生產(chǎn)，貼在背襯的末端，起吸水作用(層析作用)；(5)背襯是一個(gè)支撐樣品墊、結(jié)合墊、NC膜和吸水墊的膠版板材料。
實(shí)施例4根據(jù)圖1所示，由樣品墊1、結(jié)合墊2、吸水墊6、背襯7、硝酸纖維素膜5部分組成犬狂犬病抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，樣品墊1由普通濾紙制成，結(jié)合墊2由玻璃纖維膜制成，上噴有膠體金標(biāo)記的羊抗犬IgG，硝酸纖維素膜5為NC膜，其上的質(zhì)控線4為兔抗羊IgG，檢測(cè)線3為狂犬病毒抗原。
權(quán)利要求
1.一種犬狂犬病抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，由經(jīng)過處理的樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、吸水墊(6)、背襯(7)、硝酸纖維素膜(5)部分組成，其特征在于結(jié)合墊(2)中噴有膠體金標(biāo)記的羊抗犬IgG，硝酸纖維素膜(5)上的質(zhì)控線(4)為兔抗羊IgG，檢測(cè)線(3)為狂犬病毒抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于所述的結(jié)合墊上羊抗犬金標(biāo)抗體的制備方法包括下述步驟(1)膠體金的制備取濃度為0.01％氯金酸HAuCl4溶液100mL加熱沸騰后迅速加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，再保持沸騰10-15min，可制得金顆粒大小為20納米的膠體金溶液；(2)膠體金標(biāo)記羊抗犬IgG在膠體金溶液中用0.1M碳酸鉀K2CO3溶液調(diào)pH值為8.2，按2-18ug/ml加入羊抗犬IgG，經(jīng)混合攪拌后再向溶液中按1g/100ml加入牛血清白蛋白BSA，4℃靜置2-4小時(shí)；將上述膠體金溶液經(jīng)2000r/min離心20分鐘，去除沉淀物取上清；再將上清液經(jīng)10000r/min鐘離心40分鐘得沉淀物；將沉淀物按1/10的比例用10mM pH7.0 PBS+1％BSA+1％蔗糖緩沖液重懸浮得金標(biāo)抗體溶液，該緩沖液中含0.01-0.06％的疊氮鈉；(3)將標(biāo)記好的金標(biāo)抗體溶液以最佳的結(jié)合量滴加于玻璃纖維膜而形成結(jié)合有金標(biāo)抗體的結(jié)合墊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述犬狂犬病病毒抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于NC膜上的檢測(cè)線為純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的狂犬病毒抗原，其制備方法為用狂犬病毒疫苗弱毒ERA株，感染單層非洲綠猴腎細(xì)胞Vero細(xì)胞，病變后收取上清液為一代毒，再以此毒感染單層Vero細(xì)胞，在35℃條件下培養(yǎng)24-48小時(shí)，以不含血清的培養(yǎng)液洗3次后換無血清培養(yǎng)液，在35℃條件下培養(yǎng)4-5天，收取培養(yǎng)毒液為二代毒，繼而經(jīng)過5000r/min離心15min處理，取上清液加入1/10000β丙內(nèi)酯滅活，經(jīng)醋酸鋅沉淀法和超濾濃縮法處理，采用Seprose4FF層析柱過濾，制得狂犬病毒抗原；或者利用酵母表達(dá)系統(tǒng)/哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)狂犬病毒糖蛋白或核蛋白抗原，進(jìn)行純化。
全文摘要
本發(fā)明提供一種犬狂犬病病毒抗體的膠體金免疫層析試紙條及其制備工藝，根據(jù)抗原抗體能特異結(jié)合的免疫學(xué)基本原理，將羊抗犬免疫球蛋白(IgG)用膠體金標(biāo)記，包被在玻璃纖維膜上作為結(jié)合墊，將純化的狂犬病毒抗原或基因工程表達(dá)的抗原(酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如小鼠瘤細(xì)胞表達(dá)的抗原)和兔抗羊IgG分別包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，當(dāng)被檢樣品中含在狂犬病毒特異抗體時(shí)，可在檢測(cè)線上形成抗原抗體結(jié)合物并在NC膜上出現(xiàn)紫紅色條帶，通過肉眼能夠簡(jiǎn)易、快捷地檢測(cè)犬狂犬病病毒抗體。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101017170SQ20061001696
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2006年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日
發(fā)明者夏咸柱, 黃耕, 楊松濤, 王承宇, 高玉偉, 侯小強(qiáng), 高明華, 王鐵成, 薛琳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所