專利名稱：使用抗原模擬物的傳染原的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)傳染原，尤其是病毒原，更尤其是人丙型肝炎病毒(以下簡(jiǎn)稱為HCV)的診斷測(cè)定，和用于該測(cè)定的抗傳染原抗體結(jié)合肽，還涉及用于制備該肽的方法，以及涉及用于進(jìn)行該測(cè)定的試劑盒。本發(fā)明尤其涉及HCV、用于診斷測(cè)定的抗HCV抗體結(jié)合肽、用于其制備的方法和進(jìn)行該測(cè)定的試劑盒。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)為非腸道傳播的、非甲型、非乙型肝炎的主要病原。這種病毒非常經(jīng)常地引起持續(xù)的感染并常常導(dǎo)致慢性肝炎和肝硬化的產(chǎn)生，其構(gòu)成了慢性肝臟疾病的主要的世界性致病原因(Boyer N，Marcellin P，丙型肝炎的發(fā)病機(jī)理、診斷和治療(Pathogenesis，diagnosis and management of hepatitis C.)，J Hepatol 2000；3298-112)。
病毒感染通過(guò)檢測(cè)血清中的抗HCV抗體或者用核酸擴(kuò)增方法(Robbins DJ，Pasupuleti V，Cuan J，Chiang CS，丙型肝炎病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR定量(Reverse transcriptase PCR quantitation ofhepatitis C virus)，Clin Lab Sci 2000 Winter；1323-30)顯露出病毒RNA來(lái)診斷。后者的方法非常的靈敏，但是費(fèi)用昂貴且易于造成技術(shù)或?qū)嶒?yàn)室誤差。另外，PCR技術(shù)的可靠性和專一性還未標(biāo)準(zhǔn)化(GretchDR，丙型肝炎的診斷測(cè)試(Diagnostic tests for hepatitis C)，Hepatology 1997 Sep；26(3 Suppl 1)43S-47S)。
本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)產(chǎn)生出的抗傳染原的抗體，尤其是抗HCV抗體來(lái)對(duì)于傳染病，如病毒感染，尤其是HCV感染進(jìn)行診斷。
就在近期，報(bào)道了一種用于HCV核心蛋白的靈敏檢測(cè)的系統(tǒng)(KomatsuF，Takasaki K，Liver 1999 Oct；19(5)375-80)。
大量的專利和非專利文獻(xiàn)涉及對(duì)HCV檢測(cè)的診斷方法和試劑盒。
授予Sumitomo Chemical Company的US 5,985,542提供了一種用于肝臟疾病如丙型肝炎和酒精性肝硬化的試劑盒，該試劑盒含有能夠識(shí)別細(xì)胞色素P450的抗體。
授予Baxter Aktiengeselleschaft的US 5,972,347提供了一種用于HCV感染的治療并含有通過(guò)結(jié)合來(lái)中和人HCV抗體的滅活HCV的組合物，其中抗體至少抗一種選自HCV核心蛋白和NS3蛋白的蛋白質(zhì)。
授予Ambion和Cenetron的US 5,939,262、US 5,919,625和US5,677,124提供了一種非常廣泛的用于確定樣品中待測(cè)核酸序列的存在的方法，其中包括抗(核糖)核酸酶的(核糖)核酸片段的獲得。
授予Institut Pasteur的US 5,866,139提供了一種用于確定HCVE-1特異性抗體的存在的試劑盒。也可見授予Abbott的US 5,854,001。
授予Tonen的US 5,800,982揭示了能夠和抗HCV類群II的抗體特異性地反應(yīng)的抗原性肽。授予Tonen的JP 10019897提供了一種包含具有構(gòu)成HCV非結(jié)構(gòu)區(qū)域4A(NS4A)蛋白質(zhì)的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的肽和具有構(gòu)成HCV非結(jié)構(gòu)區(qū)域4B(NS4B)蛋白質(zhì)的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的肽的試劑盒。
對(duì)于本領(lǐng)域狀況的描述，還可見US 5,871,904、US 5,869,253、US5,750,331、US 5,747,241、US 5,667,992、US 5,645,983、US 5,625,034、US 5,610,009、WO 9707400、WO 9637783、EP 593291、EP 593290、EP 586065、JP 4349885。
血清中抗HCV抗體的檢測(cè)到目前為止仍然是被最廣泛使用的用于評(píng)估HCV感染的測(cè)試。自1987年以來(lái)，當(dāng)克隆了HCV基因組后，已經(jīng)產(chǎn)生出了各種抗HCV診斷測(cè)定的改進(jìn)形式。當(dāng)前，可用的診斷試劑盒可顯露出抗4種相當(dāng)于HCV多肽的HCV核心部分、非結(jié)構(gòu)3、非結(jié)構(gòu)4和非結(jié)構(gòu)5區(qū)域的重組體抗原(Gretch DR，丙型肝炎的診斷測(cè)試(Diagnostic testsfor hepatitis C)，Hepatology 1997 Sep；26(3 Suppl 1)43S-47S)混合物的血清抗體。然后，通過(guò)該ELISA篩選劃為陽(yáng)性的樣品必須通過(guò)免疫印跡測(cè)定來(lái)確認(rèn)，其中分別檢測(cè)抗同樣的4種抗原的抗體的存在。陽(yáng)性診斷需要檢測(cè)抗至少2種重組體抗原的抗體。
對(duì)于相應(yīng)的帶有抗HCV抗體的部分人群，顯示出對(duì)于只是一種抗原的反應(yīng)，如此是不可能確切地作出最后診斷的。另一個(gè)問(wèn)題來(lái)自能夠被HCV無(wú)關(guān)抗體識(shí)別從而產(chǎn)生假陽(yáng)性診斷的重組體抗原的使用。然后需要對(duì)于病人的補(bǔ)充調(diào)查和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)以達(dá)到最后的診斷。
外來(lái)抗原和有機(jī)體的接觸激活了特異的免疫反應(yīng)。通過(guò)體液反應(yīng)檢測(cè)的抗原的圖象由被宿主抗體所識(shí)別的表位來(lái)詳細(xì)說(shuō)明。假設(shè)抗體結(jié)合位點(diǎn)為表位的負(fù)圖象，那么特異地結(jié)合互補(bǔ)位的分子就應(yīng)該代表了表位的正圖象。這條想法暗示了就體液反應(yīng)而言，抗原能夠由結(jié)合到抗原特異性抗體上的特異性配體來(lái)如實(shí)地描述。鑒定這些配體將提供一種檢測(cè)抗抗原的特異性體液反應(yīng)的方法，其獨(dú)立于該抗原是否為已知的和/或可獲得的。
將這些概念應(yīng)用于開發(fā)用作人類中與感染(包括HCV感染)相關(guān)抗體的檢測(cè)的診斷測(cè)定。用HCV陽(yáng)性血清篩選噬菌體文庫(kù)鑒定出特異地結(jié)合抗HCV抗體的肽配體。這是通過(guò)采用特殊的選擇策略來(lái)完成的，因?yàn)閬?lái)自受感染的病人的血清含有散布于大量其它具有不同結(jié)合特異性的抗體中的病毒特異性抗體。
用大量陰性血清篩選肽以排除那些在陰性樣品中檢測(cè)出抗體(假陽(yáng)性)的配體，從而導(dǎo)致選擇出一套高度特異的肽。非特異性反應(yīng)的發(fā)生率也通過(guò)短肽序列和脫離天然抗原背景的序列的使用來(lái)減少。這個(gè)技術(shù)揭示于EP 0 698 091 B1，發(fā)表于28.02.1996。還可見J.Mol.Biol.(1991)，222，301-310；Gene，128(1993)，51-57；Gene，148(1994)，7-13；The EMBO Journal，Vol.13，no.9，2236-2243，1994；Bacterial ProteinToxins，Zb.Bakt.Suppl 24，415-425(1994)；The Journal ofImmunology(1996)4504-4513；Methods in Molecular Biology，vol.87，Humana Press Inc.pp.195-208；Combinatorial Libraries(R.Corteseed.)Walter de Gruyter 1996，第8章；Methods in Enzymology，(1996)vol.267，116-129；Biol.Chem.Vol.378，495-502，June 1997；TheEMBO Journal，Vol.17，No.13，3521-3533，1998；Nature BiotechnologyVolume 16，November 1998，1068-1073，以對(duì)于上面EP 0 698 091中所揭示的模擬表位(mimotope)與噬菌體表位(phagotope)技術(shù)和實(shí)現(xiàn)這些技術(shù)的方法有一個(gè)綜合的了解。
這些選擇策略鑒定出那些最好地結(jié)合免疫顯性抗HCV抗體的肽結(jié)構(gòu)。另外，配體的多價(jià)展示對(duì)于檢測(cè)的靈敏性貢獻(xiàn)出了顯著的親和效應(yīng)。盡管這些考慮，測(cè)試未用于篩選的血清組上的ADAM-HCV(ADAM＝用抗原模擬物的抗體檢測(cè))混合物，結(jié)果導(dǎo)致低于100％的靈敏度，雖然這已是相當(dāng)高的靈敏度了。抗HCV體液反應(yīng)的特定特征可以解釋這一結(jié)果，因?yàn)樗簧婕爸饕庖唢@性表位而是相反地導(dǎo)向許多不同的病毒決定簇。不同的病毒基因型的存在進(jìn)一步使問(wèn)題復(fù)雜化。
目前可用的診斷試劑盒可顯露出抗4種相當(dāng)于HCV多肽大區(qū)域的重組體抗原(Gretch DR，丙型肝炎的診斷測(cè)試(Diagnostic tests forhepatitis C)，Hepatology 1997 Sep；26(3 Suppl 1)43S-47S)的血清抗體。陽(yáng)性診斷需要檢測(cè)抗至少2種重組體抗原的血清抗體由于這個(gè)原因，不可能確切地對(duì)于相應(yīng)的帶有抗HCV抗體的部分人群作出結(jié)論性的診斷，因?yàn)橹荒茱@出與一種抗原的獨(dú)特的反應(yīng)性。ADAM-HCV EIA(酶免疫測(cè)定)使用幾個(gè)來(lái)自各種抗原的不同的免疫顯性表位的模擬物，從而可保證得到分析中更高的分辨力。作為直接的結(jié)果，可以急劇地降低不確定樣品的頻率。
我們對(duì)于ADAM-HCV測(cè)定(用基本上揭示于上面提到的EP 0 698 091中的策略)的技術(shù)發(fā)展作出了重要的努力。將選自噬菌體文庫(kù)的肽作為主要?dú)んw蛋白pVIII的N末端融合蛋白進(jìn)行展示。用噬菌體作為診斷試劑有許多優(yōu)點(diǎn)它是非常靈活的試劑，可以讓其適用于不同類型的免疫測(cè)定(Dente等人，1994；F.Felici，G.Galfrè，A.Luzzago，P.Monaci，A.Nicosia和R.Cortese，作為人血清鑒別工具的噬菌體展示的肽(Phage-displayed peptides as tools for the characterization ofhuman sera)，Methods in Enzymology 267，116-129，1996；Bartoli等人，Nature Biotechnology Volume 16，November 1998，1068-1073)，而且低規(guī)模的生產(chǎn)既容易又便宜。
盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，但噬菌體微粒的大小限制了在測(cè)定中能夠獲得的肽分子的濃度。抗噬菌體殼體蛋白的血清抗體的干擾需要在測(cè)定混合物中添加載體噬菌體來(lái)封閉抗噬菌體的抗體。最后，這種生物反應(yīng)試劑的大規(guī)模生產(chǎn)要面對(duì)微生物污染、再現(xiàn)性、質(zhì)量控制、純化和生產(chǎn)成本的問(wèn)題。
源自展示在噬菌體上的肽序列的簡(jiǎn)單線性合成肽在大多數(shù)情況下不能保留靈敏性或特異性以完成有效的抗體檢測(cè)。
發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種用于對(duì)傳染病，如病毒感染，尤其是丙型肝炎作診斷的方法(該方法也是本發(fā)明的一個(gè)目的)，其包括通過(guò)用抗原模擬物的抗體檢測(cè)(ADAM)方法學(xué)鑒定血清中抗抗原的抗體分子的結(jié)合特異性，用抗原模擬物的抗體檢測(cè)方法學(xué)包括用來(lái)自受到抗原感染的病人和非感染個(gè)體的血清篩選噬菌體文庫(kù)，鑒定能結(jié)合與該抗原特異相關(guān)的抗體的肽(配體)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及HCV感染。
發(fā)明詳述在第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，于根據(jù)本發(fā)明的方法之中，所述的配體通過(guò)體外成熟策略進(jìn)行改進(jìn)。
在第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，于根據(jù)本發(fā)明的方法之中，所述的配體為合成肽。
在第三個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的配體連接于共同核心上。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，根據(jù)以下給出的定義，所述共同核心和所述配體為MAP。
本發(fā)明的另一個(gè)目的為通過(guò)含有下列步驟的方法可獲得的HCV特異性配體的集合a)首先在n個(gè)陽(yáng)性血清之上淘選噬菌體文庫(kù)以產(chǎn)生第一套n個(gè)噬菌體庫(kù)；b)制備n個(gè)含有n-1個(gè)庫(kù)的噬菌體庫(kù)混合物；c)對(duì)n個(gè)混合物中的每一個(gè)進(jìn)行抗產(chǎn)生經(jīng)排除的噬菌體庫(kù)的血清的親和力選擇，從而得到第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)，可選地d)附加地，在由除了用于第一次淘選的之外所有n個(gè)原始血清所組成的混合物之上淘選第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)中的每一個(gè)；e)用所有n個(gè)原始血清的混合物對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，從而得到陽(yáng)性克?。籪)通過(guò)使用作為噬菌體分泌群體的所述克隆的整齊陣列用陽(yáng)性和陰性血清組測(cè)試所有陽(yáng)性克隆的個(gè)體反應(yīng)性；g)產(chǎn)生所述噬菌體分泌群體的復(fù)制物；h)篩選每個(gè)復(fù)制物與陽(yáng)性和陰性血清的反應(yīng)性，從而顯露出與陽(yáng)性血清特異地反應(yīng)的克隆；i)使用所述特異反應(yīng)噬菌體中的每一個(gè)作為配基來(lái)從陽(yáng)性血清中親和純化出抗體；j)測(cè)試所述抗體以確定它們與先前鑒定的HCV肽的反應(yīng)性；k)挑選出能檢測(cè)血清抗體的克隆。
這些來(lái)自上述方法的單個(gè)肽也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
特別地，在應(yīng)用于HCV的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，下列肽為本發(fā)明的進(jìn)一步目的-YSREQLNKLFGIDMT；-YSREQLNKMFGIEIS；-YSREQLSKLFGIEPM；-NSRWLSKAHGIEGM；-YSREQLNKLFGIEVM；-YSREQLSKLFGIDTQ；-KSREQLSKLHGVDTS；-RSREQLSKLFGIDLT；-MWRTWLMKTHGIESW；-MLRTWLMKYQGIESW；-YSRSWLMKAHGLELG；-MMRSYLMKAHGIESL；-MSRLWLMKAHGISSE；
-KHSEWLNKARGIESW；-MSRTFLMKAHGIESW；-MSRTWLMKAHGIESW；；-AEGEKKLRRSTNWGDPAK；-AEGEFKTRRQTNYQDPAK；-AEGEFKTLRNANRLDPAK；-AEGEFKTLRNSNRLDPAK；-AEGEFKKFPGSSTPKDPAKAAFDSL；-AEGEFPQDARFPGGGDPAKAAFDSL；-PQDARFPGGGDPAKAAFDSL；-AEGEFKGAGGAQTVDWALLVDPAK；-AEGEFMQKHFGGAQWIMGDPAK；-AEGEFLSLKGSGGGQLRALVDPAK；-AEGEFLSLKGSGGAQLRALVDPAK；-AEGEFYLLKRSSPPDPAKAAFDSL；-AEGEFPILVGPYLLPRRSREEAVDPAK；-AEGEFPILVGPYLLPRRSREEAVDPAKGK；-AEGEFRLGVRAPRKALDPAK；-AEGEFRLGVRALRKALDPAK；-AEGEFRLGVRALRKAPDPAK；-RLGVRALRKAPDPAK；-AEGEFTQPRGHSYQDPAK；-AEGEFLKERAEMSARKTLGADPAK；-AEGEFFYQIPRRMETKYGDPAK；
-AEGEFSREQLNKLFGIEGDPAK；-AEGEFNSREWLSKAHGIEGMDPAK；-AEGEFRSREQLSKLFGIDLTDPAK；-AEGEFYSREQLNKLFGIDMTDPAK；-AEGEFYSREQLNKMFGIETSDPAK；-AEGEFYSREQLNKLFGIEVMDPAK；-AEGEFKSREQLRKLHGFDTSDPAK；-AEGEFKMRNYLNKAFGIEGMDPAK；-AEGEFRSREQLSKLFGIELTDPAK；-AEGEFSRREYSNKAFGIETQDPAK；-AEGEFRRREYLNKAFGIEGGDPAK；-AEGEFSRREWLNKRFGIEYLDPAK；-AEGEFMSRTWLMKAHGIESWDPAK；-AEGEFYSPEWLNKARGIDRSDPAK；-AEGEFKSREQLSKLHGVDTSDPAK；
-AEGEFYSREQLNKMFGIEISDPAK；-AEGEFYSRSWLMKAHGLELGDPAK；-AEGEFMMRSYLMKAHGIESLDPAK；-AEGEFMSRLWLMKAHGISSEDPAK；-AEGEFPQPQEVHVYREQLGLDPAKAAFDSL；-AEGEFGEVLYRGFDEVGGDPAKAAFDSL；-AGEPYVIERGMQDPAK；-AEGEFTTASPRHFLVPLDPAKAAFDSL；-AEGEFTTSPAHFLVPLDPAKAAFDSL；-AEGEFTTASPSHFLVPLDPAKAAFDSL；-AEGEFATAPPRHYSWDPAK；-AEGEFATAPPAHYSWDPAK；-AEGEFATAPPSHYSWDPAK；-AEGEFRFWKVPDYDPPAAGGDPAK；-AEGEFTESSVSSTLADLASKTFGSADPAK；-AEGEFTLADLATMTFGSTDPAK；-AEGEFGLADLATLTFGSPDPAK；對(duì)于本發(fā)明的集合，步驟a)的優(yōu)選的噬菌體文庫(kù)為pVIII-12aa。
對(duì)于本發(fā)明的集合，從步驟k)中挑選出的優(yōu)選克隆的插入片段具有序列
1.SREQLNKLFGIEG；2.RATLSNEHGITIG；3.DQRENWFKYHGFG；4.EWRRYMSDIHGYG；5.DSLRYMYVMPGFG。
在本發(fā)明的集合中，優(yōu)選產(chǎn)生這樣的噬菌體文庫(kù)，該文庫(kù)中的反應(yīng)性克隆，更優(yōu)選的為最優(yōu)反應(yīng)性克隆，經(jīng)部分誘變以致克隆序列的每個(gè)氨基酸獨(dú)立地被任何其他的氨基酸替換。
在本發(fā)明的集合中，所述克隆優(yōu)選地含有優(yōu)選的插入序列SREQLNKLFGIEG。
在本發(fā)明的集合中，噬菌體文庫(kù)中隨機(jī)序列的兩側(cè)可能為兩個(gè)半胱氨酸殘基。這一方面可以應(yīng)用于本發(fā)明的一般開發(fā)，并且不限于HCV的情況。
上述集合在制備用于檢測(cè)懷疑感染了傳染原(如病毒尤其是HCV)的患者中該傳染原(如病毒尤其是HCV)的診斷試樣之中的用途為本發(fā)明的一個(gè)目的。
用于診斷目的且含有上述集合的試劑盒為本發(fā)明的一個(gè)目的。
能夠從在這里所揭示的方法中以集合的形式或作為單個(gè)肽而獲得的免疫原性肽為本發(fā)明的一個(gè)目的。該肽可作為免疫原起作用，因此可用于疫苗(尤其是抗HCV)的制備。便利地，肽可以上面提到的試劑盒的形式存在。
與基于抗原的系統(tǒng)相比較，我們所測(cè)試的診斷測(cè)定有利地具有內(nèi)在的可升級(jí)的能力特別的選擇可以用那些未檢測(cè)到反應(yīng)的血清來(lái)進(jìn)行。相似的方法學(xué)可用于鑒定能夠區(qū)別不同的HCV基因型的肽組，從而可以用更便宜和更快捷的EIA代替既價(jià)格昂貴又勞力密集的PCR方法。
本發(fā)明還應(yīng)通過(guò)實(shí)施例和圖來(lái)作更詳細(xì)的描述，其中在后者中

圖1代表源自篩選的克隆的鑒別。經(jīng)選擇的克隆的氨基酸序列以單個(gè)字母密碼進(jìn)行表示。頂部和較低的組分別顯示了源自原始的或二級(jí)文庫(kù)的序列。位于外源表位兩側(cè)的pVIII序列為(NH2)AEGEF[外源表位]DPAK。灰色的盒表明更常常地出現(xiàn)在來(lái)自原始文庫(kù)的克隆中的任何指定位置上的殘基。構(gòu)成來(lái)自二級(jí)文庫(kù)的肽的共有序列的殘基用粗體字顯示。所顯示的數(shù)據(jù)為來(lái)自兩次獨(dú)立測(cè)定的平均值，其涉及于經(jīng)指明的噬菌體所測(cè)量的吸光度(A＝A450nm-A620nm)和于wt噬菌體pC89(Felici等人，1991)所測(cè)量的吸光度之間的差異。*表示未經(jīng)測(cè)試的血清。
圖2代表模擬同樣的抗原決定簇的噬菌體的鑒定。通過(guò)用陽(yáng)性血清C65和克隆PA1、PA3、PA8、PA12或PA18(列于第一列)進(jìn)行親和純化得到的抗體在ELISA中測(cè)試它們抗同樣的噬菌體(列于第一行)的反應(yīng)。
所顯示的數(shù)據(jù)為來(lái)自兩次獨(dú)立測(cè)定的平均值，其涉及于經(jīng)指明的噬菌體所測(cè)量的吸光度(A＝A450nm-A620nm)和于wt噬菌體pC89(Felici等人，1991)所測(cè)量的吸光度之間的差異。
圖3代表源自文庫(kù)pVIIIA12的選擇的庫(kù)的ELISA反應(yīng)。源自在陽(yáng)性血清C76上淘選文庫(kù)pVIIIA12的文庫(kù)的噬菌體庫(kù)在ELISA中測(cè)試它和陽(yáng)性血清C12、C13、C29、C40、C47、C65、C73、C74、C76、C83與C85的反應(yīng)。白色、灰色和黑色條分別表示wt噬菌體、pVIIIA12文庫(kù)和庫(kù)p76II的反應(yīng)。ELISA結(jié)果以A＝A405nm-A620nm表示。所顯示的數(shù)據(jù)為來(lái)自兩次獨(dú)立測(cè)定的平均值。
圖4的A代表ADAM-HCV混合物與血清的反應(yīng)。截?cái)嘀?CO＝0.232)按CO＝N+5σ計(jì)算，其中N和σ分別為用陰性血清所獲得的數(shù)據(jù)的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4的B代表在從Italian Red Cross獲得的血清上的ADAM-HCV EIA。截?cái)嘀?CO＝0.252)按CO＝N+5σ計(jì)算，其中N和σ分別為從5個(gè)陰性對(duì)照血清所獲得的數(shù)據(jù)的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。ELISA按照材料和方法中的描述檢測(cè)肽和存在于人血清中的抗體的結(jié)合。收集來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果以測(cè)量信號(hào)與截?cái)嘀档谋嚷?S/CO)表示。標(biāo)明了對(duì)于每一組血清的測(cè)試血清的數(shù)量。
圖5代表在不確定血清組上的ADAM-HCV EIA。最左邊的列標(biāo)明了經(jīng)測(cè)試的HCV肽的名稱，并根據(jù)它們的結(jié)合特異性分組。接下來(lái)的4列顯示了所列出的肽與陽(yáng)性血清(c25和r15)和陰性對(duì)照血清(r6和r13)的反應(yīng)。每個(gè)另外的列顯示了所列出的肽和不確定血清的反應(yīng)?？贵w和人血清中存在的HCV肽的結(jié)合通過(guò)ELISA按照材料和方法中的描述來(lái)檢測(cè)。已經(jīng)確定了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。對(duì)于每個(gè)肽，截?cái)嘀?CO)按CO＝N+5σ計(jì)算，其中N和σ分別為從31個(gè)陰性對(duì)照血清所獲得的數(shù)據(jù)的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果以測(cè)量信號(hào)與截?cái)嘀档谋嚷?S/CO)表示。
圖6代表在陽(yáng)性、陰性和不確定血清上的ADAM-HCV/SIA。下面的ADAM-HCV肽根據(jù)它們的結(jié)合特異性進(jìn)行分組，并固定到尼龍膜上，從而獲得10隊(duì)m1909.2和m1913.2(A)；m1901.31、m3322.3、m3362.3(B)；m1977.1(C)；m3551.3(D)；m3566.3(E)；m858、mF78和mH1(F)；mA12.1、mA12.2和mA12.12(G)；mB11.17(H)；mG21.2(I)；m1929A3.1、m1929C3.4和m1929.21(J)。含有純化的人IgG的附加線作為內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照而被包括在其中?？贵w和人血清中存在的HCV肽的結(jié)合按照材料和方法中的描述來(lái)檢測(cè)。
在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施例中，合成了8個(gè)相同肽序列的C末端連接于共同核心上(Tam，J.P.合成肽疫苗的設(shè)計(jì)高密度多重抗原肽系統(tǒng)的合成和特性(Synthetic peptide vaccine designsynthesis andproperties of a high-density multiple antigenic peptide system)，Proc.Natl.Acad.Sci.85(1988)5409-5413)的多重抗原肽(MAP)，從而提供了能保持可與噬菌體產(chǎn)生的肽的特異性相比較的特異性水平的反應(yīng)試劑。噬菌體支架的去除可得到更高的固定配體的肽濃度，從而導(dǎo)致更高的靈敏度。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明可獲得的HCV特異性配體組包括模擬HCV NS3(一種免疫顯性的HCV抗原)的肽。在該優(yōu)選的實(shí)施例的情況下，據(jù)我們所知，這是第一次描述了模擬免疫顯性的NS3決定簇的短肽。NS3蛋白質(zhì)的肽掃描分析顯露出很少與陽(yáng)性血清反應(yīng)的更長(zhǎng)的序列(Khudyakov，Y.等人，1995，Virology，206666-672)。
相反地，其他的方法(Santini C，Brennan D，Mennuni C，Hoess RH，Nicosia A，Cortese R，Luzzago A，HCV cDNA表達(dá)文庫(kù)作為λ噬菌體殼體蛋白D的C末端融合蛋白的有效展示(Efficient display of an HCVcDNA expression library as C-terminal fusion to the capsid proteinD of bacteriophage lambda)，J Mol Biol 1998 Sep 11；282(1)125-35；Pereboeva J.Med.Virol 1998 Oct；56(2)105-11)已經(jīng)分離了具有保持抗原特性的大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。如此我們所開發(fā)的方法含有不依賴于HCV抗原的使用或信息的內(nèi)在特性，甚至可以應(yīng)用于抗原未知的系統(tǒng)，從而創(chuàng)造了一種導(dǎo)致抗原發(fā)現(xiàn)的方法。
噬菌體展示的隨機(jī)肽文庫(kù)(噬菌體文庫(kù))代表了用于鑒定被抗HCV血清抗體特異地識(shí)別的配體的有力工具。噬菌體產(chǎn)生的肽具有廣闊的模擬潛能，因?yàn)樗鼈兡軌蚰M線性的、具構(gòu)象的和甚至非蛋白質(zhì)的表位(綜述可見Felici F，Luzzago A，Monaci P，Nicosia A，Sollazzo M，TraboniC，絲狀噬菌體表面的肽和蛋白質(zhì)展示(Peptide and protein display onthe surface of filamentous bacteriophage)，Biotechnol Annu Rev，1995；1149-83；Zwick MB，Shen J，Scott JK，噬菌體展示的肽文庫(kù)(Phage-displayed peptide libraries)，Curr Opin Biotechnol，1998Aug；9(4)427-36)。
在本發(fā)明中，報(bào)告了有效的HCV特異性配體的更廣泛集合的鑒定，和用于血清中抗HCV抗體的檢測(cè)的新類型診斷試劑盒的開發(fā)。
本發(fā)明提供的肽作為診斷試劑或者作為免疫原或疫苗是有用的。
含有根據(jù)本發(fā)明的免疫原和疫苗的藥用組合物按常規(guī)以具有本領(lǐng)域一般經(jīng)驗(yàn)的人員通常所了解的方法來(lái)制備。例如，它們可按照EP 0 698091中的描述來(lái)制備。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明實(shí)施例具有新的結(jié)合特異性的HCV特異性配體的鑒定將噬菌體文庫(kù)pVIII-12aa在8個(gè)陽(yáng)性血清(C13、C14、C27、C29、C40、C47、C62和C65)上進(jìn)行淘選，從而產(chǎn)生8個(gè)噬菌體庫(kù)(分別以p13I、p14I、p27I、p29I、p40I、p47I、p62I和p65I表示)。制備8個(gè)混合物，每個(gè)包含不同的來(lái)自這8個(gè)噬菌體庫(kù)中7個(gè)的組合。每個(gè)混合物用產(chǎn)生經(jīng)排除的噬菌體庫(kù)的血清來(lái)進(jìn)行親和力選擇例如，由庫(kù)p13I、p14I、p27I、p29I、p40I、p47I和p62I所組成的混合物mixΔp65在血清C65上進(jìn)行淘選。結(jié)果產(chǎn)生的8個(gè)噬菌體庫(kù)(以p13II、p14II等等表示)中的每一個(gè)單獨(dú)地再次用由除了用于前次選擇的之外所有原始血清所組成的混合物淘選。例如庫(kù)p13II在血清C14、C27、C29、C40、C47、C62和C65的混合物上進(jìn)行淘選。
用所有8個(gè)原始血清的混合物免疫篩選結(jié)果產(chǎn)生的8個(gè)噬菌體庫(kù)，從而產(chǎn)生大量的陽(yáng)性克隆。我們通過(guò)產(chǎn)生作為噬菌體分泌群體的該克隆的整齊陣列用陽(yáng)性和陰性血清組測(cè)試所有這些克隆的個(gè)別反應(yīng)。在它們生長(zhǎng)之后，這一整套克隆用多孔(multipin)設(shè)備以整齊的陣列轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素濾膜上。重復(fù)同樣的程序來(lái)產(chǎn)生許多復(fù)制物，然后對(duì)于這些復(fù)制物與陽(yáng)性和陰性血清的反應(yīng)進(jìn)行單獨(dú)和同時(shí)的篩選，從而顯露出許多和陽(yáng)性血清特異地反應(yīng)的克隆。這些噬菌體中的每一個(gè)用于作為配基從陽(yáng)性血清中親和純化出抗體。然后這些抗體在ELISA中測(cè)試它們和4組先前鑒定的HCV肽中任一組的反應(yīng)(ref.Prezzi，C.，Nuzzo，M.，Meola，A.，Delmastro，^R，Galfre′，C.，Cortese，R.，Nicosia，A.和Monaci，P.，1996.1，Immunology，1564504-4513；Bartoli等人，Nature Biotechnology Volume 16，November 1998，1068-1073)。這一分析挑選出12個(gè)具有新的結(jié)合特異性的能檢測(cè)血清的克隆，因此表明它們模擬了不同于已經(jīng)鑒定的抗原決定簇的抗原決定簇。
序列分析表明有5種不同的序列。制備來(lái)自這5個(gè)克隆(PA1、PA3、PA8、PA12和PA18)中每一個(gè)的培養(yǎng)物上清液，并用30個(gè)不同的陽(yáng)性和24個(gè)陰性血清測(cè)試它們的ELISA反應(yīng)(圖1)。只有克隆PA8和PA12顯示出統(tǒng)計(jì)上顯著的與陽(yáng)性血清的反應(yīng)(p＜0.2)。
然后噬菌體PA1用于從血清C65中免疫純化出抗體。這些經(jīng)純化的抗體特異地與克隆PA3、PA8、PA12、PA18以及與克隆PA1本身反應(yīng)，從而表明所有這些噬菌體能夠分組成被同樣特異性的抗體所識(shí)別的單一類別(圖2)。當(dāng)使用野生型作為配基時(shí)，或者抗體是從陰性血清中親和純化出來(lái)的時(shí)，則檢測(cè)不到與上述克隆中任何一個(gè)的反應(yīng)。
當(dāng)來(lái)自同一組的不同克隆用于免疫純化血清抗體時(shí)，或者當(dāng)使用不同的陽(yáng)性血清時(shí)，我們獲得與圖1中所顯示的反應(yīng)相一致的結(jié)果。例如，當(dāng)噬菌體PA3用于從同樣血清中免疫純化出抗體時(shí)，這些抗體與克隆PA8和PA12反應(yīng)，也與同樣的克隆PA3反應(yīng)。這些結(jié)果表明克隆PA1、PA3、PA8、PA12和PA18能夠檢測(cè)與同樣的B細(xì)胞表位反應(yīng)的抗體，正如這些肽序列之間的弱的相似性所暗示的(圖1)。
HCV肽的親和力成熟產(chǎn)生其中克隆PA12的序列經(jīng)部分誘變的噬菌體文庫(kù)。在命名為pVIIIA12的這“二級(jí)”文庫(kù)中，寡核苷酸是合成的，以致SREQLNKLFGIEG序列的每個(gè)氨基酸能夠獨(dú)立地被任何其他的氨基酸替換理論上，每個(gè)位置上的替換會(huì)以20％的頻率發(fā)生。另外，在外源肽序列的兩個(gè)位點(diǎn)上包含了隨機(jī)殘基。將pVIIIA12文庫(kù)在12個(gè)陽(yáng)性血清(C8、CI0、C12、C13、C22、C58、C60、C76、C83、C85、C141和C177)上淘選兩次。
當(dāng)在ELISA中測(cè)試時(shí)，噬菌體庫(kù)p76II、p141II和p177II(分別源自用血清C76、C141和C177的選擇)顯示出與陽(yáng)性血清組最高和最寬的反應(yīng)性并進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖3)。以該反應(yīng)性為基礎(chǔ)，噬菌體庫(kù)p76II、p141II和p177II分別通過(guò)用血清C40、C141和C177進(jìn)行免疫篩選。對(duì)于每個(gè)庫(kù)，該分析挑選出幾個(gè)克隆，這些克隆隨后按照上面的詳述通過(guò)膜復(fù)制方案對(duì)它們與許多不同的陽(yáng)性和陰性血清的反應(yīng)性進(jìn)行單獨(dú)測(cè)試。該最后的篩選挑選出51個(gè)特異地與陽(yáng)性血清反應(yīng)的克隆。
序列分析顯示出16種不同的序列(分別源自庫(kù)p76II、p141II和p177II的8種、5種和3種)。制備來(lái)自這些克隆中每一個(gè)的培養(yǎng)物上清液，并用33個(gè)不同的陽(yáng)性和24個(gè)陰性血清測(cè)試它們的ELISA反應(yīng)性(圖1)。
克隆P40.17和P40.7與更多的測(cè)試陽(yáng)性血清反應(yīng)(每個(gè)42％)。它們和克隆P141.7與P177.22的組合與陽(yáng)性血清組中的70％反應(yīng)。將這些經(jīng)選擇的肽進(jìn)行序列比對(duì)，從而定義出一個(gè)共有序列(M/Y)SRE(W/Q)L(M/N)K(A/L)(H/F)GIES(W/M)。
另外的HCV特異性配體的鑒定以具有不同于先前所鑒定的新的結(jié)合特異性的配體的鑒定為目標(biāo)實(shí)行相似的選擇策略。篩選各種長(zhǎng)度的噬菌體文庫(kù)，在這些文庫(kù)中隨機(jī)序列是完全隨機(jī)的或者在其兩側(cè)具有兩個(gè)制約展示肽構(gòu)象的半胱氨酸殘基。
使用各種血清和噬菌體庫(kù)的組合來(lái)選擇噬菌體文庫(kù)。對(duì)于展現(xiàn)出感興趣的對(duì)陽(yáng)性血清反應(yīng)特性的噬菌體庫(kù)作進(jìn)一步的分析。通過(guò)復(fù)制物篩選對(duì)于大量個(gè)別克隆的反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估，從而挑選出顯示與陽(yáng)性血清特異反應(yīng)性的噬菌體。
我們將我們的注意力集中于具有感興趣的反應(yīng)性模式的克隆。
用從HCV肽中親和純化出的抗體探查這些克隆，從而排除那些模擬先前鑒定的肽的抗原決定簇的克隆。于這些選擇步驟中幸存下來(lái)的克隆用大量的陽(yáng)性和陰性血清在ELISA中進(jìn)行測(cè)試，以便從統(tǒng)計(jì)上確定它們的HCV特異性。
這些經(jīng)選擇的克隆通過(guò)創(chuàng)造和篩選二級(jí)文庫(kù)來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)，在該二級(jí)文庫(kù)中原始克隆或者克隆群體的序列經(jīng)過(guò)部分誘變，然后再次進(jìn)行篩選以挑選出具有改進(jìn)的結(jié)合特性的變異體。該步驟采用已經(jīng)描述的不同的策略(ref.paper Urbanelli，Zhu)來(lái)進(jìn)行。該廣泛而重復(fù)的努力鑒定出新的7組以不同結(jié)合特異性特異地結(jié)合HCV特異性血清抗體的配體。
用血清篩選噬菌體展示的HVR1變異體的所有組成部分，從而分離出特異地與大量陽(yáng)性血清反應(yīng)的肽(Puntoriero等人；Nicosia未發(fā)表的)。分析源自該篩選的一套HVR1噬菌體產(chǎn)生的肽以確定它們與我們的血清組的反應(yīng)性。鑒定出3個(gè)具有與陽(yáng)性血清最高和特異反應(yīng)頻率的肽(mF78、mH1和m858)。
概括地說(shuō)，鑒定出12組配體，其中包括先前鑒定的4組(Bartoli等人，Nature Biotechnology Volume 16，November 1998，1068-1073；Prezzi，C.，Nuzzo，M.，Meola，A.，Delmastro，^R，Galfre′，C.，Cortese，R.，Nicosia，A.和Monaci，P.，1996.1，Immunology，1564504-4513)；見圖5，A至L組。
從噬菌體產(chǎn)生的肽到合成的肽以八分枝的多重抗原肽形式(ADAM-HCV肽)來(lái)合成源自12組HCV配體的22個(gè)肽序列。在該分子中，8個(gè)同樣的肽序列通過(guò)賴氨酸叉連接到一個(gè)共同核心上，從而形成與噬菌體殼體上pVIII融合肽的展示相似的多重展示。ADAM-HCV肽的序列顯示于下文中m858 ETYTTGGAAARTTSGLTSLFSPGPSQNm1901.31 AEGEFKKFPGSSTPKDPAKAAFDSLm1901.34 AEGEFPEDTFPGSKULSGDPAKAAFDSLm1909.2 AEGEFKTRRNTNYQDPAKm1913.2 AEGEFKTLRNTNRLDPAKm1929.21 AEGEFATASPTHYTSELDPAKm1929A3.1 AEGEFTTASPTHFLVPLDPAKm1929C3.4 AEGEFATAPPSHYSWDPAKm1977.1 AEGEFPYLLPRRSREEAVDPAKm3322.3 AEGEFPQDARFPGGGDPAKm3362.3 AEGEFLSLKGSGGGQLRALVDPAKm3551.3 AEGEFRLGVRALRKAPDPAKm3566.3 AEGEFKTSVRSVPRARPPINGDPAKmA12.1AEGEFNSREWLSKAHGIEGMDPAKmA12.2AEGEFRSREQLSKLFGIDLTDPAKmA12.13 AEGEFMSRTWLMKAHGIESWDPAKmB11.17 AEGEFRELLYEAFDDMEGDPAKmF78 QTHTTGGQAGHQAHSLTGLFSPGAKQNmG21.2AGEPYVIEQGMMDPAKmH1 QTHTTGGVVGHATSGLTSLFSPGPSQNmN15.3AEGEFGLADLATLTFGSTDPAKmS48.5AEGEFRFWKVPDYDPPAAGGDPAK
雖然關(guān)于它們分析結(jié)果的數(shù)據(jù)概括于表1中，但此處用圖附加說(shuō)明。
在許多情況下，位于外源表位兩側(cè)的pVIII序列(NH2AEGEF和/或DPAK-COOH)顯示出與相應(yīng)的肽的結(jié)合特異性有關(guān)。
含有這22個(gè)ADAM-HCV肽的混合物(ADAM-HCV混合物)用于通過(guò)EIA(ADAM/HCV EIA)檢測(cè)抗HCV抗體的存在。ADAM-HCV肽混合物通過(guò)被動(dòng)包被而固定于多孔ELISA平板的底部，然后用1∶40稀釋的血清樣品孵育40分鐘。結(jié)合到肽上的人抗體通過(guò)用抗人共軛物孵育20分鐘來(lái)檢測(cè)，并通過(guò)生色酶促反應(yīng)來(lái)測(cè)量。
如圖4A中所顯示的，ADAM/HCV EIA有效地區(qū)分出陽(yáng)性和陰性血清。ADAM-HCV/EIAHCV陽(yáng)性和HCV陰性血清組通過(guò)ADAM/HCV-EIA來(lái)測(cè)試抗HCV抗體的存在(圖4B)。該測(cè)試鑒定出包括在該組中的所有陽(yáng)性血清，并通過(guò)鑒定所有的陰性樣品證實(shí)具有100％的特異性。
不確定樣品根據(jù)商用HCV證實(shí)測(cè)定診斷為不確定的血清的集合可從各種來(lái)源獲得。23個(gè)ADAM-HCV肽在ELISA中單獨(dú)地測(cè)試它們與31個(gè)樣品的反應(yīng)性(圖5)。6個(gè)樣品不與測(cè)試的MAP中的任何一個(gè)反應(yīng)，因而將其劃歸為陰性。8個(gè)樣品只識(shí)別一個(gè)抗原，因而確認(rèn)為不確定分析。最后，17個(gè)樣品顯示出兩種或更多種抗不同肽組的反應(yīng)，因而將其鑒定為陽(yáng)性。ADAM-HCV帶狀免疫印跡測(cè)定(ADAM-HCV/SIA)將ADAM-HCV肽共價(jià)固定到活化的尼龍膜上，從而獲得具有10隊(duì)的帶。如圖6的詳述，每條線包含具有相同結(jié)合特異性的不同的肽。還包括了一條作為內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照的含有純化的人IgG的對(duì)照線。從不確定血清組中選擇出的一些樣品通過(guò)將血清樣品與該帶進(jìn)行孵育來(lái)測(cè)試它們與固定抗原的反應(yīng)性。由個(gè)別抗原捕獲的抗HCV抗體通過(guò)將該帶與抗人酶共軛物進(jìn)行孵育并隨后進(jìn)行比色酶促反應(yīng)來(lái)顯現(xiàn)出來(lái)。樣品與肽條帶的反應(yīng)性通過(guò)視覺上比較每個(gè)條帶和內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照的亮度來(lái)確定。
ADAM-HCV/SIA顯露出所有8個(gè)陽(yáng)性血清與ADAM-HCV肽所模擬的幾個(gè)不同的病毒決定簇的反應(yīng)。當(dāng)測(cè)試8個(gè)陰性血清時(shí)，未檢測(cè)到反應(yīng)性(圖6)。
我們也通過(guò)ADAM-SIA分析了許多經(jīng)選擇的不確定樣品。如圖6中所顯示的，8個(gè)不確定樣品的分析證實(shí)了通過(guò)用個(gè)別的肽的ADAM-HCV/EIA所獲得的結(jié)果，從而表明這兩個(gè)測(cè)定具有同等的靈敏度。
材料和方法噬菌體文庫(kù)使用4種不同的噬菌體展示的隨機(jī)肽文庫(kù)作為配體的來(lái)源pVIII9aa、pVIII9aa_cys、pVIII12aa、pVIII15aa和pVIIIA12。pVIII9aa(Felici等人，1991)、pVIII12aa和pVIII15aa分別為三個(gè)不同的由隨機(jī)9聚體、12聚體和15聚體所組成的文庫(kù)，其作為主要外殼蛋白pVIIIN末端的融合蛋白展示在絲狀噬菌體上。pVIII9aa_cys為其中兩個(gè)半胱氨酸殘基位于隨機(jī)九肽兩側(cè)的文庫(kù)(Luzzago等人，1993)。在后者文庫(kù)中，半胱氨酸促進(jìn)了在某種程度上限制所展示的肽的構(gòu)象的二硫橋的形成。pVIIIA12文庫(kù)是通過(guò)合成編碼氨基酸序列SREQLNKLFGIEG的寡核苷酸來(lái)構(gòu)建的。通過(guò)采用樹脂分解合成方法學(xué)(Glaser等人，1992)，每個(gè)氨基酸位置能夠以20％的頻率被NNS三聯(lián)體所替換。另外，在外源肽序列的兩個(gè)位點(diǎn)上包含了隨機(jī)殘基。所有的5個(gè)文庫(kù)按所描述的那樣產(chǎn)生出來(lái)(Folgori等人，1998)。文庫(kù)的復(fù)雜度按源自獲得于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的個(gè)體克隆的數(shù)量計(jì)算對(duì)于這5個(gè)文庫(kù)中的每一個(gè)為大約1×108。
人血清本研究中所使用的人血清是隨機(jī)地從來(lái)自輸血中心和醫(yī)院部門的廢棄的獻(xiàn)血者血液?jiǎn)卧蛠?lái)自健康自愿者的單元之中收集的。也就是說(shuō)，許多本研究中所使用的不確定樣品是從Laboratory of Virology，Istituto Superiore di Sanita，Roma(意大利)和Centro NazionaleTrasfusione Sangue della Croce Rossa Italiana，Roma(意大利)獲得的。血清用第二代HCV ELISA測(cè)試系統(tǒng)(Ortho Diagnostic System，Bersee，Belgium)進(jìn)行測(cè)試以確定抗HCV抗體的存在，并用第一代點(diǎn)印跡免疫測(cè)定RIBA HCV測(cè)試系統(tǒng)(Chiron Co.，Emeryville，CA)進(jìn)行確認(rèn)。血清還通過(guò)AUSAB EIA測(cè)試(Abbott Labs，Chicago，IL)和第三代HIV-1/HIV-2 EIA測(cè)試(Abbott Labs，South Pasadena，CA)進(jìn)行測(cè)試以確定不存在抗HBsAg和抗HIV-1/HIV-2的抗體。對(duì)于抗HCV抗體的存在為陽(yáng)性但對(duì)于抗HBsAg和抗HIV抗體為陰性的樣品作為HCV陽(yáng)性血清包括于本研究之中。對(duì)于抗所有三種抗原的抗體的存在為陰性的血清作為HCV陰性血清包括于本研究之中。
親和選擇和免疫篩選按照描述，HCV陽(yáng)性血清用于親和選擇噬菌體展示的隨機(jī)肽文庫(kù)(Folgori等人，1998；Felici等人，1996；Prezzi等人，1996)。源自親和選擇的克隆用血清按描述進(jìn)行免疫篩選(Prezzi等人，1996；Minenkova等人)。
使用噬菌體克隆的ELISA使用噬菌體上清液和人血清的ELISA按下述進(jìn)行。噬菌體上清液按先前的描述從DH5α-F’受感染細(xì)胞中制備(Felici等人，1991)。多孔平板(Immunoplate Maxisorp，Nunc，Roskilde，Denmark)用200μl在pH9.6的50mM NaHCO3中濃度為1μg抗體/毫升的抗pIII單克隆抗體57D1(Dente等人，1994)于4℃包被過(guò)夜。在丟棄包被溶液之后，平板用ELISA封閉緩沖液(PBS中含0.1％酪蛋白和1％ Triton-X100)于37℃孵育60分鐘。平板用PBS/0.05％ Tween-20(洗滌緩沖液)洗滌幾次。將ELISA封閉緩沖液和澄清噬菌體上清液的1∶1混合物加入每一個(gè)孔中，并讓其于37℃結(jié)合1小時(shí)。將1∶40稀釋的人血清于室溫孵育30分鐘，其孵育條件為在ELISA封閉緩沖液中具有5×1010蝕斑形成單位(pfu)/毫升的噬菌體f11.1(Dente等人，1996)、25μl/ml來(lái)自被噬菌體f11.1(Dente等人)侵染的DH5-F’細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物和25μl/ml來(lái)自無(wú)關(guān)的鼠雜交瘤細(xì)胞的上清液。在丟棄了含有噬菌體上清液的混合物之后，平板用洗滌緩沖液洗滌，然后將預(yù)孵育的血清混合物加入到每個(gè)孔中并于37℃孵育60分鐘。然后，平板用洗滌緩沖液洗滌，并將于二級(jí)抗體封閉緩沖液(PBS中含1％Triton、1％馬血清和50％胎牛血清，5μl/孔的單克隆抗體上清液)中作1∶20.000稀釋的連接有HRP的山羊抗人IgG抗體(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)加入到每個(gè)孔中。在于37℃孵育30分鐘之后，洗滌平板并通過(guò)與200μl TMB液體底物系統(tǒng)(SIGMA，St.Louis，MO)孵育來(lái)檢測(cè)過(guò)氧化物酶活性。在經(jīng)過(guò)15分鐘孵育之后，通過(guò)加入25μl 2M H2SO4來(lái)終止反應(yīng)。平板用自動(dòng)ELISA閱讀器(Labsystems Multiskan Bichromatic，Helsinki，F(xiàn)inland)進(jìn)行閱讀，并將結(jié)果以A＝A450nm-A620nm表示。于顯示項(xiàng)目中所表明的ELISA數(shù)據(jù)為來(lái)自兩次獨(dú)立測(cè)定的平均值。如果它們大于0.3截?cái)嘀挡⑶宜鼈兣c對(duì)于wt噬菌體所觀察到的背景信號(hào)的差異大于3σ(σ＝{1/2[σ2p+σ2w]}1/2)，那么則認(rèn)為它們?cè)诮y(tǒng)計(jì)上是顯著的。
涉及克隆PA8和PA12的p值是所觀察到的陽(yáng)性和陰性血清反應(yīng)性的頻率分布根據(jù)χ2測(cè)試在統(tǒng)計(jì)上相同的概率。
從血清中親和純化出噬菌體表位特異性抗體60mm直徑的聚苯乙烯培養(yǎng)皿(Becton Dickinson Labware，NJ)用在1毫升pH9.6的50mM NaHCO3中含1×1011CsCl純化的噬菌體微粒的溶液于4℃包被過(guò)夜。在用PBS/Tween洗滌之后，培養(yǎng)皿用ELISA封閉緩沖液于37℃孵育60分鐘。將人血清(在ELISA封閉緩沖液中以1/100稀釋)、1×1012pfu/ml的f11.1和25μl/ml XL1-blue細(xì)胞提取物的混合物于室溫孵育60分鐘。在丟棄封閉緩沖液之后，向平板加入預(yù)孵育的混合物并于4℃孵育過(guò)夜。丟棄血清稀釋液，然后用洗滌緩沖液洗滌培養(yǎng)皿。結(jié)合的抗體用添加了10μg/ml BSA的pH2.7的0.1M甘氨酸-HCl來(lái)洗脫，并進(jìn)行中和。
噬菌體克隆的鑒別親和純化出的抗體在標(biāo)準(zhǔn)ELISA中測(cè)試它們抗噬菌體表位的反應(yīng)性。一般地，多孔平板用100μl/孔的在pH9.6的50mM NaHCO3中含1×1011TU/ml CsCl純化的噬菌體的溶液于4℃包被過(guò)夜。在用PBS/Tween洗滌之后，平板用封閉緩沖液于37℃孵育60分鐘。然后，向每個(gè)孔中加入100μl親和純化出的抗體，并讓其于4℃結(jié)合過(guò)夜。然后用冷的PBS/Tween洗滌平板，并以100μl/孔加入于封閉緩沖液中作1/5000稀釋的連接有堿性磷酸酶的山羊抗人IgG(Fc特異性)抗體(Sigma，St.Louis，MO)。在室溫孵育2小時(shí)之后，洗滌平板，堿性磷酸酶就按上面的描述顯露出結(jié)果來(lái)。
合成肽我們已經(jīng)使用了合成的八分枝的多重抗原肽(MAPs)(Tam，199X)。通過(guò)流動(dòng)聚酰胺方法(Pessi等人，1990)來(lái)進(jìn)行合成。肽溶解在二甲亞砜中。
使用合成肽的ELISA多孔平板(Immuno plate Maxisorp，Nunc，Roskilde，Denmark)用在pH9.6的50mM NaHCO3中濃度為10μg/ml的MAP溶液于4℃包被過(guò)夜。在丟棄包被溶液之后，平板用ELISA封閉緩沖液(PBS中含0.1％酪蛋白和1％ Triton-X100)于37℃孵育60分鐘。平板用PBS/0.05％ Tween-20(洗滌緩沖液)洗滌幾次。向每個(gè)孔中加入1∶40稀釋的人血清，并于37℃孵育40分鐘。然后平板用洗滌緩沖液洗滌，再將于ELISA封閉緩沖液中作1∶20.000稀釋的連接有HRP的山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)加入到每個(gè)孔中。在于37℃孵育20分鐘之后，洗滌平板并通過(guò)與TMB液體底物(SIGMA，St.Louis，MO)孵育來(lái)檢測(cè)過(guò)氧化物酶活性。經(jīng)過(guò)15分鐘孵育之后，通過(guò)加入2M H2SO4來(lái)終止反應(yīng)。平板用自動(dòng)ELISA閱讀器(LabsystemsMultiskan Bichromatic，Helsinki，F(xiàn)inland)進(jìn)行閱讀，并將結(jié)果以A＝A450nm-A620nm表示。于顯示項(xiàng)目中所表明的ELISA數(shù)據(jù)為來(lái)自兩次獨(dú)立測(cè)定的平均值。
參考文獻(xiàn)Smith，C.P.和Petrenko，V.A.1997。噬菌體展示(Phage display)。Chem.Rev.97391-410。
Folgori，A.，Tafi，R.，Meola，A.，F(xiàn)elici，F(xiàn).，Galfrè，G.，Cortese，R.，Monaci，P.和Nicosia，A.1994。只用隨機(jī)肽文庫(kù)和人血清鑒定病理學(xué)抗原的模擬表位的一般策略(A general strategy toidentify mimotopes of pathological antigens using only randompeptide libraries and human sera)。EMBO 1.132236-43。
Prezzi，C.，Nuzzo，M.，Meola，A.，Delmastro，^R，Galfre′，C.，Cortese，R.，Nicosia，A.和Monaci，P.，1996.1.Immunology.1564504-4513。
Alter，H.J.1995。為C或不為C這些是值得思考的問(wèn)題(To C ornot to Cthese are the questions)。Blood.851681。
Felici，F(xiàn).，Castagnoli，L.，Musacchio，A.，Jappelli，R.和Cesareni，C.1991。來(lái)自表達(dá)于多價(jià)展示載體上的寡肽大文庫(kù)的抗體配體的選擇(Selection of antibodies ligands from a large library ofoligopeptides expressed on a multivalent exposition vector).f.Mol.Biol.222301-310.
Luzzago，A.，F(xiàn)elici，F(xiàn).，Tramontano，A.，Pessi，A.和Cortese，R.1993。通過(guò)噬菌體展示的肽來(lái)模擬不連續(xù)表位I.使用受約束肽的噬菌體文庫(kù)的人H鐵蛋白的表位制圖(Mimicking of discontinuousepitopes by phage displayed peptides，I.Epitope mapping of humanH ferritin using a phage library of constrained peptides).Cene.12851-57.
Dente，L.，Cesareni，G.，Micheli，C.，F(xiàn)elici，F(xiàn).，F(xiàn)olgori，A.，Luzzago，A.，Monaci，P.，Nicosia，A.和Delmastro，P.1994。識(shí)別絲狀噬菌體的單克隆抗體——噬菌體展示技術(shù)的有用工具(Monoclonalantibodies that recognize filamentous phage.Useful tools forphage display technology)。Gene.1487Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，T.和Maniatis，T.1989。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(Molecular Cloninga laboratory manual)(第二版)。
Takamizawa，A.，Moti，C.，F(xiàn)uke，I.，Manabe，S.，Murakami，S.，F(xiàn)ujita，J.，Onoshi，E.，Andoh，T.，Yoshida，I.和Okayama，H.1991。從人攜帶者中分離所得的丙型肝炎病毒基因組的結(jié)構(gòu)和組織(Structureand organization of the Hepatitis C virus genome isolated fromhuman carriers)。I.Virol.651105-1113。
Smith.D.B.1993。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的純化(Purification of glutathione S-Transferase fusion proteins)。Methods in molecular and cellular biology.4220-229。
Frangioni，f.V.和Neel，B.J.1993。具酶促活性的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白(pGex)的溶解和純化(Solubilization andpurification of enzymatically active glutathione S-Transferase(pGex)fusion proteins)。Analyt.Biochem.210179-187。
Komatsu F，Takasaki K 1999。采用用于抗HCV陽(yáng)性病人中HCV病毒血癥的定量評(píng)估的新方法來(lái)確定血清丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Determination of serum hepatitis C virus(HCV)core protein usinga novel approach for quantitative evaluation of HCV viraemia inanti-HCV-positive patients)。Liver 19375-80。
序列表<110> KENTON Srl<120> 診斷測(cè)試<130> 015-KT-00-PCT<140> PCT/IT00/O0442<141> 2000-11-07<160> 74<170> PatentIn Ver.2.0<210> 1<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 1Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Leu Phe Gly Ile Glu Gly1 5 10<210> 2<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 2Arg Ala Thr Leu Ser Asn Glu His Gly Ile Thr Ile Gly1 5 10<210> 3<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 3Asp Gln Arg Glu Asn Trp Phe Lys Tyr His Gly Phe Gly1 5 10<210> 4<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 4Glu Trp Arg Arg Tyr Met Ser Asp Ile His Gly Tyr Gly1 5 10<210> 5<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 5Asp Ser Leu Arg Tyr Met Tyr Val Met Pro Gly Phe Gly1 5 10<210> 6<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 6Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Leu Phe Gly Ile Asp Met Thr1 5 10 15<210> 7<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 7Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Met Phe Gly Ile Glu Ile Ser1 5 10 15<210> 8<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 8Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Glu Pro Met1 5 10 15<210> 9<211> 14<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 9Asn Ser Arg Trp Leu Ser Lys Ala His Gly Ile Glu Gly Met1 5 10<210> 10<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 10Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Leu Phe Gly Ile Glu Val Met1 5 10 15<210> 11<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 11Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Asp Thr Gln1 5 10 15<210> 12<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 12Lys Ser Arg Glu Gln Leu Ser Lys Leu His Gly Val Asp Thr Ser15 10 15<210> 13<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 13Arg Ser Arg Glu Gln Leu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Asp Leu Thr1 5 10 15<210> 14<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 14Met Trp Arg Thr Trp Leu Met Lys Thr His Gly Ile Glu Ser Trp1 5 10 15<210> 15<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 15Met Leu Arg Thr Trp Leu Met Lys Tyr Gln Gly Ile Glu Ser Trp1 5 10 15<210> 16<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 16Tyr Ser Arg Ser Trp Leu Met Lys Ala His Gly Leu Glu Leu Gly1 5 10 15<210> 17<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 17Met Met Arg Ser Tyr Leu Met Lys Ala His Gly Ile Glu Ser Leu1 5 10 15<210> 18<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 18Met Ser Arg Leu Trp Leu Met Lys Ala His Gly Ile Ser Ser Glu1 5 10 15<210> 19<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 19Lys His Ser Glu Trp Leu Asn Lys Ala Arg Gly Ile Glu Ser Trp1 5 10 15<210> 20<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 20Met Ser Arg Thr Phe Leu Met Lys Ala His Gly Ile Glu Ser Trp1 5 10 15<210> 21<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 21Met Ser Arg Thr Trp Leu Met Lys Ala His Gly Ile Glu Ser Trp1 5 10 15<210> 22<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 22Ala Glu Gly Glu Lys Lys Leu Arg Arg Ser Thr Asn Trp Gly Asp Pro1 5 10 15Ala Lys<210> 23<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 23Ala Glu Gly Glu Phe Lys Thr Arg Arg Gln Thr Asn Tyr Gln Asp Pro1 5 10 15Ala Lys<210> 24<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 24Ala Glu Gly Glu Phe Lys Thr Leu Arg Asn Ala Asn Arg Leu Asp Pro1 5 10 15Ala Lys<210> 25<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 25Ala Glu Gly Glu Phe Lys Thr Leu Arg Asn Ser Asn Arg Leu Asp Pro1 5 10 15Ala Lys<210> 26<211> 25<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 26Ala Glu Gly Glu Phe Lys Lys Phe Pro Gly Ser Ser Thr Pro Lys Asp1 5 10 15Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu20 25<210> 27<211> 25<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 27Ala Glu Gly Glu Phe Pro Gln Asp Ala Arg Phe Pro Gly Gly Gly Asp1 510 15Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu20 25<210> 28<211> 20<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 28Pro Gln Asp Ala Arg Phe Pro Gly Gly Gly Asp Pro Ala Lys Ala Ala1 5 10 15Phe Asp Ser Leu20<210> 29<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 29Ala Glu Gly Glu Phe Lys Gly Ala Gly Gly Ala Gln Thr Val Asp Trp1 5 10 15Ala Leu Leu Val Asp Pro Ala Lys20<210> 30<211> 21<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 30Ala Glu Gly Glu Phe Met Gln His Phe Gly Gly Ala Gln Trp Ile Met1 5 10 15Gly Asp Pro Ala Lys20<210> 31<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 31Ala Glu Gly Glu Phe Leu Ser Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gln Leu1 5 10 15Arg Ala Leu Val Asp Pro Ala Lys20<210> 32<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 32Ala Glu Gly Glu Phe Leu Ser Leu Lys Gly Ser Gly Gly Ala Gln Leu1 5 10 15Arg Ala Leu Val Asp Pro Ala Lys20<210> 33<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 33Ala Glu Gly Glu Phe Tyr Leu Leu Lys Arg Ser Ser Pro Pro Asp Pro1 5 10 15Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu20<210> 34<211> 27<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 34Ala Glu Gly Glu Phe Pro Ile Leu Val Gly Pro Tyr Leu Leu Pro Arg1 5 10 15Arg Ser Arg Glu Glu Ala Val Asp Pro Ala Lys20 25<210> 35<211> 29<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 35Ala Glu Gly Glu Phe Pro Ile Leu Val Gly Pro Tyr Leu Leu Pro Arg1 5 10 15Arg Ser Arg Glu Glu Ala Val Asp Pro Ala Lys Gly Lys20 25<210> 36<211> 20<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 36Ala Glu Gly Glu Phe Arg Leu Gly Val Arg Ala Pro Arg Lys Ala Leul 5 10 15Asp Pro Ala Lys20<210> 37<211> 20<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 37Ala Glu Gly Glu Phe Arg Leu Gly Val Arg Ala Leu Arg Lys Ala Leu1 5 10 15Asp Pro Ala Lys20<210> 38<211> 20<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 38Ala Glu Gly Glu Phe Arg Leu Gly Val Arg Ala Leu Arg Lys Ala Pro1 5 10 15Asp Pro Ala Lys20<210> 39<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 39Arg Leu Gly Val Arg Ala Leu Arg Lys Ala Pro Asp Pro Ala Lys1 5 10 15<210> 40<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 40Ala Glu Gly Glu Phe Thr Gln Pro Arg Gly His Ser Tyr Gln Asp Pro1 5 10 15Ala Lys<210> 41<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 41Ala Glu Gly Glu Phe Leu Lys Glu Arg Ala Glu Met Ser Ala Arg Lys1 5 10 15Thr Leu Gly Ala Asp Pro Ala Lys20<210> 42<211> 22<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 42Ala Glu Gly Glu Phe Phe Tyr Gln Ile Pro Arg Arg Met Glu Thr Lys1 5 10 15Tyr Gly Asp Pro Ala Lys20<210> 43<211> 22<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 43Ala Glu Gly Glu Phe Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Leu Phe Gly Ile1 5 10 15Glu Gly Asp Pro Ala Lys20<210> 44<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 44Ala Glu Gly Glu Phe Asn Ser Arg Glu Trp Leu Ser Lys Ala His Gly1 5 10 15Ile Glu Gly Met Asp Pro Ala Lys20<210> 45<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 45Ala Glu Gly Glu Phe Arg Ser Arg Glu Gln Leu Ser Lys Leu Phe Gly1 5 10 15Ile Asp Leu Thr Asp Pro Ala Lys20<210> 46<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 46Ala Glu Gly Glu Phe Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Leu Phe Gly1 5 10 15Ile Asp Met Thr Asp Pro Ala Lys20<210> 47<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 47Ala Glu Gly Glu Phe Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Met Phe Gly1 5 10 15Ile Glu Thr Ser Asp Pro Ala Lys20<210> 48<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 48Ala Glu Gly Glu Phe Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Leu Phe Gly1 5 10 15Ile Glu Val Met Asp Pro Ala Lys20<210> 49<211> 23<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 49Ala Glu Gly Glu Phe Lys Ser Arg Glu Gln Leu Arg Lys Leu His Gly1 5 10 15Phe Asp Thr Ser Pro Ala Lys20<210> 50<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 50Ala Glu Gly Glu Phe Lys Met Arg Asn Tyr Leu Asn Lys Ala Phe Gly1 5 10 15Ile Glu Gly Met Asp Pro Ala Lys20<210> 51<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 51Ala Glu Gly Glu Phe Arg Ser Arg Glu Gln Leu Ser Lys Leu Phe Gly1 5 10 15Ile Glu Leu Thr Asp Pro Ala Lys20<210> 52<211> 23<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 52Ala Glu Gly Glu Phe Ser Arg Arg Glu Tyr Ser Asn Lys Ala Phe Gly1 5 10 15Ile Glu Thr Gln Pro Ala Lys20<210> 53<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 53Ala Glu Gly Glu Phe Arg Arg Arg Glu Tyr Leu Asn Lys Ala Phe Gly1 5 10 15Ile Glu Gly Gly Asp Pro Ala Lys20<210> 54<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 54Ala Glu Gly Glu Phe Ser Arg Arg Glu Trp Leu Asn Lys Arg Phe Gly1 5 10 15Ile Glu Tyr Leu Asp Pro Ala Lys20<210> 55<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 55Ala Glu Gly Glu Phe Met Ser Arg Thr Trp Leu Met Lys Ala His Gly1 5 10 15Ile Glu Ser Trp Asp Pro Ala Lys20<210> 56<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 56Ala Glu Gly Glu Phe Tyr Ser Pro Glu Trp Leu Asn Lys Ala Arg Gly1 5 10 15Ile Asp Arg Ser Asp Pro Ala Lys20<210> 57<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 57Ala Glu Gly Glu Phe Lys Ser Arg Glu Gln Leu Ser Lys Leu His Gly1 5 10 15Val Asp Thr Ser Asp Pro Ala Lys20<210> 58<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 58Ala Glu Gly Glu Phe Tyr Ser Arg Glu Gln Leu Asn Lys Met Phe Gly1 5 10 15Ile Glu Ile Ser Asp Pro Ala Lys20<210> 59<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 59Ala Glu Gly Glu Phe Tyr Ser Arg Ser Trp Leu Met Lys Ala His Gly1 5 10 15Leu Glu Leu Gly Asp Pro Ala Lys20<210> 60<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 60Ala Glu Gly Glu Phe Met Met Arg Ser Tyr Leu Met Lys Ala His Gly1 5 10 15Ile Glu Ser Leu Asp Pro Ala Lys20<210> 61<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 61Ala Glu Gly Glu Phe Met Ser Arg Leu Trp Leu Met Lys Ala His Gly1 5 10 15Ile Ser Ser Glu Asp Pro Ala Lys20<210> 62<211> 30<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 62Ala Glu Gly Glu Phe Pro Gln Pro Gln Glu Val His Val Tyr Arg Glu1 5 10 15Gln Leu Gly Leu Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu20 25 30<210> 63<211> 28<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 63Ala Glu Gly Glu Phe Gly Glu Val Leu Tyr Arg Gly Phe Asp Glu Val1 5 10 15Gly Gly Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu20 25<210> 64<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 64Ala Gly Glu Pro Tyr Val Ile Glu Arg Gly Met Gln Asp Pro Ala Lys1 5 10 15<210> 65<211> 27<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 65Ala Glu Gly Glu Phe Thr Thr Ala Ser Pro Arg His Phe Leu Val Pro1 5 10 15Leu Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu20 25<210> 66<211> 27<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 66Ala Glu Gly Glu Phe Thr Thr Ala Ser Pro Ala His Phe Leu Val Pro1 5 10 15Leu Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu20 25<210> 67<211> 27<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 67Ala Glu Gly Glu Phe Thr Thr Ala Ser Pro Ser His Phe Leu Val Pro1 5 10 15Leu Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu20 25<210> 68<211> 19<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 68Ala Glu Gly Glu Phe Ala Thr Ala Pro Pro Arg His Tyr Ser Trp Asp1 5 10 15Pro Ala Lys<210> 69<211> 19<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 69Ala Glu Gly Glu Phe Ala Thr Ala Pro Pro Ala His Tyr Ser Trp Asp1 5 10 15Pro Ala Lys<210> 70<211> 19<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 70Ala Glu Gly Glu Phe Ala Thr Ala Pro Pro Ser His Tyr Ser Trp Asp1 5 10 15Pro Ala Lys<210> 71<211> 24<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 71Ala Glu Gly Glu Phe Arg Phe Trp Lys Val Pro Asp Tyr Asp Pro Pro1 5 10 15Ala Ala Gly Gly Asp Pro Ala Lys20<210> 72<211> 29<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 72Ala Glu Gly Glu Phe Thr Glu Ser Ser Val Ser Ser Thr Leu Ala Asp1 5 10 15Leu Ala Ser Lys Thr Phe Gly Ser Ala Asp Pro Ala Lys20 25<210> 73<211> 22<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 73Ala Glu Gly Glu Phe Thr Leu Ala Asp Leu Ala Thr Met Thr Phe Gly1 5 10 15Ser Thr Asp Pro Ala Lys20<210> 74<211> 21<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述噬菌體文庫(kù)克隆<400> 74Ala Glu Gly Glu Phe Gly Leu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Thr Phe Gly1 5 10 15Ser Pro Asp Ala Lys20
權(quán)利要求
1.診斷抗原的方法，包括通過(guò)用抗原模擬物的抗體檢測(cè)(ADAM)方法學(xué)鑒定血清中抗抗原的抗體分子的結(jié)合特異性，用抗原模擬物的抗體檢測(cè)方法學(xué)包括用來(lái)自受到抗原感染的病人和非感染個(gè)體的血清篩選噬菌體文庫(kù)，從而鑒定結(jié)合與該抗原特異相關(guān)的抗體(配體)的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述配體通過(guò)體外成熟策略加以改進(jìn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述配體為合成肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其中所述配體連接到共同核心上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述共同核心和所述配體一起是MAP。
6.通過(guò)包含下列步驟的方法可獲得的抗原特異性配體的集合a)首先在n個(gè)陽(yáng)性血清之上淘選噬菌體文庫(kù)以產(chǎn)生第一套n個(gè)噬菌體庫(kù)；b)制備n個(gè)含有n-1個(gè)庫(kù)的噬菌體庫(kù)混合物；c)對(duì)n個(gè)混合物中的每一個(gè)進(jìn)行抗產(chǎn)生經(jīng)排除的噬菌體庫(kù)的血清的親和力選擇，從而得到第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)，可選地d)附加地，在由除了用于第一次淘選的之外所有n個(gè)原始血清所組成的混合物之上淘選第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)中的每一個(gè)；e)用所有n個(gè)原始血清的混合物對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，從而得到陽(yáng)性克??；f)通過(guò)使用作為噬菌體分泌群體的所述克隆的整齊陣列測(cè)試所有陽(yáng)性克隆與陽(yáng)性和陰性血清組的個(gè)體反應(yīng)性；g)產(chǎn)生所述噬菌體分泌群體的復(fù)制物；h)篩選每個(gè)復(fù)制物對(duì)陽(yáng)性和陰性血清的反應(yīng)性，從而顯露出與陽(yáng)性血清特異地反應(yīng)的克隆；i)使用所述特異反應(yīng)噬菌體中的每一個(gè)作為配基來(lái)從陽(yáng)性血清中親和純化出抗體；j)測(cè)試所述抗體以確定它們與先前鑒定的抗原特異性肽的反應(yīng)性；k)挑選出檢測(cè)血清抗體的克隆。
7.診斷丙型肝炎的方法，包括通過(guò)用抗原模擬物的抗體檢測(cè)(ADAM)方法學(xué)鑒定血清中抗HCV的抗體分子的結(jié)合特異性，用抗原模擬物的抗體檢測(cè)方法學(xué)包括用來(lái)自HCV病人和非感染個(gè)體的血清篩選噬菌體文庫(kù)，從而鑒定結(jié)合與HCV感染特異相關(guān)的抗體(配體)的肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述配體通過(guò)體外成熟策略加以改進(jìn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述配體為合成肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的方法，其中所述配體連接到共同核心上。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述共同核心和所述配體一起是MAP。
12.通過(guò)包含下列步驟的方法可獲得的HCV特異性配體的集合a)首先在n個(gè)陽(yáng)性血清之上淘選噬菌體文庫(kù)以產(chǎn)生第一套n個(gè)噬菌體庫(kù)；b)制備n個(gè)含有n-1個(gè)庫(kù)的噬菌體庫(kù)混合物；c)對(duì)n個(gè)混合物中的每一個(gè)進(jìn)行抗產(chǎn)生經(jīng)排除的噬菌體庫(kù)的血清的親和力選擇，從而得到第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)，可選地d)附加地，在由除了用于第一次淘選的之外所有n個(gè)原始血清所組成的混合物之上淘選第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)中的每一個(gè)；e)用所有n個(gè)原始血清的混合物對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的第二套n個(gè)噬菌體庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，從而得到陽(yáng)性克?。籪)通過(guò)使用作為噬菌體分泌群體的所述克隆的整齊陣列測(cè)試所有陽(yáng)性克隆與陽(yáng)性和陰性血清組的個(gè)體反應(yīng)性；g)產(chǎn)生所述噬菌體分泌群體的復(fù)制物；h)篩選每個(gè)復(fù)制物與陽(yáng)性和陰性血清的反應(yīng)性，從而顯露出與陽(yáng)性血清特異地反應(yīng)的克?。籭)使用所述特異反應(yīng)噬菌體中的每一個(gè)作為配基來(lái)從陽(yáng)性血清中親和純化出抗體；j)測(cè)試所述抗體以確定它們與先前鑒定的HCV肽的反應(yīng)性；k)挑選出檢測(cè)血清抗體的克隆。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的集合，其中步驟a)的噬菌體文庫(kù)為pVIII-12aa。
14.根據(jù)權(quán)利要求12和13所述的集合，其中從權(quán)利要求12的步驟k)中挑選出的克隆的插入片段具有下列序列SREQLNKLFGIEG；RATLSNEHGITIG；DQRENWFKYHGFG；EWRRYMSDIHGYG；DSLRYMYVMPGFG。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的集合，其中產(chǎn)生了噬菌體文庫(kù)，在該噬菌體文庫(kù)中最優(yōu)反應(yīng)性克隆經(jīng)部分誘變以致克隆序列的每個(gè)氨基酸能夠獨(dú)立地被任何其他的氨基酸替換。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的集合，其中產(chǎn)生了噬菌體文庫(kù)，在該噬菌體文庫(kù)中反應(yīng)性克隆經(jīng)部分誘變以致克隆序列的每個(gè)氨基酸能夠獨(dú)立地被任何其他的氨基酸替換。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的集合，其中所述克隆具有下列插入序列SREQLNKLFGIEG。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任何一項(xiàng)所述的集合，其中在所述噬菌體文庫(kù)中，隨機(jī)序列的兩側(cè)為兩個(gè)半胱氨酸殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求12-18中任何一項(xiàng)所述的集合，其中肽序列連接于共同核心上。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的集合，其中所述共同核心和所述肽一起是MAP。
21.權(quán)利要求12-20中任何一項(xiàng)所述的集合在制備用于檢測(cè)懷疑感染了所述HCV的對(duì)象中HCV的診斷試樣之中的用途。
22.用于診斷目的的試劑盒，其含有權(quán)利要求6所述的集合。
23.用于HCV診斷的試劑盒，其含有權(quán)利要求12-20中任何一項(xiàng)所述的集合。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的試劑盒，其含有所述集合固定于其上的帶。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中所述帶進(jìn)一步含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
26.選自下列的肽i)SREQLNKLFGIEG；ii) RATLSNEHGITIG；iii) DQRENWFKYHGFG；iv) EWRRYMSDIHGYG；v)DSLRYMYVMPGFG；vi) YSREQLNKLFGIDMT；vii) YSREQLNKMFGIEIS；viii) YSREQLSKLFGIEPM；ix) NSRWLSKAHGIEGM；x)YSREQLNKLFGIEVM；xi) YSREQLSKLFGIDTQ；xii) KSREQLSKLHGVDTS；xiii) RSREQLSKLFGIDLT；xiv) MWRTWLMKTHGIESW；xv) MLRTWLMKYQGIESW；xvi) YSRSWLMKAHGLELG；xvii) MMRSYLMKAHGIESL；xviii)MSRLWLMKAHGISSE；xix) KHSEWLNKARGIESW；xx) MSRTFLMKAHGIESW；xxi) MSRTWLMKAHGIESW；；xxii) AEGEKKLRRSTNWGDPAK；xxiii) AEGEFKTRRQTNYQDPAK；xxiv) AEGEFKTLRNANRLDPAK；xxv) AEGEFKTLRNSNRLDPAK；xxvi) AEGEFKKFPGSSTPKDPAKAAFDSL；xxvii) AEGEFPQDARFPGGGDPAKAAFDSL；xxviii)PQDARFPGGGDPAKAAFDSL；xxix) AEGEFKGAGGAQTVDWALLVDPAK；xxx) AEGEFMQKHFGGAQWIMGDPAK；xxxi) AEGEFLSLKGSGGGQLRALVDPAK；xxxii) AEGEFLSLKGSGGAQLRALVDPAK；xxxiii) AEGEFYLLKRSSPPDPAKAAFDSL；xxxiv)AEGEFPILVGPYLLPRRSREEAVDPAK；xxxv) AEGEFPILVGPYLLPRRSREEAVDPAKGK；xxxvi)AEGEFRLGVRAPRKALDPAK；xxxvii) AEGEFRLGVRALRKALDPAK；xxxviii) AEGEFRLGVRALRKAPDPAK；xxxix)RLGVRALRKAPDPAK；xl)AEGEFTQPRGHSYQDPAK；xli) AEGEFLKERAEMSARKTLGADPAK；xlii) AEGEFFYQIPRRMETKYGDPAK；xliii) AEGEFSREQLNKLFGIEGDPAK；xliv) AEGEFNSREWLSKAHGIEGMDPAK；xlv) AEGEFRSREQLSKLFGIDLTDPAK；xlvi) AEGEFYSREQLNKLFGIDMTDPAK；xlvii) AEGEFYSREQLNKMFGIETSDPAK；xlviii)AEGEFYSREQLNKLFGIEVMDPAK；xix) AEGEFKSREQLRKLHGFDTSDPAK；l) AEGEFKMRNYLNKAFGIEGMDPAK；li)AEGEFRSREQLSKLFGIELTDPAK；lii) AEGEFSRREYSNKAFGIETQDPAK；liii) AEGEFRRREYLNKAFGIEGGDPAK；liv) AEGEFSRREWLNKRFGIEYLDPAK；lv)AEGEFMSRTWLMKAHGIESWDPAK；lvi) AEGEFYSPEWLNKARGIDRSDPAK；lvii) AEGEFKSREQLSKLHGVDTSDPAK；lviii) AEGEFYSREQLNKMFGIEISDPAK；lix) AEGEFYSRSWLMKAHGLELGDPAK；lx)AEGEFMMRSYLMKAHGIESLDPAK；lxi) AEGEFMSRLWLMKAHGISSEDPAK；lxii) AEGEFPQPQEVHVYREQLGLDPAKAAFDSL；lxiii) AEGEFGEVLYRGFDEVGGDPAKAAFDSL；lxiv) AGEPYVIERGMQDPAK；lxv) AEGEFTTASPRHFLVPLDPAKAAFDSL；lxvi) AEGEFTTASPAHFLVPLDPAKAAFDSL；lxvii) AEGEFTTASPSHFLVPLDPAKAAFDSL；lxviii)AEGEFATAPPRHYSWDPAK；lxix) AEGEFATAPPAHYSWDPAK；lxx) AEGEFATAPPSHYSWDPAK；lxxi) AEGEFRFWKCPDYDPPAAGGDPAK；lxxii) AEGEFTESSVSSTLADLASKTFGSADPAK；lxxiii)AEGEFTLADLATMTFGSTDPAK；lxxiv) AEGEFGLADLATLTFGSPDPAK。
27.權(quán)利要求26所述的肽在權(quán)利要求7-11所述的方法中的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求12-20中任何一項(xiàng)所述的集合，其含有至少一種權(quán)利要求26所述的肽。
29.用于感染檢測(cè)的試劑盒，其含有權(quán)利要求6所述的集合。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的試劑盒，其含有所述集合固定于其上的帶。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述帶進(jìn)一步含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
32.用于HCV感染檢測(cè)的試劑盒，其含有權(quán)利要求12-20中任何一項(xiàng)所述的集合。
33.用于HCV感染檢測(cè)的試劑盒，其含有至少一種來(lái)自權(quán)利要求25所述的集合的肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的試劑盒，其含有所述集合固定于其上的帶。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中所述帶進(jìn)一步含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
36.權(quán)利要求6所述的集合在疫苗制備中的用途。
37.權(quán)利要求12-20中任何一項(xiàng)所述的集合或者至少一種權(quán)利要求26所述的肽在抗HCV疫苗制備中的用途。
38.抗HCV的疫苗，其含有至少一種權(quán)利要求12-20中任何一項(xiàng)所述的集合或者至少一種權(quán)利要求26所述的肽。
全文摘要
用于對(duì)抗原作診斷的方法，其包括通過(guò)用抗原模擬物的抗體檢測(cè)(ADAM)方法學(xué)鑒定血清中抗抗原的抗體分子的結(jié)合特異性，用抗原模擬物的抗體檢測(cè)方法學(xué)包括用來(lái)自受到抗原感染的病人和非感染個(gè)體的血清篩選噬菌體文庫(kù)，從而鑒定結(jié)合與該抗原特異相關(guān)的抗體(配體)的肽。通過(guò)體外成熟策略以及將配體連接到共同核心上(例如MAP)可獲得該方法的改進(jìn)。特別地，該方法應(yīng)用于HCV。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1455866SQ00820000
公開日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2000年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月3日
發(fā)明者F·費(fèi)利西, N·加爾加諾, O·米年科娃, P·莫納西 申請(qǐng)人:肯頓有限公司