專利名稱：抗原組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及脂質(zhì)用于制備抗原組合物的用途，特別是制備活的細(xì)菌疫苗的用途，及使用該組合物使動物免疫的方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)人和動物的病原體，包括那些引起肺結(jié)核(TB)的病原體，可通過粘膜表面引發(fā)感染。因此，對抗這些病原體的保護(hù)性免疫可能需要強(qiáng)粘膜免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。然而，在非腸道免疫后的粘膜免疫反應(yīng)一般較弱。盡管對保護(hù)粘膜位點(diǎn)的疫苗，特別是TB疫苗有著明顯的需要，但當(dāng)前使用的疫苗是通過皮內(nèi)或皮下注射使用的。因而人們希望開發(fā)更有效的組合物，和/或可選擇途徑的疫苗給藥系統(tǒng)。特別是口服疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括易于服用，并以粘膜免疫反應(yīng)為目標(biāo)。盡管如此，能夠?qū)游锖腿颂峁┱衬ず?或系統(tǒng)免疫的口服疫苗到目前為止大多是無效的。這種疫苗的功效受到在其通過腸道時疫苗退化的影響。特別是大多數(shù)抗原化合物具有肽鍵，其很容易被腸道中的胃酶和蛋白酶分解。
許多疫苗依賴于有機(jī)體凍干制劑的使用。例如，目前使用的人TB疫苗以被稱為卡介苗(BCG)的活減毒細(xì)菌的凍干制劑為基礎(chǔ)。然而，已表明凍干過程可導(dǎo)致BCG活性損失30-50％并損害剩余活細(xì)菌的恢復(fù)(7)?？稍谑褂们笆褂袡C(jī)體保持較大活性的組合物將極大地提高疫苗的功效。
為改善免疫反應(yīng)，抗原與許多佐劑混合以刺激免疫原性。這些佐劑主要是明礬和水包油型乳化液。后一類以弗氏(Freund’s)礦物油佐劑為代表。然而，在人和脊椎動物疫苗中使用弗氏完全佐劑(FCA)是不可取的，因?yàn)橐延卸拘苑磻?yīng)的報道?；谶@些理由，弗氏佐劑可能也不適用于口服。
在其它的水包油型乳化液中因?yàn)橛秃扛撸孕枰砻婊钚詣?。表面活性劑的清潔性使它們不適用于腸道或口服使用。另外，甚至對于被批準(zhǔn)使用的表面活性劑也有毒性反應(yīng)的報道。乳化液其它的缺點(diǎn)在于其是一種液體分散于另一種液體中時不能混溶的異質(zhì)系統(tǒng)，該系統(tǒng)是不穩(wěn)定的，并且水相隨時間發(fā)生分離，這對使疫苗保持在穩(wěn)定的懸浮液中造成困難。此外，防止在油包水型乳化液的水相中截留的抗原免于降解是不可能的。
也研究了脂質(zhì)體和脂質(zhì)囊泡在疫苗上的使用，特別是對容易膠囊化的較小抗原成分而言。通常，脂質(zhì)體和脂質(zhì)囊泡對于較大抗原如活的微生物的膠囊化是無效的。另外，脂質(zhì)體和脂質(zhì)囊泡生產(chǎn)成本高且生產(chǎn)耗時，并且在它們的制備中所用的提取過程可能導(dǎo)致疫苗制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)或活性改變，因此導(dǎo)致疫苗免疫原性的改變。例如，受熱和溶劑可能改變抗原成分如蛋白質(zhì)的生物學(xué)完整性。
因此本發(fā)明的目的是提供一種抗原組合物和/或給藥系統(tǒng)，其可解決這些需要或至少為公眾提供一種有用的選擇。
發(fā)明概述因此，在第一個方面本發(fā)明提供一種抗原組合物，其包含脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分，該抗原成分包含活的有機(jī)體。
優(yōu)選地，該脂質(zhì)制劑是固體形式。
在另一個方面本發(fā)明提供一種抗原組合物，其包含在10℃或以上時為固體形式的脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物中使用的脂質(zhì)制劑包含長鏈脂肪酸。
在脂肪酸組分方面，優(yōu)選的脂質(zhì)制劑包含40％-100％，優(yōu)選為60％-100％，更優(yōu)選為80％-100％，再更優(yōu)選為90％-100％的C16和/或C18脂肪酸。
更優(yōu)選的組合物含有脂質(zhì)制劑，該脂質(zhì)制劑包含少于35％，優(yōu)選少于25％，更優(yōu)選少于10％的C14或更短的脂肪酸。
在一種實(shí)施方案中，脂質(zhì)制劑包含20％-60％的飽和脂肪酸；25％-60％的單不飽和脂肪酸；及0.5％-15％的多不飽和脂肪酸。
在特別優(yōu)選的組合物中，脂質(zhì)制劑包含35％-50％的飽和脂肪酸；40％-55％的單不飽和脂肪酸；及5％-9％的多不飽和脂肪酸。
在本發(fā)明中所用的通常優(yōu)選的脂質(zhì)制劑具有以下配方3％的肉豆蔻酸；26％的棕櫚酸；15％的硬脂酸；40％的油酸；及6％的亞油酸。
抗原成分可以是蛋白質(zhì)、糖蛋白質(zhì)、肽、或者具有蛋白質(zhì)或肽成分的因子。
在一種實(shí)施方案中，抗原成分包含活的有機(jī)體。
優(yōu)選地，本發(fā)明組合物中的活的有機(jī)體是細(xì)菌，特別是非病原性細(xì)菌，更優(yōu)選屬于分支桿菌屬的細(xì)菌。本發(fā)明中使用的特別優(yōu)選的分支桿菌是牛型結(jié)核菌(Mycobacterium bovis)BCG。
在一種實(shí)施方案中，組合物包含至少兩種抗原成分。第一種優(yōu)選為活的有機(jī)體，而第二種抗原成分優(yōu)選取自傳染媒介或者是弱免疫原性的蛋白質(zhì)或肽。
在另一個方面，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明的抗原組合物的方法，該方法包括將抗原成分與脂質(zhì)制劑混合。
在另一個方面，本發(fā)明還提供一種使動物免疫的方法，該方法包括對所述的動物使用本發(fā)明的抗原組合物。
在另一個方面，本發(fā)明提供一種刺激動物中粘膜免疫反應(yīng)的方法，該方法包括對所述的動物使用本發(fā)明的抗原組合物。
在這些方法中該組合物的使用優(yōu)選通過口服途徑。
本發(fā)明還涉及脂質(zhì)制劑在制備本發(fā)明的抗原組合物中的用途。
附圖簡要說明現(xiàn)在將參照附圖對本發(fā)明的各方面進(jìn)行描述，其中

圖1，脂質(zhì)制劑的脂肪酸組分。按照標(biāo)準(zhǔn)方案用氣相色譜分析脂質(zhì)。各脂質(zhì)的脂肪酸組分以總脂肪酸組分的百分比表示。
圖2，配制且儲存在4℃(2a)或室溫(10-25℃)(2b)的脂質(zhì)中后BCG的活性。BCG制劑被加溫到37℃并在7H9肉湯中乳化。通過將連續(xù)10倍稀釋的各乳化液接種到7H11瓊脂平板上確定活的有機(jī)體的數(shù)目。在培養(yǎng)2-3周后確定制劑介質(zhì)的CFU/ul數(shù)目。結(jié)果表示的是兩次試驗(yàn)的結(jié)果且用平均數(shù)表示。
圖3，在口服不同劑量的按配方配制的M.bovis BCG疫苗后的牛PPD誘導(dǎo)的IFN-γ反應(yīng)。小鼠在口服按配方配制的M.bovis BCG(圓形)、非按配方配制的M.bovis BCG(三角形)或僅用制劑材料(菱形)后第8周處死。脾細(xì)胞用牛PPD孵育72小時，然后收集上清液并用夾心ELISA法進(jìn)行分析。每個處理組包含6只小鼠，脾被單獨(dú)地處理。結(jié)果以pg/ml表示，并用三次測定的平均值表示。豎條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖4，在BALB/c小鼠中對M.bovis BCG疫苗抗原誘導(dǎo)的脾IFN-γ反應(yīng)。在皮下注射106CFU的M.bovis BCG疫苗(方形)、口服107CFU的按配方配制的M.bovis BCG疫苗(圓形)、非按配方配制的M.bovis BCG(三角形)或僅用制劑材料(菱形)后的第2、4、6和8周無痛處死小鼠。脾細(xì)胞用牛PPD孵育72小時，然后收集上清液并用夾心ELISA法進(jìn)行分析。每個處理組包含5-6只小鼠，脾被單獨(dú)地處理。第8周的結(jié)果來自2個分離的試驗(yàn)，P值＜0.05(Student t檢驗(yàn))。豎條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖5，與非粘附腹膜漿細(xì)胞(NPEC)共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞對M.bovis的生長抑制。用M.bovis以每個巨噬細(xì)胞兩個細(xì)菌的MOI感染巨噬細(xì)胞，非粘附的自體同源NPEC按每個巨噬細(xì)胞10NPEC的比率加入。在感染后72小時對[3H]尿嘧啶混合進(jìn)行分析。不含M.bovis的細(xì)胞培養(yǎng)的平均[3H]尿嘧啶攝入是460cpm。共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和NPEC的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長用三次的平均值表示。結(jié)果代表兩個試驗(yàn)。*表示與僅含制劑材料的對照組的平均值有顯著差異的平均值；豎條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖6，負(fù)鼠口服接種按配方配制的BCG對體外外周血淋巴細(xì)胞對PPD-B的母細(xì)胞化反應(yīng)(blastogenic response)的影響。按配方配制的BCG◆---◆；非按配方配制的BCG■---■；非接種的對照X---X；結(jié)果以平均刺激指數(shù)(SI)表示。*表示與非接種的對照組的平均值有顯著差異的平均值。豎條表示SE。
圖7，口服接種按配方配制的BCG對用M.bovis進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)的負(fù)鼠的體重的影響。平均體重變化在從進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)到處死的時間內(nèi)確定。進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)前的負(fù)鼠的平均體重是3.0±0.07(±SE)kg。豎條表示SE。
圖8，口服接種按配方配制的BCG對用M.bovis進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)的負(fù)鼠的肺重量的影響。平均肺重量在處死時確定。為使隨體重變化的肺重量差異標(biāo)準(zhǔn)化，將各動物的肺重量與體重相比并表示為比率。*表示與非接種的對照組的平均值有顯著差異的平均值；豎條表示SE。
圖9，負(fù)鼠口服接種按配方配制的BCG對用M.bovis進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)后的從肺分離的分支桿菌平均數(shù)的影響。結(jié)果以CFU(log10)/g組織的幾何平均數(shù)表示。*表示與非接種的對照組的平均值有顯著差異的平均值；豎條表示SE。
圖10，負(fù)鼠口服接種按配方配制的BCG對用M.bovis進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)后的從脾分離的分支桿菌平均數(shù)的影響。結(jié)果以組織的CFU(log10)/g的幾何平均數(shù)表示。*表示與非接種的對照組的平均值有顯著差異的平均值；豎條表示SE。
圖11，對四種口服脂質(zhì)BCG制劑或皮下接種的免疫反應(yīng)的比較。圖中顯示了接種(第0周)和進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)(第8周)后對負(fù)鼠的體外外周血淋巴細(xì)胞對PPD-B的母細(xì)胞化反應(yīng)的影響。結(jié)果表示為平均刺激指數(shù)(SI)。
圖12為本發(fā)明的普通疫苗給藥系統(tǒng)的示意圖。
詳細(xì)說明因此，在第一個方面，本發(fā)明提供一種抗原組合物，其包含脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分，該抗原成分包含活的有機(jī)體。
優(yōu)選地，脂質(zhì)為固體形式。適宜的是在10℃或以上為固體形式的脂質(zhì)。
在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗原組合物，其包含在10℃或以上時為固體形式的脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分。
在上述制劑中采用的脂質(zhì)優(yōu)選適于動物或人體食用，并可以廣泛地從天然的(來自于植物或動物)或合成的脂質(zhì)產(chǎn)品中選取，包括油、脂和蠟。
最一般的情況是脂質(zhì)材料在高于約30℃的溫度下為液體，也就是說應(yīng)選擇在將脂質(zhì)給藥、最通常是將脂質(zhì)口服給藥的動物的生理溫度下可達(dá)到熔點(diǎn)的脂質(zhì)。理想地，脂質(zhì)在大氣壓下在10-30℃下為固體形式，優(yōu)選在大氣壓下在20℃-30℃時仍為固體。然而脂質(zhì)的熔化溫度不是唯一的，并且包括具有熔化溫度范圍的油、脂和蠟。
本文優(yōu)選使用的脂質(zhì)在約30℃和約37℃的生理溫度之間會發(fā)生從固相到液相的轉(zhuǎn)變。從本領(lǐng)域技術(shù)中可得到脂相行為的總結(jié)，例如參見(10)。因此，有經(jīng)驗(yàn)的讀者能夠根據(jù)本領(lǐng)域的信息和簡單的試驗(yàn)來選擇具有所需要特性和熔點(diǎn)的脂質(zhì)。
適宜的脂質(zhì)制劑是包括羧酸甘油酯在內(nèi)的甘油三酸酯、由脂肪鏈和-COOH末端組成的化合物、飽和與不飽和的脂肪酸、及其混合物。
當(dāng)前優(yōu)選的脂質(zhì)主要是含有C8-C20?；母视腿狨?，例如肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、parinic、月桂酸、亞麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸或其混合物。
現(xiàn)已確定，對于在本發(fā)明中可用的脂質(zhì)制劑，優(yōu)選的是較長鏈的脂肪酸，例如C16-C18脂肪酸。已發(fā)現(xiàn)長鏈脂肪酸對有機(jī)體的保護(hù)更有效，如給予小鼠和負(fù)鼠的疫苗中的BCG。如此看來，在本發(fā)明中優(yōu)選使用的脂質(zhì)制劑包含40％-100％，優(yōu)選為60％-100％，優(yōu)選為80％-100％，更優(yōu)選為90％-100％的C16和/或C18脂肪酸。
一般C16脂肪酸占總脂肪酸含量的10％-40％，更優(yōu)選為20％-35％再更優(yōu)選為25％-32％，而C18脂肪酸占總脂肪酸含量的40％-90％，優(yōu)選為50％-80％，更優(yōu)選為60％-70％。
優(yōu)選的脂質(zhì)制劑還包含少于35％，優(yōu)選少于25％，更優(yōu)選少于10％的C14或更短的脂肪酸。
從鏈長度來看，優(yōu)選的脂質(zhì)制劑包含少于5％的C14或更短的脂肪酸，25％-32％的C16脂肪酸和60％-70％的C18脂肪酸。
從它們的脂肪酸含量來看，在本發(fā)明中使用的脂質(zhì)制劑包含20％-60％，優(yōu)選為30％-55％，更優(yōu)選為40％-50％的飽和脂肪酸；25％-60％，優(yōu)選為30％-60％，更優(yōu)選為40％-55％的單不飽和脂肪酸；及0.5％-15％優(yōu)選為3％-11％，更優(yōu)選為5％-9％的多不飽和脂肪酸。
在本發(fā)明中使用的特別優(yōu)選的脂質(zhì)制劑包含40％-50％的飽和脂肪酸，40％-50％的單不飽和脂肪酸，及5％-9％的多不飽和脂肪酸。
在本發(fā)明中使用的通常優(yōu)選的脂質(zhì)制劑按HPLC分析測定，具有以下配方3％的肉豆蔻酸，26％的棕櫚酸，15％的硬脂酸，40％的油酸及6％的亞油酸。
通常優(yōu)選的脂質(zhì)制劑還包含來自于動物的分餾脂質(zhì)復(fù)合物、一種或多種氫化植物油，特別是橄欖油或椰子油、商用栓劑基本成分、其它的脂質(zhì)制劑或其混合物。
脂質(zhì)制劑可用于抗原組合物的制備，及防止組合物中的抗原退化。脂質(zhì)制劑對于保持活的有機(jī)體、尤其是細(xì)菌的活性特別有用。脂質(zhì)制劑起到將有機(jī)體保持在活的而不是休眠狀態(tài)的作用。這一點(diǎn)對于配制成口服使用的包含活的有機(jī)體的疫苗特別重要。脂質(zhì)還可將抗原保持在均勻的懸浮液中。也就是說，在本發(fā)明的組合物中抗原成分、特別是活的有機(jī)體在整個固體或膏狀脂質(zhì)基質(zhì)中是均勻分布的。在口服時脂質(zhì)還可防止抗原受胃腸道分泌物的破壞。在通過其它途徑如皮下使用時防止受巨噬細(xì)胞的攻擊也是可能的。這使得抗原和特別是活的有機(jī)體可以通過胃腸道粘膜吸收，并隨后可以在宿主中復(fù)制?；畹挠袡C(jī)體在宿主中的復(fù)制刺激了保護(hù)性免疫反應(yīng)，這一點(diǎn)通過用劇毒細(xì)菌進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)后疾病嚴(yán)重程度的降低得到了確定。
適用于多種給藥途徑的制劑還可以包括添加劑，如填充劑、增量劑、粘結(jié)劑、潤濕劑、乳化劑、拋光劑、表面活性劑、助懸劑、防腐劑、著色劑、鹽、抗氧化劑，包括谷氨酸鈉(MSG)、維生素如維生素E、丁基化羥基茴香醚(BHA)、白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(ADC)、保護(hù)涂層、引誘劑、芳香劑、及有助于包含在脂質(zhì)中的有機(jī)體存活的試劑，但并不局限于此。
保護(hù)涂層或腸衣可以從例如包括明膠在內(nèi)的凝膠、石蠟及塑膠中選擇。當(dāng)選擇口服途徑時涂層還有助于防止暴露于胃酸和酶。
當(dāng)用于口服使用時，制劑還可以包括例如改善口味的添加劑，如調(diào)味劑(包括茴香油、巧克力和薄荷油)和甜味劑(包括葡萄糖、果糖或任何其它食糖或人造甜味劑)。
抗原成分可以是蛋白質(zhì)、糖蛋白質(zhì)、肽、或者具有蛋白質(zhì)或肽成分的因子或其混合物。這種成分可以來自可被用于在動物中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的試劑。
最通常地，抗原至少帶有一個抗原決定基，其存在于對處理的動物是病原性的有機(jī)體上。也可以使用本領(lǐng)域公知的其它抗原結(jié)構(gòu)，例如與載體結(jié)合的多糖、糖脂和半抗原。
優(yōu)選地，抗原成分是活的有機(jī)體。
組合物中的活的有機(jī)體可以選自真菌、原生動物、細(xì)菌和病毒。例如，HIV、SIV、布魯氏菌和炭疽。優(yōu)選地，有機(jī)體是細(xì)菌，優(yōu)選在配制成口服或皮下給藥的組合物中使用通常選自非病原性細(xì)菌的有機(jī)體，優(yōu)選的細(xì)菌是選自分支桿菌屬的非病原性菌株，包括結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)復(fù)合體(包括結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.Africanum)及田鼠分枝桿菌(M.microtii))、胞內(nèi)鳥型分枝桿菌(M.avium-intracellulare)復(fù)合體(包括胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)和鳥型分枝桿菌(M.avium))、副結(jié)核桿菌(M.paratuberculosis)、母牛分支桿菌(M.vaccae)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、龜分枝桿菌(M.chelonae)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuityum)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)、海魚分枝桿菌(M.Marinum)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、猿分枝桿菌(M.simiane)、嗜血分支桿菌(M.haemophilum)、摩爾分支桿菌(M.malmoense)、石氏分枝桿菌(M.shimoidei)、胃分支桿菌(M.gastri)、地分支桿菌復(fù)合體(M.terrae complex)和無色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)。在特別優(yōu)選實(shí)施方式中該試劑為卡介苗(BCG)，其是M.bovis的減毒株，包括下列菌株83/6235，Pasteur1173P2，Glaxo 1077，Japanese 172，Prague，Russian，Brazilian，Danish 1331，Copenhagen，Connaught，并包括這些菌株的功能等效變體和其它的M.bovis減毒株、克隆體、變異體和重組體，或者天然重組體或者通過多種基因工程技術(shù)產(chǎn)生的重組體，及其抗原成分。
從前面的說明中可以理解，抗原成分是蛋白質(zhì)或肽等的復(fù)合物。
在一種實(shí)施方案中，組合物包含至少兩種選自上述的抗原成分，且可能包括亞單位抗原的多種組合。三種或更多的抗原成分也是可行的。
組合物中抗原成分的濃度可以按照公知的技術(shù)方案變化，只要它的量在給動物使用后能有效地刺激免疫反應(yīng)，特別是在與小腸的淋巴組織相關(guān)的消化道中的免疫反應(yīng)。在分支桿菌的情況下，在1×105到1×1010菌落形成單位(CFU)/ml的范圍內(nèi)是適宜的。優(yōu)選該濃度為1×107～1×109CFU/ml。對于蛋白質(zhì)和肽型抗原，在10-1000μg/g范圍內(nèi)的制劑是適宜的。對于病毒型抗原，1×103-1×1010，優(yōu)選1×105-1×108空斑形成單位(PFU)/ml的范圍是適宜的。免疫反應(yīng)可以是體液或細(xì)胞介導(dǎo)的，包括粘膜免疫反應(yīng)。
因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及一種通過給動物使用本發(fā)明的抗原組合物而刺激動物中粘膜免疫反應(yīng)的方法。
該組合物可以使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)進(jìn)行制備。通常如果需要可將脂質(zhì)制劑加熱至液化，再加入如上所述的抗原成分和其它組分(如果使用)?？乖M合物的分散可以通過混合、振蕩或其它對抗原成分活性沒有不良影響的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明中使用的更優(yōu)選的組合物也基本上沒有包括水在內(nèi)的含水成分。在此使用的術(shù)語“基本上沒有”意指該組合物含有少于10％的含水成分，優(yōu)選少于5％的含水成分。如上所述，含水成分特別是水溶劑的出現(xiàn)降低了脂質(zhì)制劑的保護(hù)效應(yīng)，特別是在腸道中。
在一種實(shí)施方案中，抗原組合物是疫苗。
在一種變化的實(shí)施方案中，抗原組合物是與疫苗一起使用以增強(qiáng)疫苗功效的佐劑。特別優(yōu)選含分支桿菌和含BCG的抗原組合物用作佐劑。
本發(fā)明的抗原組合物也可被用于對第二種或更多的如上所述用作抗原成分的抗原分子產(chǎn)生反應(yīng)，特別是對那些具有弱免疫原性的抗原成分。這可以通過將抗原分子與組合物的抗原成分結(jié)合而使本發(fā)明抗原組合物中的第二種或更多的抗原分子共同給藥來實(shí)現(xiàn)。結(jié)合可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)(9)，特別地，相關(guān)抗原可以與抗原載體或佐劑通過不干擾體內(nèi)抗體生成的連接基團(tuán)結(jié)合?？乖d體或佐劑可以是任何包含上述有機(jī)體的抗原成分，但優(yōu)選是分支桿菌，更優(yōu)選是BCG。適用的連接基團(tuán)包括甘露糖受體結(jié)合蛋白，如卵白蛋白和與Fc受體結(jié)合的蛋白。第二種或更多的抗原分子優(yōu)選為蛋白質(zhì)或肽。特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)是免疫避孕(immunocontraceptive)蛋白質(zhì)。脂質(zhì)再次用作給藥基質(zhì)，在圖12中給出了這種疫苗給藥系統(tǒng)的例子。當(dāng)使用該組合物時，可導(dǎo)致對結(jié)合的分子或共同給藥分子增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的另一方面中還提供了一種使動物免疫的方法，該方法包括對所述的動物使用本發(fā)明的抗原組合物。
在此使用的術(shù)語“動物”指的是溫血動物，特別是哺乳動物。人、狗、貓、鳥、牛、綿羊、鹿、山羊、大鼠、小鼠、兔、負(fù)鼠、獾、豚鼠、鼬、豬和水牛是在該術(shù)語含義范圍內(nèi)的動物的例子。單胃動物和反芻動物特別符合該術(shù)語。
本發(fā)明的組合物可以通過各種不同的途徑使用，包括非腸道(皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi))、粘膜、氣霧劑和口服使用，但不局限于此。在一種實(shí)施方案中，口服使用是優(yōu)選的。組合物可以以藥丸、片劑、膠囊、錠劑或其它適宜劑型的形式使用。由于避免了使用針和注射器，口服用藥被眾多使用者接受，并且對于野生動物來說是經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的接種方法。因此在一種實(shí)施方案中申請人提供了用于口服使用的新型活疫苗。
在變化的實(shí)施方案中，組合物可以被配制成通過注射進(jìn)行的非腸道給藥。這種給藥形式還可以包括與身體組織相容的可注射的和皮下儲存制劑。由儲存制劑導(dǎo)致的延時釋放吸收可以單獨(dú)使用脂質(zhì)制劑或與另外的生物降解聚合物一起使用而獲得。儲存制劑使得抗原成分的持續(xù)釋放以一種更近似于感染過程的方式進(jìn)行，從而促進(jìn)在使用該組合物的動物體內(nèi)免疫反應(yīng)的進(jìn)行。脂質(zhì)保護(hù)效應(yīng)也與這些給藥形式同時發(fā)生。
組合物可以以單劑量使用，特別是對于非腸道使用，或者隨時間以重復(fù)劑量使用，例如，按分段間隔的初始劑量和加強(qiáng)劑量。使用劑量是由抗原成分的釋放率及其抗原性確定的。一般需考慮諸如動物的重量、年齡、性別、同時治療(如果有)等因素，要處理的抗原的特性也可能要顧及。口服疫苗的一般劑量范圍正如上面給出的，即每劑量是1×105到1×1010，優(yōu)選1×107到1×109CFU/千克。對于肽和蛋白質(zhì)型抗原，劑量范圍是1-10,000μg，優(yōu)選為10-1000μg。對于病毒型抗原，劑量范圍是1×103-1×1010，優(yōu)選為1×105-1×108PFU/ml。不管采用哪種給藥方式，當(dāng)在疫苗制劑中使用活的有機(jī)體時，都預(yù)期它們可在宿主體內(nèi)繁殖以促進(jìn)免疫反應(yīng)。
組合物也可以被配制成用于群體接種計(jì)劃的單劑量制劑或多劑量制劑。
直到需要使用前，本發(fā)明的組合物可以在一定的時間內(nèi)儲存在室溫下，或者優(yōu)選儲存在約4℃的普通冷凍條件下。在4℃時，脂質(zhì)制劑有助于處于休眠而不是活躍狀態(tài)的有機(jī)體的儲存和維持而不被破壞。對于非腸道給藥，該組合物被加熱到30-40℃以在使用前液化。對于口服使用，該組合物為固體或膏狀。
應(yīng)該理解，上述說明只是以實(shí)施例的方式進(jìn)行說明，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可預(yù)料到所用材料和技術(shù)兩個方面的變化。
現(xiàn)在提供用以闡明本發(fā)明的非限制性實(shí)施例。
實(shí)施例材料與方法細(xì)菌。M.bovis BCG Pasteur 1173P2(巴斯德研究所，巴黎)用作疫苗菌株。用于巨噬細(xì)胞感染研究和負(fù)鼠免疫性實(shí)驗(yàn)的M.bovis菌株是最初從刷尾(brushtail)負(fù)鼠的結(jié)核性傷口中分離出來并且先前已被用于巨噬細(xì)胞和負(fù)鼠接種研究(1，4)的M.bovis 83/6235(AgResearch，Wallaceville，新西蘭)。對于BCG制劑和巨噬細(xì)胞感染，細(xì)菌在含有補(bǔ)充了白蛋白葡萄糖-過氧化氫酶(ADC；BBL，Becton Dickinson，Maryland，USA)的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(Difco，Detroit，Mich.)的175ml培養(yǎng)瓶(Falcon)中生長到中對數(shù)生長期(mid log phase)。通過離心收集細(xì)菌并在儲存于-70℃之前在磷酸緩沖液(PBS)中清洗兩次。為進(jìn)行負(fù)鼠免疫性實(shí)驗(yàn)，M.bovis在含有補(bǔ)充了0.006％v/v堿性油酸、0.5％w/v白蛋白片段V和0.25％w/v葡萄糖的Dubos肉湯培養(yǎng)基(Difco實(shí)驗(yàn)室，Detroit，USA)的tween白蛋白肉湯(TAB)中生長到中對數(shù)生長期，并且通過混濁度估計(jì)細(xì)菌的數(shù)量。在TAB中進(jìn)行稀釋以對負(fù)鼠接種。BCG或M.bovis的菌落形成位(CFU)的數(shù)目按前面所描述的進(jìn)行測定(5)。
制劑成分。根據(jù)熔化溫度和將BCG保持在均勻的懸浮狀態(tài)的能力選擇三種脂質(zhì)產(chǎn)品以配制BCG。選擇在37℃為液體而在30℃以下變成固體的脂質(zhì)以在BCG活性研究中進(jìn)行測試。在活性測試后，選擇下面的三個制劑在小鼠和負(fù)鼠的口服疫苗試驗(yàn)中進(jìn)行測試
制劑C-來自于動物的分餾復(fù)合物脂質(zhì)；制劑K-由純化的氫化椰子油的甘油三酸酯組成；制劑N-Novarta B，一種商品栓劑基本成分。這三種制劑通過氣相色譜進(jìn)行分析以確定脂肪酸的百分率。
BCG制劑。顆粒狀的BCG被再次懸浮在被加熱到37℃的制劑介質(zhì)中。BCG按1×107CFU/ml的濃度再次懸浮以用作小鼠的疫苗，或者按1×108CFU/ml的濃度再次懸浮以用作負(fù)鼠的疫苗。為增加對負(fù)鼠的吸引力和可口性，每毫升制劑中加入10mg的葡萄糖和10μl的茴香油(Pharmacare，Auckland NZ)。對于小鼠的口服疫苗，每毫升制劑中加入10mg的葡萄糖，1mg的谷氨酸單鈉(Sigma)和10％v/v的ADC。這些添加劑分散于制劑脂質(zhì)中，并先前已證明對BCG的活性沒有影響。BCG制劑被轉(zhuǎn)移到15ml試管(falcon)中并允許在4℃輕輕混合以凝固。從試管中移出制劑并在無菌條件下按照活性測試和接種研究的需要分割成1g的小球。按如下所述的通過將小球在7H11瓊脂板上培養(yǎng)和計(jì)數(shù)CFU以測試BCG的分散。
BCG活性。儲存于4℃或室溫(10-25℃)后按前述(4)測定制劑中的CFU數(shù)目。通過將三個BCG制劑的100mg等分試樣加熱到37℃并持續(xù)15分鐘，并在7H9肉湯中進(jìn)行連續(xù)的10倍稀釋以收集培養(yǎng)的樣品。通過將100μl的每種乳化液接種在補(bǔ)充了油酸-ADC(OADC；BectonDickinson)和0.5％甘油的Middlebrook 7H11瓊脂板上(Difco)來測定活的有機(jī)體數(shù)目。使用玻璃涂布器分散乳化液。用石蠟密封培養(yǎng)板并在5％CO2中37℃孵育。菌落的數(shù)目在培養(yǎng)2-3周后計(jì)數(shù)。結(jié)果以BCG制劑的CFU/μg表示。
小鼠的接種。特定的無病原體雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)從Dunedin的Otago大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)科學(xué)系獲得。小鼠試驗(yàn)經(jīng)Otago大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行(批準(zhǔn)號51/2000)。將小鼠分到單獨(dú)的籠中并在口服接種前斷食12小時。非配制的對照由Craig’s不含防腐劑的草莓醬(Heinz-WattiesLtd.，Hastings，New Zealand)中的M.Bovis組成。先前的研究表明在24小時間隔內(nèi)將M.Bovis BCG混在果醬中對M.Bovis BCG活性沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。非接種的對照只包含脂質(zhì)制劑。對于劑量反應(yīng)和時間過程試驗(yàn)，在24小時的間隔內(nèi)給予小鼠兩次單獨(dú)劑量的疫苗。對于氣霧劑免疫性試驗(yàn)，給予小鼠一次口服劑量(5×107CFU)或者皮下接種1×106CFU。在顆粒和果醬的消耗期間在不同的時間間隔觀察小鼠以確保它們吃了完全劑量。在接種后的不同時間點(diǎn)，通過吸入CO2將小鼠處死，并在無菌條件下摘除脾。
脾細(xì)胞增殖測試。用細(xì)胞過濾器(70μm網(wǎng)孔；Beckton Dickinson)通過過濾細(xì)胞獲得脾細(xì)胞懸浮液。在0.83％的NH4Cl(pH7.2)中溶解紅細(xì)胞。在PBS中清洗細(xì)胞兩次并按1×106/ml再次懸浮在包含10％小牛血清(FCS)、20mM HEPES 100U/ml的青霉素、100μg/ml的鏈霉素、5.5×10-5M的2-巰基乙醇的Dulbeccos’s改良Eagles培養(yǎng)液(DMEM)(DMEM-10％FCS，全部來自Gibco-BRL，USA)中。細(xì)胞在加入10％小牛血清(FCS)的RPMI(Gibco)中按107/ml的濃度再次懸浮。脾細(xì)胞(每孔5×105)被涂布在96孔板(Nunc)的三重孔中。細(xì)胞用最終濃度為60μg/ml的來自M.bovis(bovine PPD；CSL，Melbourne，Australia)的純化蛋白質(zhì)衍生物或僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)。4天后收集細(xì)胞，在用1μCi的[3H]胸腺嘧啶(Amersham，Buckinghamshire，England)脈沖18小時后，如前所述測定混入的胸腺嘧啶(5)。通過將用牛PPD孵育的三重培養(yǎng)物的每分鐘平均計(jì)數(shù)(cpm)除以僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)的脾細(xì)胞的平均cpm獲得刺激指數(shù)(SI)。
脾細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)率的體外測試。按如上所述的脾細(xì)胞增殖測試制備脾細(xì)胞懸浮液。1ml的細(xì)胞懸浮液被分散到24孔培養(yǎng)板(Costar)中，并將100μl的PBS或者牛PPD(60μg/ml的終濃度)加入到孔中。培養(yǎng)物在5％CO2中37℃孵育72小時，之后收集200μl的培養(yǎng)上清液并在70℃冷凍以作細(xì)胞因子分析。按照生產(chǎn)商指示使用商用試劑盒(R&D Systems，Duoset，City，Country)進(jìn)行白介素-2(IL-2)和干擾素-γ(IFN-γ)的捕獲ELISAs。培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子水平通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的外插法確定。兩個ELISAs的最小靈敏度被確定為對于IFN-γ是50pg/ml，對于IL-2是35pg/ml。
M.bovis抑制試驗(yàn)。來自腹膜的巨噬細(xì)胞在與或不與自體同源淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后測試對M.bovis的細(xì)胞內(nèi)生長的抑制。按照前述方案的改良方法進(jìn)行試驗(yàn)。腹膜分泌細(xì)胞(PEC)通過從雌性BALB/c小鼠洗胃獲得。細(xì)胞被收集在補(bǔ)充了1％BSA和20U/ml的肝磷脂的PBS中，清洗一次，并按2×106/ml再次懸浮在含有10％小牛血清和100U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液(經(jīng)補(bǔ)充的DMEM)中。100μl的細(xì)胞懸浮液被分散到96孔平板(Nunc)中。在5％CO2中37℃孵育2小時后除去不貼壁的細(xì)胞，清洗并按5×106/ml的密度再次懸浮在經(jīng)補(bǔ)充的DMEM中。通過在25ml培養(yǎng)瓶(falcon)中孵育而在其余的貼壁細(xì)胞群中選擇性耗竭不貼壁的細(xì)胞。不貼壁的PEC(NPEC)在May-GrunwaldlGiemsa染色后被確定包含＞90％的淋巴細(xì)胞。熱的經(jīng)補(bǔ)充的DMEM被加入估計(jì)包含5×104細(xì)胞/孔的貼壁單層中。該細(xì)胞群對非特異性酯酶染色試劑(目錄號181-B；Sigma，St.Louis，Mo，USA)具有98％的陽性，此后稱作巨噬細(xì)胞。如前所述(2)用M.bovis以2個細(xì)菌/巨噬細(xì)胞的MOI感染巨噬細(xì)胞。非吞噬的細(xì)菌通過溫和清洗除去。100μl(包含5×105細(xì)胞)的自體同源NPEC加入到包含感染的巨噬細(xì)胞的各孔中，且在5％CO2中37℃下再次孵育培養(yǎng)物。選擇得到的NPEC對巨噬細(xì)胞的比為10∶1的比率以模擬在外周血單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的比率。對照孔由單獨(dú)的M.bovis感染的巨噬細(xì)胞或非感染的NPEC和巨噬細(xì)胞組成。72小時后，用1.0μCi[3H]尿嘧啶脈沖18小時。用0.1％皂甙溶解細(xì)胞，且在用自動細(xì)胞收集器(Cambridge Technology，USA)將細(xì)胞收集到玻璃纖維過濾器(Whatman Inc，F(xiàn)inland)上之前在80-90℃加熱20分鐘殺死細(xì)菌?；烊氲腫3H]尿嘧啶的量用液體β型閃爍計(jì)數(shù)儀(Wallac，Country)確定。
用M.bovis對小鼠進(jìn)行氣霧劑免疫性實(shí)驗(yàn)。每個疫苗組6只小鼠，在接種第8周用劇毒的M.bovis氣霧劑進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)，用Grover等在1967年公開的改良方法制備M.bovis 83/6235的單獨(dú)細(xì)胞懸浮液并儲存在-70℃。為制備這些懸浮液，細(xì)菌細(xì)胞通過聲處理分散30秒，并通過8μm薄膜過濾器過濾。小鼠使用氣霧劑室通過呼吸途徑感染，氣霧劑室可產(chǎn)生大小適合于進(jìn)入肺泡空間的微滴核。霧狀液體中活的M.bovis的濃度按經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)以使每個小鼠的肺吸入并保持5-20個活的有機(jī)體(B.Buddleand G.de Lisle，未公布資料)。相似的過程已證明得到對豚鼠肺的可重復(fù)均勻的感染。氣霧劑感染和隨后的保持及感染小鼠的處理是在生物危害性設(shè)備的嚴(yán)格隔離條件下進(jìn)行的。
M.bovis的分離。在進(jìn)行氣霧劑免疫性實(shí)驗(yàn)后的37-40天處死小鼠。為分離分支桿菌每個小鼠的肺和脾被單獨(dú)地處理。器官在Ten-Broeck研磨器中勻漿化，且樣品在3500g離心20分鐘。沉淀物再次懸浮在1ml的蒸餾水中，在TAB中制得適量的稀釋液，且0.1ml稀釋或未稀釋的樣品被接種在改良的分支桿菌7H11瓊脂上(1)。對各稀釋液重復(fù)制備兩個。培養(yǎng)條件和分離物的鑒別方法按如前所述的進(jìn)行(1)。
數(shù)據(jù)的分析。平均細(xì)胞因子水平的差異和對疫苗組的脾細(xì)胞增殖反應(yīng)轉(zhuǎn)化成log10的統(tǒng)計(jì)分析使用Student t檢驗(yàn)確定。從肺和脾的細(xì)菌計(jì)數(shù)被轉(zhuǎn)化成log10并用方差分析進(jìn)行分析。為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)沒有從組織中培養(yǎng)細(xì)菌時，采用最小可檢測數(shù)的一半(％CFU/器官)。
負(fù)鼠的接種和免疫性實(shí)驗(yàn)。如前所述捕捉負(fù)鼠并籠養(yǎng)(4)。用BCG喂飼兩組負(fù)鼠(5只/組)。1g的顆粒狀配制的BCG(1×108CPU)被給予一組中的每個負(fù)鼠，第二組被給予果醬中的BCG(1×108CPU)以與配制過程中的對照。預(yù)先證明果醬不抑制BCG活性(數(shù)據(jù)未顯示)。第三組(6只/組)被給予只包含制劑介質(zhì)的顆粒并作為非接種的對照。在顆粒消耗期間觀察負(fù)鼠以確認(rèn)吃入全部顆粒。第二天重復(fù)接種(總BCG劑量2×108CFU/負(fù)鼠)。所有負(fù)鼠在接種后41天通過氣霧劑途徑進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)。
在第二個試驗(yàn)中，四種口服脂質(zhì)BCG制劑與皮下接種比較。每個疫苗組的6只負(fù)鼠在接種8周后通過用劇毒的M.bovis通過氣霧劑進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)。脂質(zhì)C，K，N和F(包含10％小牛血清的一種改良的K)。
用M.bovis對負(fù)鼠進(jìn)行氣霧劑免疫性實(shí)驗(yàn)。負(fù)鼠用M.bovis 83/6235進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)，其最初是從Taumaranui，New Zealand負(fù)鼠的淋巴結(jié)分離的(5)。分離物的單獨(dú)的細(xì)胞懸浮液使用Grover等在1967所公開的改良方法制備并儲存在-70℃。為制備這些懸浮液，細(xì)菌細(xì)胞通過聲處理分散30秒，并通過8μm薄膜過濾器過濾。通過肌肉注射鹽酸氯胺酮(30mg/kg；Parnell Laboratories，Auckland，New Zealand)麻醉負(fù)鼠，使用氣霧劑室通過呼吸途徑感染，氣霧劑室可產(chǎn)生大小適合于進(jìn)入肺泡空間的微滴核。霧狀液體中活的M.bovis的濃度按經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)以使每個負(fù)鼠的肺吸入并保持10-20個活的有機(jī)體(B.Buddle and G.de Lisle，未公布)。這種免疫性實(shí)驗(yàn)的劑量已預(yù)先從在感染后4周的非接種負(fù)鼠的肺中可大致觀察到的初期結(jié)節(jié)的數(shù)目估測。相似的過程已證明得到對豚鼠肺的可重復(fù)均勻的感染(Wiegeshaus et al.，1970；Smith et al.，1970)。氣霧劑感染和隨后的保持及感染小鼠的處理是在生物危害性設(shè)備的嚴(yán)格隔離條件下進(jìn)行的。
負(fù)鼠的尸檢。所有負(fù)鼠在進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)后的56～57天處死，并進(jìn)行廣泛的總尸檢。肺與周圍組織分離并稱重。
從負(fù)鼠組織分離M.bovis。對于每個動物，肺和脾的樣品各稱取約1g，樣品從肉眼可見的損傷處獲取，如果沒有損傷，樣品從器官的預(yù)定部分獲取，并為分離分支桿菌而進(jìn)行單獨(dú)處理。稱重樣品，在Ten-Broeck研磨器中勻漿并在0.75％的氯化十六烷基吡啶鎓中凈化1小時。樣品在3500g離心20分鐘，且沉淀物再次懸浮在1ml的蒸餾水中。在TAB中制得適量的稀釋液，且0.1ml稀釋或未稀釋的樣品被接種在改性的分支桿菌7H11瓊脂板上。對各稀釋液重復(fù)制備兩個。培養(yǎng)條件和分離物的鑒別方法按如前所述的進(jìn)行(1)。
負(fù)鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。用排除了紅血細(xì)胞的全血測定對PPD-B和PPD-A(CSL Limited，Parkville，Australia)的增殖反應(yīng)。對Con A的反應(yīng)也被測試。簡言之，1ml的肝素化血與pH 7.2的50ml 0.17MTris-0.16M NH4Cl在37℃混合10分鐘，在20℃的PBS中清洗兩次，并在補(bǔ)充了2mM谷酰胺和2％正常負(fù)鼠血清的DMEM組織培養(yǎng)基中調(diào)到3ml。細(xì)胞(200μl)被涂布在于PBS中含有50μl PPD-B、PPD-A或Con A或單獨(dú)PBS的平底96孔板中，以得到60μg/ml PPD或5μg/ml Con A的終濃度。平板被放在5％CO2的空氣孵育器中72小時，用1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶(Amersham，UK)脈沖，再18小時后收集，并在Micro BetaTrilux(Wallac，F(xiàn)inland)中進(jìn)行3H計(jì)數(shù)。通過將用PPD刺激的三重培養(yǎng)物的每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)除以用培養(yǎng)基和PBS培養(yǎng)的三重培養(yǎng)物的cpm計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。
數(shù)據(jù)的分析。小鼠細(xì)胞因子分泌物的統(tǒng)計(jì)顯著差異使用Student t檢驗(yàn)確定(GraphPad，San Diego，Calif.)。將這些研究進(jìn)行兩次而具有相似的結(jié)果。對于負(fù)鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，＞3.5的刺激指數(shù)被記為陽性反應(yīng)，因?yàn)檫@表示在背景平均值(接種之前PPD-B的平均SI)之上的至少三個標(biāo)準(zhǔn)差的反應(yīng)。不同處理組負(fù)鼠的體重改變、肺重量、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)菌計(jì)數(shù)通過單次方差分析進(jìn)行初始比較。然后用Duncan’s多重檢驗(yàn)比較各組的平均值。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和從肺和脾得到的細(xì)菌計(jì)數(shù)在分析之前轉(zhuǎn)化成Log10。為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，當(dāng)沒有從組織中培養(yǎng)細(xì)菌時，采用最小可檢測數(shù)的一半(％CFU/器官)。
結(jié)果A.脂質(zhì)制劑的脂肪酸成分。選擇用于配制口服BCG的脂質(zhì)進(jìn)行氣相色譜分析。圖1顯示了在小鼠和負(fù)鼠接種試驗(yàn)中使用的3種脂質(zhì)的脂肪酸成分。
在三種脂質(zhì)制劑中脂肪酸的相對百分比如圖1所示。通過HPLC對脂質(zhì)的化學(xué)分析表明三種制劑包含下述的脂肪酸混合物制劑C89％總脂質(zhì)(48.5％中性，40.5％極性-包括3％肉豆蔻酸，26％棕櫚酸，15％硬脂酸，40％油酸和6％亞油酸)。
制劑K47％月桂酸，20％肉豆蔻酸，12％棕櫚酸，12％硬脂酸和3％油酸。
制劑NNovarta B是一種商用栓劑基本成分，由酯化、氫化的分餾植物油和甘油三酸酯的混合物組成，包括44％月桂酸，20％肉豆蔻酸，16％棕櫚酸，19％硬脂酸。
B.配制后的BCG活性。配制的BCG在儲存于4℃后的活性如圖2a所示。在16周后，制劑C和K保持高水平的BCG活性，其中制劑C與制劑K(52％)相比顯示較高的活性維持率(98％)。相比而言，制劑N顯示BCG活性逐漸喪失，導(dǎo)致16周后超過97％的活的有機(jī)體損失。這些結(jié)果表明與制劑N相比，制劑C和K更適于在4℃保持BCG活性。
配制的BCG在儲存于室溫(10-25℃)后的活性如圖2b所示。制劑C和K保持高水平的BCG活性，其中在40天時的制劑C與在22天時的制劑K(平均log10CFU/ug＝10)相比顯示持久的活性維持率(平均log10CFU/ug＝10)。相比而言，在12天時的制劑N顯示BCG活性快速地?fù)p失(平均log10CFU/ug＝10)。這些結(jié)果表明與制劑N相比，制劑C和K更適于在室溫下保持BCG活性。
C.小鼠中配制的BCG的免疫原性。
在小鼠中口服配制的M.bovis BCG誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。為了確定口服M.bovis BCG后測量系統(tǒng)免疫反應(yīng)的適合方法，我們比較了口服107CFU脂質(zhì)制劑的M.bovis BCG或果醬中的M.bovis BCG(非配制的M.bovis BCG)后第8周牛PPD誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖(LTA)，及脾的IL-2和INF-γ反應(yīng)。表1表明盡管LTA和INF-γ測試顯示在配制和非配制的口服M.bovis BCG組之間具有顯著差異，但I(xiàn)L-2測試的差異不顯著。由于INF-γ在對抗肺結(jié)核中的重要性，INF-γ測試被用于進(jìn)一步的試驗(yàn)中以監(jiān)測系統(tǒng)免疫反應(yīng)。
為確定口服后M.bovis BCG劑量的效果，我們比較了用不同劑量的配制或非配制的M.bovis BCG接種后小鼠8周內(nèi)對牛PPD的脾INF-γ反應(yīng)。圖2表明在用106CFU的M.bovis BCG口服免疫后在配制組中檢測到低水平的INF-γ(＜200pg/ml)，但在疫苗組之間沒有顯著差異。當(dāng)劑量增加到107CFU時，非配制組的INF-γ反應(yīng)保持低水平，而對配制的M.bovisBCG的反應(yīng)顯著增加(P＜0.05)。在使用108CFU的M.bovis BCG時也可看到類似的差異。當(dāng)疫苗劑量增加到BCG為109CFU時，在非配制組也可看到INF-γ水平的增加，同時配制組保持高水平。在M.bovis BCG劑量為107-109CFU時，在配制的M.bovis BCG組中INF-γ反應(yīng)顯著大于非配制的M.bovis BCG組。在高劑量非配制組中看到的INF-γ反應(yīng)的增加表明為獲得免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，與配制的M.bovis BCG相比，需要相當(dāng)高口服劑量的M.bovis BCG。為確定口服M.bovis BCG的免疫反應(yīng)時間過程，我們比較了在口服或皮下接種M.bovis BCG后按2周時間的間隔脾的INF-γ反應(yīng)。圖3顯示INF-γ反應(yīng)在皮下接種后第4周達(dá)峰值，并在第6和8周逐漸降低。相反，INF-γ反應(yīng)在口服接種配制的M.bovis BCG后第6周開始增加，并在接種后第8周保持高水平。對非配制的M.bovis BCG或僅含制劑材料的INF-γ反應(yīng)在2-8周之間保持低水平。這些結(jié)果表明口服接種配制的M.bovis BCG后與皮下接種相比免疫反應(yīng)被延遲，但至少持續(xù)8周。
來自用配制的M.bovis口服接種的小鼠腹膜的淋巴細(xì)胞抑制自體同源巨噬細(xì)胞中M.bovis的生長。NPEC加入到來自用M.bovis BCG制劑口服接種的小鼠的M.bovis感染的巨噬細(xì)胞中以確定是否淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)器可以抑制M.bovis的細(xì)胞內(nèi)生長。巨噬細(xì)胞內(nèi)M.bvis的生長通過[3H]尿嘧啶攝入確定。僅在巨噬細(xì)胞內(nèi)或與來自口服接種小鼠的NPEC共培養(yǎng)時M.bovis的生長如圖4所示。從用配制或非配制的M.bovis BCG口服接種的小鼠或只給予制劑材料的小鼠得來的巨噬細(xì)胞它們在控制M.bovis生長的能力上沒有差異。當(dāng)來自用配制的M.bovis BCG接種的小鼠的NPEC與自體同源的M.bovis感染的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時，與來自用非配制的M.bovis BCG或僅用制劑材料接種的小鼠的NPEC共培養(yǎng)相比，[3H]尿嘧啶計(jì)數(shù)顯著降低(P＜0.05)。這些結(jié)果證實(shí)來自用配制的M.bovisBCG口服接種的小鼠的淋巴細(xì)胞可激活巨噬細(xì)胞以抑制M.bovis的細(xì)胞內(nèi)生長。體外M.bovis細(xì)胞內(nèi)生長的對照能夠反映體內(nèi)可導(dǎo)致宿主內(nèi)M.bovis的散布降低的生長抑制。
口服接種配制的M.bovis BCG可防止劇毒M.bovis的氣霧劑感染。為確定配制的口服M.bovis BCG的保護(hù)功效，對小鼠口服接種5×107CFU的配制的M.bovis BCG或皮下接種1×106CFU的M.bovis BCG。非接種小鼠作為對照。在接種后第8周通過氣霧劑途徑對小鼠用劇毒M.bovis進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)，并在進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)后37-40天處死。表2表明皮下M.bovis BCG接種可降低肺細(xì)胞計(jì)數(shù)約2.34個log，降低脾細(xì)菌計(jì)數(shù)約1.90個log。相比而言，配制的口服M.bovis BCG降低肺細(xì)菌計(jì)數(shù)約1.0個log，降低脾細(xì)菌計(jì)數(shù)約1.48個log。表2中的結(jié)果表明口服配制的M.bovis BCG和皮下使用M.bovis BCG對劇毒M.bovis的氣霧劑感染可產(chǎn)生有效保護(hù)，盡管皮下使用M.bovis BCG在肺中的保護(hù)功效大于口服配制的M.bovis BCG組。
D.負(fù)鼠的免疫反應(yīng)和病理學(xué)。
淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)?？诜臃N配制的BCG對全血淋巴細(xì)胞對牛PPD增殖反應(yīng)的效果如圖5和表3所示。在接種后第6周，配制的BCG組對PPD-B的平均刺激指數(shù)(SIs)明顯高于非配制的BCG組和非接種對照組(P＜0.05)。在用M.bovis進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)后第4周，所有組對PPD-B的平均SI均＞20。這些結(jié)果顯示，與非配制的BCG相比口服使用配制的BCG在負(fù)鼠中引發(fā)強(qiáng)烈的對PPD-B的免疫反應(yīng)。
進(jìn)一步的試驗(yàn)比較了四種口服脂質(zhì)BCG制劑和皮下接種的免疫反應(yīng)(圖11)。皮下接種的負(fù)鼠顯示出強(qiáng)烈的LTA反應(yīng)，在接種后第4周達(dá)峰值(平均SI為42.5)，并到第8周逐漸降低到SI＝30。相比而言，脂質(zhì)N配制的口服BCG在8周的接種期內(nèi)不能引發(fā)LTA反應(yīng)，在脂質(zhì)C、K和F中配制的口服BCG在接種后第4周誘導(dǎo)LTA反應(yīng)較弱(SI＝1-7)，但逐步增加并維持到接種后第8周(SI＝15-22)。這些結(jié)果顯示，與皮下接種相比，口服接種的系統(tǒng)免疫反應(yīng)被延遲，但它們持續(xù)更久。制劑N不誘導(dǎo)在非接種負(fù)鼠上看到的LTA反應(yīng)，也不防止M.bovis的氣霧劑感染(見表4)，這表明用于配制的口服BCG的脂質(zhì)類型對于防止肺結(jié)核是重要的。
臨床結(jié)果。在免疫性實(shí)驗(yàn)和尸檢之間不同組體重變化如圖6所示。用配制的BCG接種的負(fù)鼠平均體重在免疫性實(shí)驗(yàn)和尸檢之間增加0.02kg。相比而言，非配制的BCG和非接種對照組的平均體重在此期間分別降低0.35kg和0.23kg。但是這些差異不具有統(tǒng)計(jì)顯著性。
在進(jìn)一步的試驗(yàn)中(表4)，比較了四種口服脂質(zhì)BCG制劑和皮下接種，與非接種組(0.147kg)相比，在免疫性實(shí)驗(yàn)和尸檢之間的平均體重變化對于皮下接種組(平均體重降低0.012kg)和口服脂質(zhì)BCG組之一(F組)(0.035kg)而言明顯降低。相比而言，其它的口服BCG組平均體重降低0.060kg(脂質(zhì)C)、0.067kg(脂質(zhì)K)及0.122kg(脂質(zhì)N)。對接種未顯示免疫反應(yīng)的負(fù)鼠(即非接種和脂質(zhì)N組)與有反應(yīng)的各組相比顯示較大的體重下降。
病理學(xué)。在所有的免疫性實(shí)驗(yàn)動物的肺中觀察到肉眼可見的損傷。結(jié)核型肺炎的程度可以通過肺重量估測(圖7)。較高的肺重量與廣泛的結(jié)核型肺炎相聯(lián)系(3)(4)。為標(biāo)準(zhǔn)化肺重量隨體重變化的差異，將各動物的肺重量與體重相比，并表示為比率。用配制的BCG接種的動物的平均肺重量與體重的比率是1.62。相比而言，非配制的BCG和非接種對照組的平均肺重量與體重的比率分別是2.86和3.0。用配制的BCG接種負(fù)鼠的肺重量與體重的比率明顯與非配制的BCG組和非接種對照組不同(P＜0.05)。通常，肺損傷是小的結(jié)合區(qū)或與在損傷中間的黃色壞死區(qū)結(jié)合的肺葉。腫脹的支氣管淋巴結(jié)可在具有極大肺損傷的動物中觀察到。
步驟420.在對外接口板10上，基于該預(yù)分類表實(shí)現(xiàn)DSCP預(yù)標(biāo)識，實(shí)現(xiàn)優(yōu)先級調(diào)度，從而根據(jù)預(yù)分類DSCP的編碼結(jié)果實(shí)現(xiàn)流控分類處理，實(shí)現(xiàn)向用戶面處理板30的轉(zhuǎn)發(fā)。
步驟430.用戶面處理板30上根據(jù)TFT做DSCP標(biāo)識，基于新的標(biāo)識實(shí)現(xiàn)優(yōu)先級調(diào)度在用戶面處理板30上根據(jù)TFT的分類表實(shí)現(xiàn)基于用戶簽約信息的分類，根據(jù)該分類實(shí)現(xiàn)從用戶面處理板30到對外接口板20的流控分類轉(zhuǎn)發(fā)。
步驟440.在對外接口板20上基于處理板30上的標(biāo)識實(shí)現(xiàn)優(yōu)先級調(diào)度對外接口板20將保留該分類信息在對外IP頭信息的DSCP字段。實(shí)現(xiàn)向SGSN的發(fā)送。
步驟450.SGSN和RNC上依然基于該DSCP標(biāo)識實(shí)現(xiàn)優(yōu)先級調(diào)度如附圖2所示，該用戶下行數(shù)據(jù)包將被依次發(fā)送到SGSN和RNC，在此期間，其流控分類將以在圖1所示的用戶面處理板30上的分類為準(zhǔn)。其后，從RNC(無線網(wǎng)絡(luò)控制器)到UE(用戶設(shè)備)的發(fā)送將采用無線側(cè)的分類標(biāo)識實(shí)現(xiàn)流控功能。
這里需要指出的是，本發(fā)明雖然以WCDMA的下行數(shù)據(jù)分類為例，本發(fā)明所涉及的預(yù)分類方式，同樣適用于其他第三代移動通訊技術(shù)在邊界網(wǎng)關(guān)上的上下行數(shù)據(jù)流預(yù)分類。
表3.口服疫苗后的淋巴細(xì)胞增殖分析中對牛PPD發(fā)生響應(yīng)的負(fù)鼠的數(shù)目

*刺激指數(shù)＞3.5的動物的數(shù)目表4.用M.bovis進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)的接種負(fù)鼠的病理學(xué)和微生物學(xué)結(jié)果

體重/免疫性實(shí)驗(yàn)體重的變化脂質(zhì)F，BCG＜非接種(P＜0.05)。
脾細(xì)菌計(jì)數(shù)脂質(zhì)C，脂質(zhì)K，脂質(zhì)F，BCG＜非接種；脂質(zhì)F＜脂質(zhì)N(P＜0.05)。
a在處死后和免疫性實(shí)驗(yàn)之間的體重(kg)/免疫性實(shí)驗(yàn)時體重(kg)的變化。
b肺重量(g)/處死后體重(kg)。
c細(xì)菌計(jì)數(shù)，CFU log10/g組織。
*對非接種組的顯著性差異。
工業(yè)實(shí)用性抗原組合物包括使抗原保持在穩(wěn)定基質(zhì)中的脂質(zhì)制劑，由此它們被均勻地分散。這有助于抗原給藥劑量一致，避免了劑量過大和無效的低劑量。申請人還表明脂質(zhì)制劑可提高其中所含有的活的有機(jī)體的儲存和活性。脂質(zhì)制劑還可防止抗原和活的有機(jī)體被胃酸和酶降解。在以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的制劑中有機(jī)體活性損失也明顯低于報道的凍干產(chǎn)品中的有機(jī)體活性損失。由于制劑的疏水特性，也可以將制劑儲存在濕潤或潮濕的條件下而不發(fā)生變質(zhì)。
已證實(shí)疫苗制劑中的有機(jī)體特別是細(xì)菌的活性對于誘導(dǎo)強(qiáng)的和持久的保護(hù)性免疫是重要的。這可以使用本發(fā)明的組合物達(dá)到。該組合物制備也簡單，更方便于生產(chǎn)，且可以避免使用針和注射器從而提高了使用者的接受率和安全性。
本發(fā)明的組合物可以用各種不同的途徑使用，包括皮下注射，但是特別適于口服使用。申請人發(fā)現(xiàn)，組合物中的脂質(zhì)制劑可以防止有機(jī)體和它們的組成抗原的活性在胃中下降，這使得活的有機(jī)體能夠通過處理的胃腸粘膜吸收，復(fù)制并顯示給免疫系統(tǒng)。此外，申請人確定使用的劑量在低于先前預(yù)計(jì)的口服劑量時是有效的(8)。
野生動物如負(fù)鼠的免疫需要抗原通過粘膜途徑給藥，因此食餌疫苗是實(shí)用和節(jié)省成本的給藥選擇。人的口服疫苗也是一種更節(jié)省成本的免疫方法，且更易于為使用者接受。
當(dāng)以其它途徑如皮下使用時，脂質(zhì)制劑仍可防止受到例如巨噬細(xì)胞的攻擊。在皮下使用或注射使用時，儲存脂類的制劑也可持續(xù)釋放以模仿感染過程，并促進(jìn)免疫反應(yīng)的進(jìn)行。
可以理解，本發(fā)明的組合物與許多高成本的、可注射的疫苗制劑相比具有實(shí)質(zhì)性的優(yōu)點(diǎn)。
該組合物對于誘導(dǎo)對多種感染性有機(jī)體的免疫反應(yīng)是有效的，感染性有機(jī)體包括胃腸道和呼吸道病原體，優(yōu)選為肺結(jié)核菌。
本發(fā)明的組合物還可以被用作多種抗原、或者抗原分子的共同給藥或聯(lián)合給藥的疫苗給藥系統(tǒng)，特別是用作那些由于劑量或抗原性的原因而具有弱免疫原性的抗原的疫苗給藥系統(tǒng)。本發(fā)明的組合物也適于作為疫苗佐劑。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員更應(yīng)該理解，本說明僅是示例性的，本發(fā)明的范圍不局限于此。
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權(quán)利要求
1.一種抗原組合物，其包含脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分，所述抗原成分包含活的有機(jī)體。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑是固體形式。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑在10℃或以上時為固體形式。
4.一種抗原組合物，其包含在10℃或以上時為固體形式的脂質(zhì)制劑和至少一種抗原成分。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述的抗原成分是蛋白質(zhì)、糖蛋白質(zhì)、肽、或者具有蛋白質(zhì)或肽成分的因子或其混合物。
6.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述的抗原成分包含活的有機(jī)體。
7.如權(quán)利要求1至3或6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的活的有機(jī)體選自真菌、原生動物、細(xì)菌和病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述的病毒是HIV或SIV。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的細(xì)菌選自布魯氏菌、炭疽和分支桿菌。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述的細(xì)菌是分支桿菌。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述的分支桿菌選自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌及田鼠分枝桿菌)、胞內(nèi)鳥型分枝桿菌復(fù)合體(包括胞內(nèi)分枝桿菌和鳥型分枝桿菌)、副結(jié)核桿菌、母牛分支桿菌、恥垢分枝桿菌、龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、海魚分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、猿分枝桿菌、嗜血分支桿菌、摩爾分支桿菌、石氏分枝桿菌、胃分支桿菌、地分支桿菌復(fù)合體和無色分枝桿菌，包括這些菌株的功能等效變體、天然或基因工程產(chǎn)生的克隆體、變異體和重組體及其抗原成分。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述的分支桿菌是M.bovis。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述的M.bovis是卡介苗(BCG)。
14.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的組合物，其包含至少兩種抗原成分。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中一種抗原成分是活的有機(jī)體，一種抗原成分是蛋白質(zhì)或肽。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述的活的有機(jī)體是分支桿菌。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述的分支桿菌是M.bovis。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述的M.bovis是BCG。
19.如權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是免疫避孕蛋白質(zhì)。
20.如權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)或肽是弱免疫原性的。
21.如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑在約10℃～30℃下為固體形式。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑在約20℃～30℃下為固體形式。
23.如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑在約30℃到37℃之間發(fā)生從固體到液體的轉(zhuǎn)變。
24.如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑包含40％-100％，優(yōu)選為60％-100％，優(yōu)選為80％-100％，更優(yōu)選為90％-100％的C16和/或C18脂肪酸。
25.如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑包含10％-40％，優(yōu)選為20％-35％，更優(yōu)選為25％-32％的C16脂肪酸；及40％-90％，優(yōu)選為50％-80％，更優(yōu)選為60％-70％的C18脂肪酸。
26.如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑包含少于35％，優(yōu)選少于25％，更優(yōu)選少于10％的C14或更短的脂肪酸。
27.如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑包含少于5％的C14或更短的脂肪酸、25％-32％的C16脂肪酸及60％-70％的C18脂肪酸。
28.如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑包含20％-60％的飽和脂肪酸；25％-60％的單不飽和脂肪酸；及0.5％-15％的多不飽和脂肪酸。
29.如權(quán)利要求28所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑包含30％-55％的飽和脂肪酸；30％-60％的單不飽和脂肪酸；及3％-11％的多不飽和脂肪酸。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑包含40％-50％的飽和脂肪酸；40％-55％的單不飽和脂肪酸；及5％-9％的多不飽和脂肪酸。
31.如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的脂質(zhì)制劑具有如下的配方3％的肉豆蔻酸；26％的棕櫚酸；15％的硬脂酸；40％的油酸；及6％的亞油酸。
32.如權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的組合物，其基本上沒有含水成分。
33.如權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的組合物，其被配制成非腸道使用。
34.如權(quán)利要求32所述的組合物，其被配制成皮下使用。
35.如權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的組合物，其被配制成口服使用。
36.如權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物是疫苗。
37.如權(quán)利要求1至35中任一項(xiàng)所述的組合物，所述的組合物是疫苗佐劑。
38.一種使動物免疫的方法，所述方法包括對所述的動物使用如權(quán)利要求1至37中任一項(xiàng)所述的組合物。
39.一種刺激動物中粘膜免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括對所述的動物使用如權(quán)利要求1至37中任一項(xiàng)所述的組合物。
40.如權(quán)利要求38或39所述的方法，其中所述的使用方式是口服使用。
41.如權(quán)利要求38或39所述的方法，其中所述的使用方式是皮下使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗原組合物及使用該抗原組合物使動物免疫的方法。該抗原組合物包含通常情況下為固體形式的脂質(zhì)制劑及至少一種抗原成分。優(yōu)選的抗原成分為活的有機(jī)體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中該組合物被配制成口服使用。
文檔編號A61P31/04GK1561230SQ02817408
公開日2005年1月5日 申請日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者弗蘭克·歐內(nèi)斯特·阿爾德威爾, 布賴斯·馬爾科姆·巴都, 伊恩·喬治·塔克 申請人:奧塔戈創(chuàng)新公司, 動物健康委員會公司, 阿戈里索契有限公司